火灾作为干扰森林生态系统最大因素之一，会很大程度影响土壤的结构和功能，同时对林地植物的分布以及植物群落的构成发挥着重要的作用。但是火灾影响的强弱通常因火灾的类型和强度不同表现出巨大差异，有研究表明中度和重度的火灾会严重破坏林地的植被^[1]，从而导致森林生态系统失衡，而轻度的火灾会在一定的程度上去促进林下更新以及土壤养分的循环^[2]。随着全球变暖的逐渐加剧，森林火灾的发生频率也在持续增加。

据统计，全球每年发生火灾次数约为22万次，其中火灾摧毁的森林面积累计达数百万公顷^[3]。森林在发生火灾时会产生较高的温度，这会直接影响到土壤中的微生物群落，同时也会使林地的其他环境因子发生变化从而间接影响到微生物群落的生存与发展。微生物作为森林生态系统中最为重要的组分之一，其在生态系统中的碳氮循环、有机质分解以及营养物质转换中发挥着重要的作用^[4]。在火烧强度方面，Knelman等^[5]研究发现随着火烧强度的增加，土壤的微生物量、酶活性以及微生物群落多样性会逐渐降低。土壤酶主要来源于土壤中的动物以及土壤微生物的分泌物，土壤酶在土壤养分循环中发挥着重要的作用，土壤酶活性在火灾后，早期的生态恢复的过程中也可以作为敏感性指标^[6]。重庆缙云山地处三峡库区尾端，属于亚热带森林生态系统，林分易燃性较强，为亚热带林区最易受火灾损害的森林类型。研究森林火灾发生后短期内土壤微生物的变化特征对人工促进自然演替具有重要意义，同时也有助于预测环境变化后森林群落演替方向。

笔者以2022年8月末重庆缙云山火烧迹地中的以马尾松(Pinus massohiana)为主的针阔混交林和竹林为研究对象，在火灾发生后1个月内，采集不同火烧强度下不同深度的土壤样品，通过测定土壤细菌多样性以及土壤酶活性，分析不同火烧强度对土壤细菌门和属在物种组成、相对丰度以及群落聚集的影响，评估土壤微生物群落结构及其多样性对不同火烧程度的响应特征。

研究区位于重庆市北碚区缙云山国家级自然保护区(E 106°17′~106°24′、N 29°41′~29°52′)，该保护区的整体面积约7 600 hm²，海拔200~952 m，该地区具有亚热带季风湿润性气候特征，年平均气温13.6 ℃，最高温度36.2 ℃，最低温度-4.6 ℃；年平均降水量1 611.8 mm，最高年降水量1 783.8 mm。植被类型以常绿阔叶林、针阔混交林、暖性针叶林、竹林为主。

以2022年8月发生火烧的针阔混交林和竹林作为研究对象，并在毗邻选择未火烧的针阔混交林与竹林作为对照，样地的海拔为678~882 m，坡度11°~27°，样地中优势种为马尾松，最大胸径27.32 cm，最大树高12.81 m。在缙云山的薄巴山、八角池和虎头山3个地点的火烧迹地上分别选择轻度、中度和重度3种不同火烧强度的针阔混交林和竹林地段，以及相邻未过火的针阔混交林和竹林作为对照地(CK)，每个地点分别设置8个20 m×20 m的标准样地，共设置24块样地。火烧强度划分如表 1所示。

表 1(Tab. 1)

表 1 林火迹地火烧强度划分 Tab. 1 Classification of fire intensities in forest fire sites 火烧强度 Fire intensity 划分标准 Classification criteria 重度 Severe (S) 树木平均熏黑高度与树高的比值＞2/3, 林木死亡率>70%。The ratio of average blackened height of trees to tree height was greater than 2/3, and the mortality rate of trees >70% 中度 Moderate (M) 树木平均熏黑高度与树高比值在1/3~2/3之间，林木死亡率在30%~70%。The ratio of average blackened height to tree height was between 1/3-2/3, and the mortality rate of trees was 30%-70% 轻度 Light (L) 树木平均熏黑高度与树高的比值＜1/3, 林木死亡率 < 30%。The ratio of the average blackened height of trees to tree height was less than 1/3, and the mortality rate of trees was < 30%

