科学施肥是实现农业增产和土壤健康的重要手段之一。土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分参与了土壤有机质分解、腐殖质形成、土壤养分转化和循环等过程，在土壤肥力形成和持续发展中起到关键性作用。因此，土壤微生物多样性和功能是衡量土壤地力和作物生产力的重要指标，深入认知土壤微生物参与土壤有机质和养分循环的过程，发挥其地下生物功能，对于评价和指导科学施肥具有极为重要的意义。近20年来，特别是近10年来由于先进技术和方法的强力推动，土壤微生物对不同施肥策略响应和反馈的研究呈现爆发式增长。这些研究成果实质性地推动了微生物在农田养分循环和土壤地力提升过程中重要性的认知。但是我们也注意到研究多聚焦于单个养分元素层面，而养分元素间的耦合，以及养分元素和有机碳之间关联的微生物学机理有待深入。

互作和耦合是土壤微生物的重要特性之一 (图1)^[1]。微生物介导的养分循环过程具有耦合性和整体性。从生物体元素组成上说，碳不仅是构成生物细胞骨架的主要元素，也是生物质能的主要储存物质；氮素是细胞蛋白质等物质的重要组成元素，氮素的摄入为酶类构建和活性提高提供了必要的保证；磷素主要是脂类、核酸类、ATP等物质的组成元素，它在生物体内各种代谢 (碳代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢) 中起到重要作用。微生物代谢生长需要碳、氮、磷等多种元素，因此就必然会同时涉及多元素的循环。从生物地球化学循环上说，电子 (能量) 交互是生态系统元素耦合循环的内在驱动力。土壤有机碳是还原性物质。微生物在氧化这些物质时，会释放多余的电子 (还原力)，而其他元素例如氧、氮、铁、硫、锰等元素可以作为电子受体消除因还原力过剩而导致的土壤碳代谢受阻，这种情况在厌氧环境中尤为明显。同时，氮、铁、硫、锰等元素的氧化也可为微生物提供能量促进后者的生长和碳的同化。由此可见，土壤有机碳循环影响微生物介导的养分循环，而不同施肥策略下各类养分循环对微生物群落又存在必然反馈，影响了土壤有机碳的累积。有机碳的累积是农田土壤地力提升的重要指标，因此从土壤微生物介导的养分元素循环及其与土壤碳循环的关联这一全新视角进行科学研究，有助于更全面了解农田土壤养分循环过程和指导科学施肥，更好地服务于农田地力提升。本课题组以中国科学院封丘农业生态试验站 (简称封丘站) 养分平衡长期定位试验为平台，以7种长期不同施肥处理[不施肥对照 (Control)、有机肥 (OM)、有机无机肥配施 (1/2OMN)、施用化肥 (NPK、NP、NK和PK)]的土壤为供试材料，系统研究了潮土中微生物介导的碳、氮、磷元素的循环耦合，同时阐明了微生物对潮土养分的响应与反馈，进一步揭示了潮土碳磷耦合的微生物学机制，兼具理论意义和实践价值。

图1(Fig. 1)

图1 微生物介导的元素耦合循环示意图[1] Fig. 1 Schematic diagram of microbial mediated element coupling cycle

封丘站于1983年5月建立在河南省封丘县潘店乡 (东经114°24′、北纬35°00′)，隶属于中国科学院南京土壤研究所。1988年经中国科学院批准，正式向国内外开放，2001年被国家科技部批准为国家重点野外科学观测实验站。封丘站是国家和中国科学院部署在黄淮海平原从事农业、资源、生态和环境研究的一个最主要的野外试验基地。针对黄淮海平原粮食生产现状和面临问题，重点围绕潮土质量演变规律、农田生态系统生产力持续提升、水土养分资源高效利用等系列目标开展了系统研究，取得了一系列重要研究成果，为黄淮海区域农业持续发展提供了重要理论和技术支撑。

