2. 四川省茶业科学与工程重点实验室 成都 611830;
3. 四川省藏茶茶业工程技术研究中心 雅安 625014;
4. 四川省雅安义兴藏茶有限公司 雅安 625014
2. Laboratory of Tea Science and Engineering, Chengdu 611830, China;
3. Research Center of Tibetan Tea Engineering Technology, Ya'an 625014, China;
4. Yi-xing Tibetan Tea Co., Ltd., Ya'an 625014, China
雅安藏茶属于我国特有茶类，其制作工艺包括杀青、4次渥堆发酵、筛分、蒸茶和蹓茶等18道工艺[1]。在湿热作用和外源酶的转化下，形成了茶黄素、茶红素、茶褐素、茶多糖、氨基酸和蛋白质、磷脂和胆碱微量元素等多种成分。研究表明，雅安藏茶含有较多茶褐素，茶褐素含量与雅安藏茶保健功效呈显著的正相关[2]。茶褐素是一类能溶于水而不溶于乙酸乙酯和正丁醇的褐色色素，也是一类十分复杂的高聚物，除含有多酚氧化聚合物外，还含有氨基酸、糖类等结合物，含有羟基、羧基、烷基和苯环类似物，具有较强的耐氧化性。目前，茶褐素的研究多集中在减肥、降脂、抗氧化等方面[3-6]，何英姿[7]以六堡茶为原料，对其水提物经氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后得到茶褐素提取物，证明该提取物对羟自由基的清除率高达74%，对亚硝基的清除率高达73%，对超氧自由基的清除率达到60%以上，且清除羟自由基的能力高于维生素C。周向军[8]以乌龙茶为原料，采用试剂提取法得到茶褐素提取物，证明其对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH (2, 2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate) 自由基均有一定的清除效果，并且随着提取物浓度的增大清除率也增加，与同类提取物相比具有明显优势。大量文献表明[8-9]，茶褐素具有很好的抗氧化的保健作用，也间接地表明茶褐素能够具有很好的防辐射作用功效，但其抗辐射及辐射引起的损伤方面的研究鲜见报道，动物辐射模型实验尚未见报道。
本研究以雅安藏茶为材料，拟通过动物实验，构建小鼠60Co γ辐射损伤模型，对其中的茶褐素进行研究，探究雅安藏茶抗辐射作用的功效成分，探究茶褐素对辐射损伤抗氧化系统及造血系统的防护作用，为辐射防治提供新思路，并为雅安藏茶的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与仪器供试动物：试验选择6-8周龄的雄性清洁级昆明小白鼠48只，体重22-24 g，购自于成都达硕生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（川）2013-24。
材料与试剂：雅安藏茶由雅安义兴藏茶有限公司提供，材料选用一芽四、五叶鲜叶原料（2014年产）；正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、冰醋酸 (100%) 等所有化学试剂均为分析纯，总抗氧化能力 (Total Antioxidant Capacity, T-AOC)，总超氧化物歧化 (Total Superoxide Dismutase, T-SOD)，超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase, SOD)，肝脏丙二醛 (Malondialdehyde, MDA)，过氧化氢酶 (Catalase, CAT)，总蛋白试剂盒购自南京建成生物所，5 Gy小剂量60Co γ射线辐照技术由四川省农业科学院生物技术核技术研究所提供。