表 1 林火迹地火烧强度划分 Tab. 1 Classification of fire intensities in forest fire sites

本次采样于2022年9月13日进行，在土样采集过程中，首先用铲子将地表的灰烬和杂物清除，然后采用5点取样法分别采集0~10和10~20 cm深度的土壤，同一土层的5个样点混匀作为1份土样，共计48份土样。将土样采集完成后放入保温箱中，带入实验室中，去除土壤中的杂质后，放入-20 ℃的冰箱内保存，防止土壤细菌DNA降解^[7]，一部分的土样用于土壤微生物的测定，另一部分自然风干后过筛用于土壤酶活性的测定。

细菌多样性的测定主要采用16S扩增子测序分析^[7]，称取1.0 g土壤样品用于土壤总DNA提取，采用CTAB对样本的基因组DNA进行提取，之后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL用作基因组DNA模板。使用NEB NextⓇ Ultra DNA Library Prep Kit建库试剂盒进行文库构建，将构建好的文库使用安捷伦5400进行检测和Q-PCR定量；待文库合格后，使用NovaSeq 6000进行上机测序。Chao1指数表示细菌丰富度；Faith_PD和Shannon指数表示细菌多样性。

土壤酶活性测定^[8]：称取自然风干的新鲜土样，加入醋酸缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌10 min后静置取上清液。纤维素酶活性测定：将上清液进行水浴后冷却吸取反应液于96孔板，测定540 nm处吸光值；脲酶活性与蔗糖酶活性测定：将上清液经过37 ℃培养24 h后离心5 min取上清液沸水浴处理5 min，吸取反应液于96孔板，分别测定630和540 nm处吸光值。

土壤化学性质测定方法^[9]：土壤样品在室内自然干燥48 h，分成2份，分别过2.00 mm筛和0.25 mm筛以备用。pH采用水∶土=2.5∶1玻璃电极法；土壤有效磷的测定方法为氟化铵盐酸法；速效钾使用醋酸铵—火焰光度计法；有效氮用碱提取法测定。

高通量测序数据分析均在深圳微科盟科技集团有限公司提供的在线分析平台上完成。细菌多样性指数计算参考靳正忠等^[10]的方法，实验数据用Excel进行数据处理，采用SPSS25.0进行方差分析(P<0.05)选择最小差异性显著(LSD)检验。采用Origin 2022软件制图。

由图 1和表 2可以看出，林火使土壤中细菌的多样性和丰富度降低，在0~10 cm土层，轻度火烧对细菌多样性和丰富度的影响要大于中度和重度火烧，但差异不显著(P>0.05)；在10~20 cm土层，中度和重度火烧对细菌多样性和丰富度的影响显著大于轻度火烧(P<0.05)。

图 1(Fig. 1)

不同小写字母代表同一土层不同火烧强度下微生物多样性有显著性差异(P<0.05)；不同大写字母代表同一火烧强度同一林分类型下不同土层的微生物多样性有显著性差异(P<0.05)(平均值±标准差)。下同。 Different lowercase letters represent significant differences (P<0.05) in microbial diversity between different fire intensity in the same soil layer; different capital letters represent significant differences (P<0.05) in microbial diversity between different soil layers in the same stand type at the same fire intensity (mean ± standard deviation). The same below. 图 1 不同火烧强度下微生物群落多样性指数 Fig. 1 Microbial community diversity index under different fire intensity

表 2(Tab. 2)

