2. 南方医科大学附属南方医院 核医学科 广州 510515
2. Department of Nuclear Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
表皮生长因子受体(Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR)信号通路在肿瘤的增殖、侵袭、转移及新生血管形成等方面起重要作用，针对EGFR的靶向治疗在临床中已被广泛应用。但由于病患个体差异，几代靶向EGFR的临床药物的总体疗效偏低[1-2]。如何明确EGFR表达及突变情况进而指导靶向用药成为临床亟待解决的问题，运用正电子核素标记靶向EGFR的小分子抑制剂进行PET显像能很好地指导临床靶向治疗。目前有多种此类探针被报道研究[3-4]，但仅有11C-PD153035及11C-Erlotinib（11C-埃罗替尼）被用于临床研究[5-6]，其中Memon等[7]最先研发的11C-Erlotinib显像更具应用价值与潜力，第一例32岁EGFR基因19号外显子突变患者显像发现脑部转移灶明显摄取[8]。Weber等[9]对13例Erlotinib治疗的非小细胞患者进行11C-Erlotinib显像，发现4例患者体内的一处或多处肺癌或淋巴转移部位放射性浓聚。但由于11C半衰期短，不适合中转与运输，仅适用于有回旋加速器的单位生产使用，限制了11C-Erlotinib的广泛应用，临床发展急需半衰期较长的此类正电子示踪剂。本研究拟通过国产氟多功能模块自动化标记埃罗替尼，获得一种靶向EGFR的新型分子探针，并对其进行体外稳定性评价。
1 材料与方法 1.1 试剂与材料氨基聚醚(Kryptofix2.2.2, K2.2.2)（德国ABX公司）；埃罗替尼(Erlotinib)（美国MCE公司）；对甲苯磺酸叠氮乙酯，自制；无水乙腈(MeCN)、无水碳酸钾(K2CO3)、2-氟乙醇、对甲基苯磺酰氯(4-toluene sulfonyl chloride, TsCl)、L-抗坏血酸钠(sodium L-ascorbate)、N, N-二甲基甲酰胺(N, N-dimethylformamide, DMF)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)（百灵威科技有限公司）；三[(1-苄基-1H-1, 2, 3-三唑-4-基)甲基]胺(tris[(1-benzyl-1H-1, 2, 3-triazol-4-yl)Methyl]amine, TBTA)、叠氮化钠(NaN3)、4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP)（梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；三乙基胺(Triethylamine, TEA)、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)、乙酸乙酯、石油醚等其他试剂均购自国药集团上海化学试剂有限公司。Sep-Pak light QMA、Sep-Pak plus C-18、Sep-Pak light Al2O3柱（美国Waters公司）。
1.2 仪器PETtrace回旋加速器（美国GE公司）；Inveon Micro-PET/CT扫描仪（德国SIEMENS公司）；氟多功能化学合成模块(PET-MF-2V-IT-I)（北京派特生物有限公司）；400 MHz核磁共振波谱仪、质谱仪（瑞士Bruker公司）；GC-911γ-放免计数器（科大创新股份有限公司中佳分公司）；CRC-15PET放射性活度计（美国Capintec公司）；AR-2000放射性薄层色谱仪(Radio thin layer chromatograph, Radio-TLC)（美国Bioscan公司）；RE5002旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；二氧化碳培养箱（上海一恒科技有限公司）；干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）。PET-MF-2V-IT-I模块配备半制备高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)，Alltech 626双泵；Alltech201紫外检测器，波长254 nm；放射性检测器；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 (9.4×250mm，5 μm)；流动相为梯度（0min，乙腈/水（15/85，V/V，流速0 mL·min-1）；2 min，乙腈/水（15/85，V/V，流速4 mL·min-1）；20 min，乙腈/水（60/40，V/V，流速4 mL·min-1）；30 min，乙腈/水（60/40，V/V，流速4 mL·min-1）；35 min，乙腈/水（15/85，V/V，流速4 mL·min-1））。分析型岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），二极管阵列检测器(SPD-M20A)；放射性检测器（美国Bioscan公司）；色谱柱：Kromasil 100-5C18 (4.6×250 mm，5 μm)；流动相乙腈/水(40/60)，流速1 mL·min-1。