本课题组自21世纪初以来，系统研究潮土养分循环的微生物学机制。首先针对平衡施肥，特别是施用有机肥促进潮土地力提升的现状，从土壤微生物学特性揭示了其内在机制。研究发现磷素是潮土微生物功能和多样性的关键因子，添加磷素能够提高微生物生物量、酶活性、代谢活性，同时降低微生物热散逸，进而利于潮土地力提升。在明确磷素对潮土微生物的影响后，本课题组于2011年前后进一步研究磷素相关功能微生物—丛枝菌根真菌对潮土不同施肥的响应。研究发现施用磷肥可通过“生物地下交易”法则，使得作物对解磷微生物依赖性下降，将更多的光合产物碳分配给其他微生物，达到改善潮土生物学特性的效果。这些结果暗示了潮土元素循环的耦合性，特别是碳磷循环。因此，近年来本课题组关注潮土养分耦合的微生物学机制，初步发现缺磷使得经由微生物转化进入土壤有机碳库的碳比例减少，不利于潮土对碳的固持，即“缺磷耗碳”；但是外源碳的添加能够增殖解磷微生物，进而活化潮土中不可利用态磷素，达到“增碳活磷”的效果。鉴于磷素是潮土微生物的限制性因子，本文将从磷素功能微生物对潮土不同施肥的响应，磷素对潮土碳氮循环微生物学特性的影响，潮土碳磷耦合的微生物学机制等4个方面，对本课题组10余年来潮土养分耦合循环微生物工作进行总结。

潮土中磷素严重亏缺已成为提高作物产量的主要限制因素。已有结果表明，黄淮海平原上潮土生产潜力很大，磷肥配合施用的交互增产效益极其显著，因此科学施肥增加土壤磷素的积累与利用是提高潮土耕地质量的重要措施。鉴于土壤微生物间存在“生物地下交易”法则^[2]，磷素的缺失和添加必然会改变土壤碳氮循环相关微生物多样性和功能。因此，以磷素为核心的潮土养分循环耦合性及其微生物学机制可视为一种研究农田土壤养分循环耦合性的模式体系。

丛枝菌根真菌 (arbuscular mycorrhizal fungi，AMF) 是陆地生态系统最典型的植物–微生物共生体系，也是一类参与磷素生物地球化学循环过程的关键功能微生物，同时它们在碳氮循环中扮演着重要角色。AMF和植物通过“生物地下交易”法则，进行着物质和能量的交换：植物将光合产物以碳源的形式输送给AMF；作为反馈，AMF为植物吸收更多的磷素等养分，以促进植物生长。此外，宿主植物会根据环境的变化，“选择性”放弃某些AMF物种，将更多的光合产物分配给其它微生物，实现碳素–养分元素的耦合，以促进土壤地力可持续发展。因此，AMF群落的变化不但可以表征土壤质量和健康，还可以敏锐地反映土壤生态系统的变化。

通过高通量测序，我们共获得了59611个AMF的特异性片段序列，形成70个OTUs (图2a)^[3]，主要分布在Glomeraceae和Gigasporaceae二个科中 (图2b)^[3]。不同施肥处理间多样性指数的比较发现磷肥施用降低了潮土中AMF多样性 (图3)^[3]。与NK和对照 (Control) 相比，NP、NPK和OM处理显著降低了AMF的PD (phylogenetic diversity) 和Shannon多样性指数，以及Chao1和观测物种数的数量。NP、NPK和OM处理间的AMF多样性指数并没有差异。为了验证该结果的可靠性，我们利用传统的分离和鉴定方法研究了AMF孢子多样性的变化，得到了一致的结果 (表1)^[4]。

图2(Fig. 2)

图2 潮土中优势真菌 (a) 和丛枝菌根真菌群落 (b) 组成 Fig. 2 The dominant fungi of fluvo-aquic soil (a) and the community composition of AMF (b)

图3(Fig. 3)

图3 不同施肥下潮土丛枝菌根真菌多样性的变化 Fig. 3 The diversity variation of AMF in fluvo-aquic soil under different fertilizations

表1(Table 1)

表1 不同施肥对土潮土枝菌根真菌孢子多样性的影响 Table 1 Effects of different fertilization on AMF spore diversity in fluvo-aquic soil under different fertilizations

表1 不同施肥对土潮土枝菌根真菌孢子多样性的影响 Table 1 Effects of different fertilization on AMF spore diversity in fluvo-aquic soil under different fertilizations 指标 Index Control 1/2OMN OM NP NK PK NPK 孢子密度 Spore density 269 ab 235 ab 216 a 380 d 295 bc 360 cd 399 d 平均种类 Average types 22.8 c 16.3 ab 15.3 a 16.8 ab 16.0 ab 17.0 ab 18.8 b 总的种数 Total number 27 18 18 22 20 19 23 注（Note）：数值后不同字母表示差异显著 (P < 0.05) Different letters indicate significant differences at the 0.05 level.