表 2 多种因素对土壤微生物α多样性指数的影响方差分析(F值) Tab. 2 Analysis of effects of multi factors on the α diversity index of soil microorganisms (F value) 因变量 Dependent variable F Chao1 Faith_PD Shannon Simpson 土层深度 Soil depth 12.90** 8.09** 7.61* 2.40 火烧强度 Fire intensity 4.90** 3.71* 2.62 0.87 树种 Tree species 0.03 1.30 2.63 1.44 土层深度×火烧强度 Soil depth×Fire intensity 0.45 0.95 0.12 0.31 土层深度×树种 Soil depth×Tree species 1.66 2.40 0.60 0.48 火烧强度×树种 Fire intensity×Tree species 0.31 0.31 0.77 1.42 土层深度×火烧强度×树种 Soil depth×Fire intensity×Tree species 1.53 1.54 0.53 0.67 注：*和**分别表示在(P<0.05)和(P<0.01)水平差异显著。Notes: * and ** indicate significant differences at the (P<0.05) and (P<0.01) levels respectively.

表 2 多种因素对土壤微生物α多样性指数的影响方差分析(F值) Tab. 2 Analysis of effects of multi factors on the α diversity index of soil microorganisms (F value)

图 2a和2b为不同火烧强度后针阔混交林和竹林的土壤细菌在门水平上的群落组成，除相对丰度小于1%的类群外，共得到10个类群。其中相对丰度比例较大的前5种类群分别为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、放线菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)和绿弯菌门(Chloroflexi)。

图 2(Fig. 2)

CK为对照地；L为轻度火烧；M为中度火烧；S为重度火烧；U为0~10 cm土层；D为10~20 cm土层。下同。 CK refers to the control plot; L refers to light fire; M refers to moderate fire; S refers to heavy fire; U refers to 0-10 cm soil layer; D refers to 10-20 cm soil layer. The same below. 图 2 针阔混交林和竹林土壤细菌在门水平上的相对分布情况 Fig. 2 Relative distribution of soil bacteria at the phylum level in conifer and broad-leaved mixed forest and bamboo forest

在针阔混交林的10~20 cm土层中厚壁菌门的相对丰度在轻度火烧后最高；绿弯菌门的相对丰度在遭受中度和重度林火后最高。在竹林的10~20 cm土层中变形菌门、放线菌门和绿弯菌门的相对丰度在遭受中度和重度林火后最高；酸杆菌门的相对丰度在未遭受林火时最高；厚壁菌门的相对丰度在轻度火烧后最高。

对不同火烧强度后土壤样品进行LEfSe分析(筛选标准为P<0.05，阈值>3)。由图 3a可见，在针阔混交林0~10 cm土层中对土壤起主要作用菌群数随着林火强度的增强呈W形变化，在中度火烧后达到最大；在10~20 cm土层中对土壤起主要作用菌群数随着林火强度的增强呈U形变化，在重度火烧后达到最多。

图 3(Fig. 3)

g_Massilia中的g为属类，Massilia为物种名称为马赛菌属；f_Micrococcaceae中的f为科类；p_Verrucomicrobia中的p为门类；o_Chthoniobacterales中的o为目类；c_Spartobacteria中的c为纲类。 g in g_Massilia refers to the genus, and Massilia refers to the species name for the genus Marcella; f in f_Micrococcaceae refers to the Family; p in p_Verrucomicrobia refers to the phylum; o in o_Chthoniobacterales refers to the order; c in c_Spartobacteria c refers to the class. 图 3 针阔混交林和竹林不同火烧强度下土壤细菌群落差异的LDA值分布柱状图 Fig. 3 Histogram of the distribution of LDA values for differences in soil bacterial communities under different fire intensities in conifer and broad-leaved mixed forest and bamboo forest

由图 3b可见，在竹林0~10 cm土层中对土壤起主要作用菌群数随着林火强度的增强呈倒U形变化，在中度火烧后达到最大；在10~20 cm土层中对土壤起主要作用菌群数随着林火强度的增强呈U形变化，在未火烧中达到最大。

根据不同火烧强度下土壤微生物在属水平的物种注释及丰度信息，选取了丰度排名前20的属及其在每个分组样品中的丰度信息绘制热图，横向为样品名称信息。纵向为属水平分类注释名称。