1.3 标准品19F-FEA-Erlotinib的合成标准品19F-FEA-Erlotinib的合成从2-氟乙醇出发，经三步反应得到，如图 1所示。
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图 1 18F-FEA-Erlotinib及参比化合物19F-FEA-Erlotinib的合成路线 Figure 1 Synthetic scheme of 18F-FEA-Erlotinib and reference compound 19F-FEA-Erlotinib. |
冰浴下将对甲基苯磺酰氯(13.3 g，70 mmol)溶于80 mL二氯甲烷中，搅拌下依次加入三乙胺(35mL，0.25 mol)和DMAP (0.4 g，3.3 mmol)。充分溶解后缓慢滴加2-氟乙醇(1) (4.6 mL，80 mmol)的CH2Cl2 (30 mL)溶液，滴加完毕后撤掉冰浴室温反应48 h。真空下浓缩反应液，经柱层析分离得无色油状物9.15 g。产率为60%。
1.3.2 2-氟叠氮乙烷(19F-FEA)在对甲苯磺酰氟乙酯(2) (4.36 g，20 mmol)的30mL DMF溶液中，分三批加入叠氮化钠(3.9 g，60 mmol)，室温搅拌反应12 h，TLC监测无对甲苯磺酰氟乙酯后过滤除去固体，得到无色19F-FEA的DMF溶液。产物无需纯化而用于下步反应。
1.3.3 标准品(19F-FEA-Erlotinib)1 mL无水硫酸铜(5 mg，20 μmol)水溶液搅拌下加入2 mL L-抗坏血酸钠(15.8 mg，80 μmol)溶液中，待颜色变成均匀黄色后加入TBTA (2.7 mg，5 μmol)的DMF溶液(500 μL)，然后加入前体Erlotinib (393mg，1 mmol)的DMF溶液(30 mL)，搅拌15 min后加入19F-FEA的DMF溶液(2 mmol，2 mL)。45 ℃搅拌反应12 h，加200 mL水稀释后乙酸乙酯萃取（20 mL×3次），合并有机相后加饱和氯化钠溶液30 mL混合分层，减压蒸馏有机相得粗产物，经柱层析分离纯化后得白色固体309 mg。产率64%。
1.4 18F-FEA-Erlotinib的自动化合成18F-FEA-Erlotinib的合成包括两步放化反应（图 1），需要两个反应瓶，通过北京派特氟多功能(PET-MF-2V-IT-I)合成模块实现自动化合成，流程示意图如图 2所示，合成模块中各原料和试剂瓶中试剂填装如表 1。
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图 2 18F-FEA-Erlotinib在PET-MF-2V-IT-I合成模块中自动化合成流程示意图 Figure 2 Schematic diagram of the automated synthesis of 18F-FEA-Erlotinib on the PET-MF-2V-IT-I synthesis module. |
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表 1 18F-FEA-Erlotinib自动化合成所需试剂及安装位置 Table 1 Reagents and the place for the automated synthesis of 18F-FEA-Erlotinib. |
在PET-MF-2V-IT-I模块中相关管路作如下调整：断开原V7接V10、V9接A11管道，V9出接V10进，堵住原V9出通向安全瓶A11管道，V15与V17间接一阴离子交换柱(Sep-Pak light Al2O3)，V22与V23间接一分离纯化柱(Sep-Pak plus C-18)，其他管路均按原路线连接，1号反应管在加热除水过程中打开V9，V10向下通废液，在模块流程库编辑软件LibEditor中编写程序实现自动化控制。另外A4瓶中混合溶液配置如§1.3.3中顺序，在其他试剂均配置安装好后，传靶水前现配现用。18F-FEA-Erlotinib的自动化合成具体操作步骤如下。
PETtrace回旋加速器通过18O(p, n)18F核反应得到18F-离子，经NaHCO3活化后的QMA柱富集俘获后，用A1瓶中K2.2.2/K2CO3溶液淋洗到1号反应瓶中；通氮气(110 mL·min-1) 116 ℃加热蒸发溶剂，然后打开V2加入A2中无水乙腈到反应管1中，116℃下通氮气蒸干溶剂，得到干燥的[K/K2.2.2]18F-；加入A3中对甲苯磺酸叠氮乙酯(3)的无水乙腈溶液，95 ℃下密封反应7 min，冷却反应瓶；打开V11将A4中混合溶液加入到2号反应瓶中，然后依次打开V14、V16、V9、C1，并65 ℃加热1号反应瓶，期间间断打开V8 (5 s)通入氮气，减压蒸馏10 min后，关闭阀门密闭2号反应瓶，45 ℃反应15 min，期间间断通入氮气鼓动反应液；反应结束后加入A5中乙腈，打开V16-V15-V17到液相上样瓶A10的通路，转移液体至A10，再将A6溶液加入到2号反应管，后同上步骤转移至A10中；用半制备HPLC分离，分离条件如§1.2所述，监测18F-FEA-Erlotinib出峰位置并切换V18收集目标产物于A7中；控制V23到废液方向，打开V19将18F-FEA-Erlotinib富集于C-18柱上；用30 mL水(A8)洗C-18柱并吹干，切换V23到产品瓶，然后用乙醇(A9)洗脱C-18柱产品到产品瓶（10 mL无菌西林瓶）中，即得高放化纯度的18F-FEA-Erlotinib，使用时按需用生理盐水稀释即可。