不同施肥处理下潮土中AMF群落组成如图4^[3]所示。与缺磷施肥NK和不施肥的Control相比，长期施用磷肥，如NP、NPK和OM，均显著减少了AMF的丰富度，其中就具体物种而言显著降低了Acaulosporacea和Gigasporaceae的比例。

图4(Fig. 4)

图4 不同施肥下潮土丛枝菌根真菌物种组成 Fig. 4 The species composition of AMF in fluvo-aquic soil under different fertilizations

主成分分析 (PCA) 更直观地展示AMF群落结构对不同施肥处理的响应 (图5a)^[3]。沿着PCA横坐标 (贡献率为88.2%)，不施磷肥的NK和Control与施磷肥的NP、NPK和OM显著分离。该现象说明磷肥是潮土中AMF群落结构分异的主要原因。随后，我们关联了环境变量，如土壤pH值、土壤有机碳 (SOC) 和全氮 (TN) 含量、有效钾 (AK) 和有效磷 (AP) 含量、土壤微生物生物量、酶活性等和AMF群落结构的变化 (图5b)^[3]，进行了典范对应分析 (Canonical correspondence analysis，CCA)，以揭示各个土壤理化性质对AMF群落结构变化的影响，以及AMF群落结构变化后对土壤微生物特性的影响。CCA显示施用磷肥 (NP、NPK和OM) 提升了土壤地力，为作物带来更多的养分；因此，作物对AMF的依赖性下降，进而会“舍弃”部分AMF，例如Gigaspora、Acaulospora和Scutellospora等，而将更多的光合产物分配给其它土壤微生物；该过程提高了土壤微生物生物量碳和多种酶活性，可促进土壤养分的循环过程。研究进一步发现，与土壤物理结构和有机质累积密切相关的易提取球囊霉素与总球囊霉素含量在施用磷肥特别是平衡施肥条件下显著增加 (图6)^[5]，且施用有机肥处理高于施化肥处理，这说明平衡施肥特别是施用有机肥，能够通过微生物过程改善土壤物理结构和促进土壤有机质的累积。

图5(Fig. 5)

图5 不同施肥下潮土丛枝菌根真菌群落结构的PCA分析 (a) 和CCA分析 (b) Fig. 5 PCA (a) and CCA (b) analysis of community structures of AMF in fluvo-aquic soil under different fertilizations

图6(Fig. 6)

图6 不同施肥下潮土易提取球囊霉素和总球囊霉素含量的变化 Fig. 6 The content variation of EE-GRSP and T-GRSP in fluvo-aquic soil under different fertilizations [注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars indicate significant differences at the 0.05 level.]

该部分研究揭示了对于缺磷潮土，长期施用磷肥，尤其是平衡施肥影响与根系共生的丛枝菌根真菌，影响了“生物地下交易”过程。磷肥施用缓解了潮土磷素的不足，使得作物对共生的微生物依赖性下降，导致土壤解磷微生物多样性下降，群落结构发生分异。由于作物是土壤微生物碳源的主要供给者，该过程暗示了更多源自作物的碳会分配给其他微生物，从而改善了潮土生物特性，利于潮土化学和物理特性，进而有助于潮土农田地力的可持续性。

有机质含量是农田土壤地力的最基本构成要素。在微生物的驱动下，土壤有机质始终处于积累与降解的动态平衡之中。研究发现潮土中磷素缺失对土壤碳累积产生了负面影响，即使在添加其他养分的处理中，如NK处理中，由于磷素缺失也使得其SOC含量低于含磷处理 (NP、NPK、OM和1/2OMN)(表2)^[3]。该结果和20年各处理间土壤有机碳含量的变化一致^[6]，证实了磷素在潮土碳循环中的重要性，即如果不施用磷肥，即使施用其它养分均不能增加土壤有机碳含量。

表2(Table 2)

表2 长期施肥潮土土壤理化性质的影响 Table 2 Effects of long-term fertilization on physical and chemical nature in fluvo-aquic soil under different fertilizations