如图 4a所示，中度和重度火烧的针阔混交林的0~10 cm土层中丰度较高的菌类与未火烧的相比菌类数增多。遭受到不同程度火烧后10~20 cm土层中各组丰度高的菌类数并无明显增加，但是种类发生变化。

图 4(Fig. 4)

图 4 针阔混交林和竹林土壤细菌物种丰度聚类图 Fig. 4 Cluster map of soil bacterial species abundance in conifer and broad-leaved mixed forest and bamboo forest

如图 4b所示，竹林0~10 cm土层在遭受到中度和重度火烧后相对丰度较高的菌类数增多且种类发生明显变化，例如丰度较高的菌类数由未火烧的3个增加到中度火烧后的9个，但是在10~20 cm土层中随着火烧强度的增大相对丰度较高的菌类数在逐渐降低。

竹林和针阔混交林土壤酶活性变化趋势无显著差异，因此进行合并。由图 5a可知，在0~20 cm土层中火烧样地土壤脲酶的活性显著小于未火烧样地，并且中度和重度火烧后土壤脲酶的活性显著小于轻度火烧(P<0.05)。

图 5(Fig. 5)

因针阔混交林和竹林土壤酶活性无显著差异，故不分别展示。 Since there are no significant differences in soil enzgme activities in conifer and broad-leaved mixed forest as well as bamboo forests, they are not shown separately. 图 5 土壤酶活性特征 Fig. 5 Characteristics of soil enzyme activity

由图 5b和5c可知，在0~10 cm的土层中火烧样地中蔗糖酶、纤维素酶的活性显著小于未火烧地(P<0.05)。其中在受到中度和重度火烧后纤维素酶的活性相对于轻度火烧显著降低(P<0.05)。在10~20 cm土层中，火烧样地土壤蔗糖酶、纤维素酶的活性与未火烧地相比有所降低但差异不显著(P>0.05)。

图 6为主要菌门与土壤化学性质、土壤酶活性之间的冗余分析，结果表明，第1轴和第2轴的累计解释量达到55.61%，土壤pH(酸碱度)是主要的影响因子。其余依次是AP(有效磷)、AK(速效钾)、AN(有效氮)、OM(有机质)。变形菌门与AK、AN、AP呈显著正相关相关系数分别为0.573、0.425、0.528。酸杆菌门与pH、AN、AK呈显著负相关相关系数分别为-0.588、-0.467、-0.569，与纤维素酶活性和脲酶活性呈显著正相关，相关系数分别为0.473、0.516。放线菌门和厚壁菌门与AP呈显著正相关，相关系数为0.505。放线菌门与OM、蔗糖酶活性、脲酶活性呈显著负相关，相关系数分别为-0.442、-0.488和0.565。绿弯菌门与土壤pH呈显著正相关，相关系数为0.425，与蔗糖酶活性、纤维素酶活性呈显著负相关，相关系数为-0.547和-0.470。

图 6(Fig. 6)

pH: 土壤pH值; OM: 有机质; AP: 速效磷; AN: 速效氮; AK: 速效钾; UE: 脲酶; SC: 蔗糖酶; CL: 纤维素酶。 pH: Soil pH; OM: organic matter; AP: fast-acting phosphorus; AN: fast-acting nitrogen; AK: fast-acting potassium; UE: urease; SC: sucrase; CL: cellulase. 图 6 土壤化学性质与土壤细菌门水平的冗余分析 Fig. 6 Redundant analysis of soil chemical propoerty with soil bacterial phylum level

在不同程度的火烧后，针阔混交林和竹林土壤细菌多样性有降低趋势，其原因是林火产生的高温会直接影响土壤中的细菌，火烧后的土壤养分和有机质被大量消耗，从而破坏了土壤团粒结构，降低土壤含水率与土壤孔隙度，改变土壤质地，土壤团聚体稳定性降低，使土壤板结，导致土壤微生物多样性降低^[10]。然而值得关注的是，与对照组相比，火烧后各样地土壤细菌多样性虽有降低，但变化均不显著，原因是在林火发生前，研究区偶遇近连续高温天气，降水量较往年大幅降低，土壤水分蒸发量也相对增加，而大部分土壤微生物对土壤温度、湿度变化都很敏感^[11]。这段高温时期对微生物来说，相当于后续火灾引发土壤环境更强高温的“过渡阶段”。也就是说，火灾前因连续高温天气，微生物多样性变化趋势已经按照土壤高温低湿度的方向发展了，只是高温程度未及火烧，导致本研究中火烧组与对照组相比，微生物多样性的差异并不显著。