1.5 脂水分配系数取10 μL配制好的18F-FEA-Erlotinib注射液于装有1 mL正辛醇与990 μL水的3 mL离心管中，密闭置于干式恒温器中常温震荡10 min，静置20min使两相分层，用移液器从两相中分别各取500μL置于γ计数管中，用γ计数器测定计数。平行进行两批次实验，每批重复三次。据式(1)计算得到logP值。
| $ {\rm{log}}P=\rm{log}\left[\rm{CP}{{\rm{M}}_{\rm{oil}}}\rm{/CP}{{\rm{M}}_{\rm{water}}} \right] $ | (1) |
式中：CPMoil为正辛醇相每分钟计数；CPMwater为水相每分钟计数。
1.6 产品质量控制用经酸度计校正过的精密pH试纸测定注射液pH值，目测其颜色及澄清度；取现制备18F-FEA-Erlotinib注射液74 MBq，用活度计测定不同时间点(0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)的活度值，通过原子核衰变规律公式计算半衰期并估测核纯度；用分析型HPLC通过比对18F-FEA-Erlotinib与标准品19F-FEA-Erlotinib保留时间鉴定产物，分析注射液的化学纯度和放射化学纯度，并通过外标法计算比活度。
配置不同浓度的K2.2.2溶液(100 mg·L-1，50mg·L-1，10 mg·L-1)，取衰变完全的18F-FEA-Erlotinib注射液采用薄层色谱氯铂酸和碘化钾染色法测定溶液中K2.2.2残留量[10]，测量结果应低于50mg·L-1[11]；按2015版中国药典[11]检查注射液的溶剂残留、内毒素和无菌性，应符合要求。
取18F-FEA-Erlotinib (20 μL，≈2 MBq)分别置于PBS (2 mL)和胎牛血清(2 mL)中，置于细胞培养箱中37 ℃，5% CO2下孵育(0 min，30 min，60 min，90 min，120 min)后，用放射性TLC层析法（展开剂为100%乙酸乙酯）测定其放射化学纯度，评价其体外稳定性。
取5只SPF级健康昆明小鼠，雌雄不限，体重18-22 g，每只小鼠分别于4-5 s内静脉注射0.5 mL 18F-FEA-Erlotinib注射液。观察小鼠48 h内生存情况，评价18F-FEA-Erlotinib注射液异常毒性。
2 结果与讨论 2.1 标准品19F-FEA-Erlotinib的合成标准品用于标记时HPLC分离分析方法的建立及放射性标记产物的确认。19F-FEA-Erlotinib的合成以2-氟乙醇为起始原料经磺酰化反应活化醇羟基，再经取代反应叠氮化，得关键中间体19F-FEA，最后通过“点击化学”反应得到。实验发现，点击反应在传统的催化条件（Cu(Ⅱ)/L-抗坏血酸钠）基础上，添加催化剂量的Cu(Ⅰ)稳定剂TBTA[12]后产率从42%增加至65%左右。
所有反应中间体及参比化合物均通过1H NMR表征确认，标准品19F-FEA-Erlotinib进行了高分辨率质谱检测确证。对甲苯磺酰氟乙酯(2)：1H NMR (400MHz，CDCl3) δ 7.81 (m，2H)，7.36 (d，J=8.0 Hz，2H)，4.57 (m，2H)，4.26 (m，2H)，2.46 (s，3H)；2-氟叠氮乙烷(19F-FEA)：1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) 4.61 (m，2H)，3.62 (m，2H)；19F-FEA-Erlotinib：1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ 9.57 (s，1H)，8.63 (s，1H)，8.49 (s，1H)，8.28 (t，J=1.7 Hz，1H)，7.91 (dd，J=10.3 Hz，2.2 Hz，2H)，7.51 (m，2H)，7.23 (s，1H)，4.96 (m，1H)，4.83 (dt，J=7.9 Hz，4.5 Hz，2H)，4.75 (m，1H)，4.31 (m，4H)，3.77 (m，4H)，3.38 (s，3H)，3.36 (s，3H)。HRMS (ESI，m/z)：计算M (C24H28FN6O4)：483.2151，检测：483.215 4。
2.2 18F-FEA-Erlotinib的自动化合成采用国产的PET-MF-2V-IT-I型多功能合成模块，以对甲苯磺酸叠氮乙酯为原料，经亲核氟化反应得到Click合成子2-18F-氟叠氮乙烷(18F-FEA)[13]，再通过“点击化学”反应得到目标产物18F-FEA-Erlotinib，后经半制备HPLC分离、C-18柱富集，最后经乙醇淋洗即得18F-FEA-Erlotinib。
第一步放化反应亲核反应结束后，中间体18F-FEA通过改装多功能模块后实现低温减压蒸馏纯化，并在此之前将铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成(CuAAC)反应的催化体系及前体加入到2号反应管用以吸收18F-FEA馏份。此方法可避免未反应的叠氮前体3的蒸出，提高18F-FEA的浓度，进而提高“点击化学”产率、减少副产物。