表2 长期施肥潮土土壤理化性质的影响 Table 2 Effects of long-term fertilization on physical and chemical nature in fluvo-aquic soil under different fertilizations 处理 Treatment pH 土壤有机碳 SOC 全氮 Total N 有效钾 Available-K 有效磷 Available-P Control 8.87 ± 0.10 7.65 ± 0.81 0.33 ± 0.16 81.30 ± 4.81 0.05 ± 0.10 NK 8.72 ± 0.13 8.01 ± 0.95 0.42 ± 0.01 347.21 ± 12.64 0.00 ± 0.00 NP 8.68 ± 0.06 10.46 ± 0.29 0.57 ± 0.01 64.09 ± 1.91 9.39 ± 1.18 NPK 8.65 ± 0.12 11.34 ± 0.74 0.65 ± 0.04 175.04 ± 16.04 9.45 ± 2.27 OM 8.60 ± 0.09 18.98 ± 0.40 1.10 ± 0.04 177.91 ± 2.21 16.55 ± 0.90 1/2OMN 8.63 ± 0.06 14.20 ± 0.47 0.84 ± 0.03 155.91 ± 6.53 13.97 ± 1.25 PK 8.83 ± 0.05 9.38 ± 0.40 0.50 ± 0.01 326.17 ± 10.99 29.26 ± 2.89

由于碳是几乎所有微生物的能源，所以我们以微生物活性来表征微生物驱动的碳循环过程。在对碳转化过程相关微生物的研究中，我们首先利用微量热技术研究了磷素对土壤微生物代谢活性的影响。研究发现在缺磷处理 (Control、NK) 中土壤微生物生长速率慢，它们的热动力学曲线近似“死线”，具体表现为其微生物热释放值低、出峰时间晚 (图7a)^[7]。该现象说明潮土严重缺磷几乎可以抑制所有微生物的代谢活性。为了验证我们的判断，通过添加磷源的方式，可以使NK、Control处理受到明显的激活 (图7b)^[7]，再次说明了磷素的确是限制潮土微生物活性的重要因子。然而，补充磷素后土壤微生物总代谢热变高，即说明在缺磷潮土中微生物为了获取磷素，付出更多的能量，能耗更高，会消耗更多的碳源。

图7(Fig. 7)

图7 添加葡萄糖和硫酸铵 (a) 和添加葡萄糖、硫酸铵和添加 (或不添加) 磷酸二氢钠 (b) 后不同施肥处理潮土土壤微生物代谢热动力学曲线 Fig. 7 Power-time curves recorded microcalorimetry from soil samples amended with (a) glucose and ammonium sulphate and (b) glucose and ammonium sulphate, with or without sodium dihydrogen phosphate in fluvo-aquic soil under different fertilizations

由于促进了土壤微生物的代谢活性，磷肥施用显著增加了土壤微生物生物量碳、碳转化相关酶活性和微生物代谢活性 (图8)^[8–9]。与之对应，磷肥的施用增加了土壤基础呼吸强度，降低了微生物代谢熵值 (图9)^[9]。缺失磷肥的Control代谢熵最高，说明微生物代谢受到严重的缺磷胁迫。此外，衡量土壤微生物活性的单个细胞热散逸量 (Q_T/N₀) 也显示Control碳排放显著高于含磷施肥 (图10)^[7]。以上结果一致表明磷肥施用能够使潮土中微生物更“高效低排”地进行碳素转化。

图8(Fig. 8)

图8 不同施肥处理下潮土微生物生物量碳、转化酶与脱氢酶活性及微生物代谢活力的比较 Fig. 8 Soil microbial biomass C, invertase activity, dehydrogenase activity, dehydrogenase activity per biomass C in fluvo-aquic soil under different fertilizations [注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars indicate significant differences at the 0.05 level.]

图9(Fig. 9)

图9 不同施肥处理下潮土基础呼吸强度(a) 与微生物代谢熵 (b) 的比较 Fig. 9 Soil basal respiration (a) and metabolic quotient (b) in fluvo-aquic soil under different fertilizations [注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars indicate significant differences at the 0.05 level.]

图10(Fig. 10)

图10 不同施肥处理下潮土微生物单个细胞的热散逸量 Fig. 10 The heat output per cell unit (QT/N0) in fluvo-aquic soil under different fertilizations [注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars indicate significant differences at the 0.05 level.]