与未受到火烧的样地相比，中度和重度火烧后样地土壤中发生属水平细菌群落结构显著变化，这是因为中度和重度林火在燃烧个过程中产生的废弃物导致土壤环境发生变化，不利于一些细菌群落的生存^[12]。另外有研究表明，在常规环境中生存的细菌类群不适应火烧后的土壤环境从而为其他类群提供了生存空间，使土壤中原本丰度较低的某些微生物类群数量激增^[13]，致使一些稀少的微生物群落能够被检测出来。本研究中，中度、重度火烧对针阔混交林和竹林土壤细菌群落的影响主要集中在0~10 cm土层，且火烧后部分细菌群落种类和丰度有显著变化。这是由于地表有丰富的枯枝落叶以及植物群落，且轻度的火烧对深层的土壤几乎没有影响。有研究结果显示变形菌门是一种富营养型细菌^[14]。这与本研究中变形菌门与AK、AN和AP呈显著正相关，且在遭受火灾后变形菌门在土壤中的相对丰度会增大的结果相一致。酸杆菌门属于寡营养性细菌嗜酸^[15]，与本研究中酸杆菌门的相对丰度随火烧强度的增加而降低与pH、AN和AK呈显著负相关相一致。这是由于火烧在燃烧森林中的林木时，一些未能充分燃烧或者是已经碳化的有机质会以生物炭的形式返回到生态系统中，增加了土壤中的可降解成分^[16]。除此之外，碳化的生物质有较大的比面积和强吸附性，在返回地表时会吸附土壤中易被高温挥发的氮素等养分，从而增加土壤的氮素含量^[17]。有研究表明，植物生产需要大量的土壤速效养分，在中度和重度火烧后，样地植物大部分已死亡，因此减少了土壤养分的消耗^[18]。从而为变形菌门提供了有益的环境，有研究也显示森林植被和枯落物在燃烧后会释放出金属离子中和土壤的酸性^[16]，同时林火也会导致土壤阳离子交换量降低，从而使土壤pH升高导致酸杆菌门受到抑制。

火烧后土壤的脲酶、纤维素酶和蔗糖酶活性显著低于未火烧土壤，这与Hernández等^[19]的研究结果一致，且林火对土壤表层10 cm内土壤蔗糖酶、纤维素酶影响大，对脲酶在20 cm的土层中都有影响。有研究显示，水解酶活性与土壤有机质的含量成正比^[20]，蔗糖酶、脲酶、纤维素酶都属于水解性酶，经过火烧后土壤中有机质含量减少，因此水解酶活性也随之降低。由于林火对0~10 cm土层的影响要大于10~20 cm土层，因此在0~10 cm土层中脲酶、蔗糖酶和纤维素酶都受到显著影响(P<0.05)。

1) 在林火发生1个月内，与CK组相比林火显著降低了土壤脲酶、蔗糖酶、纤维素酶的活性，也降低了竹林和针阔混交林土壤细菌群落的Chao1指数、Faith_PD指数和Shannon指数但差异不显著。

2) 在针阔混交林的0~10 cm土层中以及竹林的土壤中变形菌门、放线菌门和绿弯菌门的相对丰度在遭受中度和重度林火后最高；酸杆菌门的相对丰度在未遭受林火时最高；厚壁菌门的相对丰度在轻度火烧后最高。

3) 在土壤细菌结构与土壤化学因子的冗余分析中发现，变形菌门与土壤养分存在正相关关系；酸杆菌门与土壤养分以及pH值存在负相关关系。