18F-FEA-Erlotinib由Erlotinib与18F-FEA经CuAAC反应制备，反应条件温和(45 ℃)、时间短(15min)、操作简便，标记率达90%（n > 5，从18F-FEA计，衰变校正）。通过标准品的合成研究发现，传统的催化体系（Cu(Ⅱ)/L-抗坏血酸钠）中添加微量的TBTA能稳定提高反应产率，所以我们采用了Cu(Ⅱ)/L-抗坏血酸钠/TBTA的催化体系。自动化合成实验中，催化剂体系的配制方式对产率影响较大。将0.5 mol·L-1 CuSO4·5H2O溶液、1 mol·L-1 L-抗坏血酸钠溶液、TBTA及Erlotinib的DMF溶液分别或者组合式加入于2号反应管中混合的催化效果不理想，与4者按§1.3.3所述顺序混合后一次性加入2号反应管且现配现用方法相比，反应产率及稳定性相差较大。
18F-FEA-Erlotinib反应液上半制备HPLC分离（图 3），其中几乎无游离18F-离子，少量未反应完全18F-FEA保留时间为14 min左右，产品18F-FEA-Erlotinib在22 min左右出峰，接收该范围HPLC洗脱液于预先装有大量稀释用水的中转瓶后富集于C-18柱上，再用大量水冲洗C-18并吹干，乙醇淋洗即可得到高放化纯度(> 99%)的18F-FEA-Erlotinib。
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图 3 半制备HPLC分离18F-FEA-Erlotinib的放射峰图谱 Figure 3 Radioactive semi-preparative HPLC chromatogram of 18F-FEA-Erlotinib. |
18F-FEA-Erlotinib自动化合成时间为70 min，总放射化学产率为(54±2)%（n > 5，从18F-计，衰变校正）。通过“点击化学”自动化合成18F-FEA-Erlotinib的方法高效可靠，适合于大规模生产。
2.3 脂水分配系数18F-FEA-Erlotinib的脂水分配系数logP为2.36±0.01，为亲脂性物质，与Erlotinib亲脂性相近[14]。因此18F-FEA-Erlotinib具有像11C-Erlotinib一样进行体内PET显像的应用潜力。
2.4 质量控制结果18F-FEA-Erlotinib注射液为无色或浅黄色透明、澄清溶液，pH值约为7.0，18F-FEA-Erlotinib注射液核素物理半衰期约为110 min，放射性核纯度大于99%。分析型放射性HPLC测定典型18F-FEA-Erlotinib谱图示于图 4，其中标准品19F-FEA-Erlotinib保留时间为8.38 min（图 4(a)），18F-FEA-Erlotinib保留时间为8.55 min（图 4(b)），表明18F-FEA-Erlotinib为目标产物，放射化学纯度大于99%，放射性比活度高于200 MBq·μmol-1。
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图 4 标准品19F-FEA-Erlotinib (a)与18F-FEA-Erlotinib (b) HPLC谱图 Figure 4 HPLC chromatograms of reference compound 19F-FEA-Erlotinib (a) and 18F-FEA-Erlotinib (b). |
衰变完全的18F-FEA-Erlotinib注射液薄层色谱氯铂酸和碘化钾染色法测定K2.2.2残留量显示，样品点显色斑点基本无色、无色环，明显低于10 mg·L-1标准液显色点颜色，符合我国药典中关于18F-FDG注射液中K2.2.2残留低于50 mg·L-1的要求。注射液溶剂残留、内毒素和无菌性均符合要求，其中三批质量控制结果如表 2所示。
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表 2 18F-FEA-Erlotinib注射液质量控制结果 Table 2 Quality control results of 18F-FEA-Erlotinib. |
体外稳定性实验结果显示，18F-FEA-Erlotinib在PBS及胎牛血清中孵育2 h后，均未发现脱氟反应，表明18F-FEA-Erlotinib具有良好的体外稳定性。急性毒性实验中小鼠均健康存活，生活状态良好，无异常反应，显示18F-FEA-Erlotinib注射液在体内安全。这为显像剂的进一步体内评价研究奠定了基础。
3 结语本实验通过“点击化学”方法制备了一种潜在的EGFR显像剂18F-FEA-Erlotinib，并成功对其进行了自动化合成。18F-FEA-Erlotinib的自动化合成工艺简单高效，产物具有较高的放射化学产率、比活度和放射化学纯度。18F-FEA-Erlotinib体外稳定性良好，无明显脱氟显像，同时具有与母体化合物Erlotinib相似的亲脂性，为进一步开展该探针的体内研究奠定了良好基础。
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