主要仪器与设备：BS-124S型电子天平（上海），HH-6型数显衡温水浴锅（常州），RE-2000型旋转蒸发器（上海）V-1600可见光分光光度计（上海），UV-1800紫外分光光度计（上海），2-16K型高速冷冻离心机（日本），DZF-6090型真空干燥箱（上海），DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱（上海），60Co γ辐射源由四川省农业科学院生核所提供。
1.2 实验方法 1.2.1 茶褐素的提取[10]雅安藏茶按1:20加入沸蒸馏水中，浸提30 min，再用同样方法浸提两次，合并三次水浸提液，用4层纱布过滤，将所得滤液再进行抽滤，将抽滤液在50-60 C下减压浓缩至一定体积，浓缩冷却得浓缩液。用等体积正丁醇放入分液漏斗中萃取，振荡3min，萃取三次，余下水相用等体积氯仿萃取三次，水相用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并水相，50-60 C下减压浓缩至粘稠状，70 C真空干燥得茶褐素制品，实验测得茶褐素提取率为14.86%，通过380 nm分光光度法[11]测定得到提取物茶褐素含量为17.86%。
1.2.2 动物的分组及处理实验将48只SPF级雄性小白鼠适应性喂养5 d后，随机分为6组：Ⅰ为正常对照组、Ⅱ为辐射对照组、Ⅲ为阳性对照组、Ⅳ为茶褐素低剂量组、Ⅴ为茶褐素中剂量组、Ⅵ为茶褐素高剂量组，并采取灌胃的方式给药。茶褐素的灌胃剂量是根据日本东京桑野研究[12-13]推荐成人每日用茶剂量与体重比0.1 g·kg-1换算而成，即小鼠的灌胃剂量为人体的5倍，而测定茶褐素的含量为雅安藏茶的8%-10%，故灌胃小鼠茶褐素的低剂量为50mg·kg-1·d-1，再分别设定两倍 (100mg·kg-1·d-1)、4倍 (200 mg·kg-1·d-1) 的中高剂量组。其中，组Ⅰ-Ⅲ给予蒸馏水，其余组给予相应的受试样品，共给药15 d。除正常组外，其余各组连续灌胃5 d后，第6 d各组均用60Co γ射线进行一次全身照射，总剂量为5 Gy，剂量率为0.6Gy·min-1，照射后仍然继续给予受试物到第15d。Ⅲ组在辐射前30 min腹腔注射氨磷汀150mg·kg-1[14]。
开始灌胃后第16 d，所有组小鼠全部进行眼睑采血，测定白细胞 (White Blood Cell, WBC)，采血后取小鼠一侧股骨，测量小鼠骨髓细胞DNA含量，取肝脏，于-40 C冷冻保存待用。
1.2.3 外周血细胞和骨髓DNA含量测定[15]采集的血样存放于抗凝管中，用血球分析仪检测血液中WBC、血小板 (Platelets, PLT) 和淋巴细胞 (Lymphocytes, LYM) 的含量。
DNA含量的测定方法[16]具体为：剥离小鼠右侧股骨，除净组织及污血；剪断第二股骨后称量股骨重，用10 mL 0.005 mol·L-1 CaCl2冲洗全部骨髓至离心管中，反复冲洗至股骨为白色为止，置于冰箱中4 C放置30 min，2 500 r·min-1离心15 min，弃上清液，加入5 mL 0.002 mol·L-1 HCIO4充分混匀，90 C水浴15 min，流水冷却，3 500 r·min-1离心10 min，紫外分光光度计测定其上清液在268 nm处的吸光度 (Optical density, OD) 值A。结果为：
| $ \omega = {A_{268}}/{W_{\rm{F}}} $ | (1) |
式中：
处死后，剖腹取各小鼠胸腺和脾脏，除去脂肪及血污，滤纸吸干，准确称取其重量，按式 (2) 计算相应的脏器指数：
| $ {I_{\rm{O}}} = {W_{\rm{O}}}/W \times 100\% $ | (2) |
式中：IO为脏器指数，%；WO为脏器重量，g；W为体重，g。
1.2.5 小鼠肝脏T-AOC、T-SOD活性及MDA含量测定[17]参照试剂盒方法测定各组小鼠肝脏T-AOC、T-SOD活性及MDA的含量。
1.3 数据记录与处理试验数据采用Excel软件进行统计分析，采用SPSS 17.0软件对数据进行统计处理，所有数据均以均数±标准差 (Standard Error, SE) 表示，多组比较采用单因素ANOVA方差分析，不同剂量组间与对照组的比较采用方差分析，检验水平a=0.05。