该部分研究内容说明对于缺磷潮土，磷肥施用能够提高微生物生物量碳、转化酶活性、呼吸强度及微生物碳代谢活性，且土壤微生物代谢熵与代谢热显著降低，使之能够保障潮土养分转化与作物养分吸收，增加潮土综合碳汇效应，“高效低排”地为生态系统服务；相反，不施磷肥条件下，土壤微生物不仅代谢效率低下，而且代谢过程会散逸相对多的热量、排放相对多的CO₂，不利于潮土碳累积，导致潮土质量明显下降。

氮素是农田生态系统最重要的养分之一，它对作物和微生物的生长，以及生态功能的发挥都有重要的作用。土壤微生物是农田生态系统氮素转化的驱动者。如前文所述，土壤中碳、氮、磷循环是一个有机的整体，磷素盈亏对潮土碳循环过程及其微生物都有显著影响，因此也必将影响氮循环相关微生物的多样性和功能，进而改变潮土氮转化过程。而这些过程的改变也必将反映于潮土碳循环和土壤肥力上。

在封丘潮土农田生态系统养分平衡长期定位施肥试验运行近20年后，不同施肥处理土壤的总氮含量如图11所示。含磷施肥OM、1/2OMN、NPK和NP处理土壤全氮含量显著高于缺磷的NK和Control处理^[10]。与1989年长期试验开始时的土壤全氮含量相比，经过18年，OM、1/2OMN、NPK和NP处理显著增加了土壤全氮含量 (表3)，但是不施磷肥的NK处理，尽管长期向土壤中施入氮肥，土壤全氮含量与长期不施肥对照 (Control) 相似，均低于18年前，降幅达8.8% (表3)。可能的原因：一是由于缺磷严重抑制了潮土上作物的生长，导致大量的无机氮存留于潮土中，加剧了其他形式氮的损失，尤其是气态氮损失，如氨挥发、氧化亚氮排放等，从而导致严重的氮素分馏效应 (图11)；二是由于土壤碳氮比基本不变，缺磷不利于潮土碳的积累，也同时会影响到土壤中氮素的截留。因此从氮素高效利用和环境保护角度出发，对于缺磷潮土，必须在施用氮肥的基础上合理地添加磷肥才能更好促进作物生长和减少氮素损失。

图11(Fig. 11)

图11 长期不同施肥对潮土全氮及其15N丰度的影响 Fig. 11 Total N contents and δ15N of soils in fluvo-aquic soil under long-term different fertilizations [注（Note）：方柱中和折线上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters in the middle of bars or above symbols denote significant differences at the 0.05 level.]

表3(Table 3)

表3 长期施肥潮土全氮含量与试验开始时比较 Table 3 Total N content compared with the beginning of the test in fluvo-aquic soil under long-term different fertilizations

表3 长期施肥潮土全氮含量与试验开始时比较 Table 3 Total N content compared with the beginning of the test in fluvo-aquic soil under long-term different fertilizations 处理 Treatment 2007年比1989年 增减幅度 Changes from 1989 to 2007 与1989年差异 Difference with 1989 OM +148% * 1/2OMN +79% * NPK +32% * NP +18% * PK +1.35% ns NK –8.8% * Control –12% * 注（Note）：1989 年试验开始前土壤全氮含量为 0.45 g/kg The soil total nitrogen is 0.45 g/kg before the experiment in 1989. *—P < 0.05；ns —不显著 Not significant.

为了揭示不同施肥处理下潮土氮素转化过程差异的微生物学机制，我们对土壤脲酶和微生物生物量氮进行了分析 (图12)^[11]。施用磷肥增加了潮土有机氮的输入，促进了潮土微生物生长进而提高了微生物生物量氮与脲酶活性，而缺磷处理的作用均没有达到显著水平。尤为关注的是，不施磷肥的NK处理不仅脲酶活性未显著提高 (图12a)，微生物生物量氮甚至趋于下降 (图12b)。该现象和表3中NK处理土壤全氮含量下降相一致，也说明在缺磷土壤中，必须在施用氮肥的基础上合理添加磷肥才能更好地促进土壤微生物的作用及微生物驱动的氮素循环过程。

图12(Fig. 12)

图12 长期不同施肥对潮土脲酶活性 (a) 与土壤微生物生物量氮 (b) 的影响 Fig. 12 Effects of long-term fertilization on fluvo-aquic soil urease activity (a) and soil microbial biomass (b) [注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars indicate significant differences at the 0.05 level.]