2 结果与分析 2.1 受试物对60Co γ辐射小鼠血液白细胞、血小板和淋巴细胞的影响由表 1可以看出，各组小鼠经60Co γ射线辐射后，小鼠血液WBC、PLT、LYM含量均明显下降，说明小鼠经60Co γ辐射后其造血功能降低；但灌胃受试样品各组小鼠血象细胞含量均不同程度高于辐射对照组，其中，茶褐素高剂量组小鼠WBC、PLT、LYM含量均显著性高于辐射对照组小鼠（p < 0.05或p < 0.01），且与阳性组相比，含量显著性高于阳性组小鼠，其余指标均与阳性组无明显差异，表明雅安藏茶茶褐素能明显保护60Co γ辐射后小鼠血液WBC、PLT、LYM，防止其含量下降，均能达到药物防护作用效果。
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表 1 受试物对60Co γ辐射小鼠血液白细胞、血小板和淋巴细胞含量的影响 Table 1 Influence of Ya'an Tibetan teas on mouse serum WBC, PLT and LYM content after 60Co γ radiation. |
表 2是受试物对60Co γ辐射小鼠胸腺、脾脏指数和骨髓DNA含量的影响。由表 2可知，与正常对照组相比，各组小鼠胸脾指数明显减小，表明辐射可能对小鼠胸脾造成一定的损伤，导致小鼠胸脾器官萎缩。而灌胃茶褐素低、中、高剂量的各组小鼠其胸腺指数均极显著地高于辐射模型组 (p < 0.01)，其中，茶褐素高剂量组的保护效果接近正常对照组，表明高剂量组能明显抵御辐射损伤。除此外，茶褐素中、高剂量组小鼠的脾脏指数显著地高于辐射对照组 (p < 0.05)，表明茶褐素能够很好地防护60Co γ辐射对于小鼠胸脾器官的损伤，提高小鼠机体的免疫强度。辐射后，与正常对照组相比，各组小鼠骨髓DNA含量显著性减少 (p < 0.05)，表明辐射对于损伤小鼠骨髓DNA含量有一定的影响，从而可能间接影响小鼠的造血能力。与辐射对照组相比，茶褐素低、中、高剂量均能极显著地提高辐射损伤小鼠的骨髓DNA含量 (p < 0.05)，表明茶褐素对辐射损伤小鼠造血能力有一定防护作用。
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表 2 受试物对60Co γ辐射小鼠胸腺、脾脏指数和骨髓DNA含量的影响 Table 2 Influence of Ya'an Tibetan teas on mouse thymus index, spleen index and bone marrow DNA content after 60Co γ radiation. |
表 3是受试物对60Co γ辐射小鼠血清中CAT酶和SOD酶活性的影响。由表 3可知，与正常对照组相比，受辐射照射的影响，各组小鼠血清中CAT和SOD酶活性都极显著下降 (p < 0.05)，灌胃茶褐素后，茶褐素低、中、高剂量组小鼠血清中CAT和SOD活性均极显著地高于辐射对照组 (p < 0.01)，表明茶褐素能明显保护辐射损伤小鼠血液CAT和SOD酶活性，且存在一定的剂量关系，以高剂量效果最好，且恢复效果与正常小鼠无明显差异。
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表 3 受试物对60Co γ辐射小鼠血清中CAT酶和SOD酶活性的影响 Table 3 Influence of Ya'an Tibetan teas on mouse serum CAT and SOD enzymatic activity after 60Co γ radiation. |
由表 4可知，受辐射照射影响，各组小鼠的T-SOD、T-AOC活性均极显著低于正常对照组。而茶褐素低、中、高组T-SOD和T-AOC活性均有极显著性高于辐射对照组 (p < 0.01)，表明茶褐素能保护辐射小鼠肝脏T-SOD、T-AOC的活性。与阳性对照组相比，茶褐素对这三个指标的作用已达到或优于阳性药物。MDA是脂质过氧化反应的产物，具有一定的细胞毒性，会给肝脏造成一定损伤。由表 4可知，辐射后，辐射对照组小鼠肝脏中MDA含量极显著增加 (p < 0.01)，而灌胃茶褐素低、中、高剂量组小鼠肝脏MDA有极显著的减少 (p < 0.01)，其中，茶褐素高组小鼠与正常状态小鼠无明显差异，表明茶褐素能减少辐射损伤小鼠肝脏中MDA的积累，且呈一定的剂量效应。以上结果表明，茶褐素能提高辐射损伤小鼠的T-SOD和T-AOC活性，减少MDA含量积累，增强机体抗氧化能力，对60Co γ辐射损伤有一定的防护作用。
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表 4 受试物对60Co γ辐射小鼠肝脏T-AOC、T-SOD活性及MDA含量的影响 Table 4 Influence of Ya'an Tibetan teas on mouse liver T-AOC, T-SOD and MDA after 60Co γ radiation. |
抗氧化系统是一道保护机体免受自由基和活性氧氧化损伤的屏障，其主要由SOD、CAT等酶系构成[18-19]。小鼠受到辐射照射后，血液中SOD和CAT以及肝脏中T-SOD、T-AOC等抗氧化性指标明显降低，表明经辐射后小鼠机体的抗氧化能力降低，肝脏可能受到一定的损伤。而实验中发现，茶褐素能显著地提高辐射损伤小鼠血清中CAT、SOD和肝脏T-AOC、T-SOD活性，且存在一定的剂量关系。同时辐射使得小鼠机体产生大量的自由基作用于膜脂质不饱和脂肪酸，积累了大量的MDA，故MDA的含量能够间接反应机体被自由基损伤的程度[20-21]。受辐射影响，肝脏中MDA含量较正常水平有一定的增加，而实验结果显示，茶褐素能有效地减少小鼠肝脏MDA含量，且浓度越高效果越好，这也间接地印证了茶褐素能够通过提高小鼠血液CAT、SOD和T-AOC、T-SOD的活性，增强机体中酶促体系，提高清除电离辐射产生的活性自由基[22]的能力，从而缓解脂质过氧化反应，由此，肝脏MDA的含量显著性减少。
造血系统是电离辐射的敏感靶器官之一，各系统原始血细胞均源自骨髓造血干细胞，它可以不断自我复制为相同功能的同级细胞和不断增殖分化为特定系统的下级细胞[23]，是维持机体正常造血、保障造血损伤后重建各类血细胞的主导细胞。实验发现，辐射后小鼠机体造血能力受到影响，血液中WBC、PLT、LYM数量显著减少，骨髓DNA含量显著低于正常水平，推测血细胞的减少可能是因为辐射直接破坏了机体骨髓DNA，进而使得血细胞生成困难，数量减少。胸脾作为机体的免疫器官，具有一定的造血功能，同时也可能是辐射损伤的靶器官，小鼠经过照射后，胸脾指数显著下降。而实验结果表明，茶褐素低、中、高组WBC、PLT、LYM数量相比辐射对照组均有显著增高，胸脾指数显著性回升，骨髓DNA含量显著性增加，其中茶褐素高剂量组作用功效最显著，表明茶褐素对于辐射损伤小鼠造血能力具有很好的保护作用。
据文献报道，茶褐素主要是由酚和羧酸类物质构成，具有酚性物质特性[24]，其与自由基反应能够生成较为稳定的酚氧自由基，因而能够灭活自由基[25-26]，这也间接说明茶褐素具有清除自由基、提高机体抗氧化强度的能力。而实验中茶褐素具有提高辐射小鼠肝脏抗氧化强度和造血能力的功效，与研究发现的黑茶能减轻辐射对造血系统的损伤作用、提高照射小鼠肝组织和肺组织中SOD的活性和增强受照小鼠的整体免疫力作用的结果一致[14]，也间接表明茶褐素不仅具有一定的抗辐射作用，可能在黑茶抗辐射作用中也起着重要的作用，但由于茶褐素成分复杂，其对于辐射损伤保护作用的具体机理尚不清楚，有待进一步研究。
综上可以看出，60Co γ射线辐射会造成小鼠机体造血和抗氧化功能的下降，而雅安藏茶茶褐素能防止辐射损伤小鼠血液中WBC、PLT、LYM的数量下降，防护辐射损伤小鼠的胸脾器官，改善机体的免疫功能，增加小鼠骨髓DNA的含量，保护辐射损伤小鼠血清中CAT、SOD和肝脏T-AOC、T-SOD活性，降低肝脏MDA含量，且这些作用效果具有一定的剂量效应。表明茶褐素对辐射损伤小鼠的抗氧化系统和造血系统有较好的防护作用，且以高剂量的茶褐素效果最佳。
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