该部分研究表明，必须在施用氮肥的基础上添加磷素才能改善潮土氮素循环微生物活性和促进潮土供氮能力。如果不补充磷肥，长期施用氮肥不仅不能促产增效，还会加剧环境的污染。因此，对于潮土，科学施用氮肥的前提是合理地添加磷肥，才能更好地促进作物生长、减少环境污染和提升土壤肥力。这些发现有助于指导科学施肥，有效提高华北平原氮肥利用率和增产效果，同时也可缓解农田氮素损失及其对环境的压力。

前面的研究发现磷素缺乏使得潮土有机碳难以累积。微生物是土壤碳累积的关键因子，通过揭示缺磷潮土微生物学特性有助于揭示其中的机理。此外，由于有机碳是土壤养分循环的源动力，我们设想外源碳的投入可以通过微生物增殖而活化潮土磷素。因此，我们选择典型丰磷 (NPK) 和缺磷处理 (NK) 的潮土，研究潮土缺磷对碳转化相关微生物的影响，以及添加外源碳对潮土磷素及其相关微生物的影响^[12]。分别在缺磷和丰磷潮土中添加外源葡萄糖，测定70天内CO₂排放量，微生物数量、多样性和群落结构变化，计算外源碳的截留、有效态磷含量。结果表明，缺磷潮土本底碳矿化速率显著低于丰磷土壤处理 (图13a)，即缺磷显著降低土壤基础呼吸。但是葡萄糖净矿化结果却相反 (图13b)，即缺磷土壤中有更多的外源碳被矿化^[12]。

图13(Fig. 13)

图13 CO2-C累积排放量(a) 和累积净矿化量 (b) Fig. 13 Cumulative CO2 emissions from incubated soils and net C mineralization from added glucose [注（Note）：NK—缺磷土壤不添加葡萄糖Soils without glucose addition under P-deficiency；NPK—丰磷土壤中不添加葡萄糖Soils without glucose addition under P-sufficiency; NKG—NK土壤中添加葡萄糖Soils with glucose addition under P-deficiency；NPKG—NPK土壤中添加葡萄糖Soils with glucose addition under P-sufficiency；内置图Inset—0～8小时的CO2-C累积排放量和累积净矿化量Cumulative CO2 emission and net C mineralization from 0 to 8 h. *—P < 0.05; **—P < 0.01; ns —不显著Not significant.]

外源碳的添加对土壤微生物丰度和多样性均产生了影响。添加葡萄糖可以促进两种磷含量潮土中微生物的增殖，但缺磷土壤中微生物生物量低于丰磷土壤 (图14)^[12]。多样性指数响应上两个处理也存在差异。添加葡萄糖两天后，丰磷土壤处理中微生物多样性下降得更多；70天后，缺磷土壤多样性恢复至起始状态，丰磷土壤虽有恢复但依然低于起始状态。

图14(Fig. 14)

图14 添加葡萄糖培养0天、2天和70天后的细菌16S rRNA基因拷贝数(a) 和Simpson指数 (b) Fig. 14 Bacterial 16S rRNA gene copy number (a) and Simpson index (b) of incubated soils at 0, 2 and 70 days after glucose addition [注（Note）：方柱中**表示NKG和 NPKG处理间差异显著(P < 0.01)；方柱上不同字母表示不同培养时间差异显著（小写字母表示P < 0.05，大写字母表示P < 0.01） ** inside bars denotes significant differences between treatments NKG and NPKG (P < 0.01, t-test). Different letters above bars denote significant differences among 0 d, 2 d and 70 d (lowercase letters, P < 0.05; capital letters, P < 0.01).]

主成分分析结果清楚地显示了细菌群落结构对葡萄糖刺激和磷有效性的响应。在三个采样时期，缺磷土壤微生物群落结构均显著不同于丰磷土壤处理，且70天的群落差异最大 (图15)^[12]。此外，无论缺磷还是丰磷条件下，葡萄糖对微生物群落的影响都极其显著。群落最大的变异发生在0天和2天之间，70天后差异有所减小。该结果说明葡萄糖的添加迅速刺激微生物，导致微生物群落的巨大改变，而葡萄糖逐渐消耗完之后，群落结构趋向于回复到初始的状态。但是即使经过70天的培养，微生物群落依然与初始状态有显著不同。微生物群落结构在缺磷土壤中的恢复比丰磷土壤更为强烈。

图15(Fig. 15)

图15 添加葡萄糖培养0天、2天和70天土壤微生物群落结构主成分分析 Fig. 15 Principal component analysis (PCA) of the soil bacteria community at 0, 2 and 70 days after glucose addition

对初始状态土壤和添加葡萄糖培养70天的土壤进行了微量热分析 (图16)^[12]，发现缺磷显著抑制土壤微生物的活性。添加葡萄糖均显著刺激微生物的代谢活性，且缺磷土壤表现尤其明显，并且葡萄糖对其微生物的刺激作用至少可维持70天。该现象揭示葡萄糖的刺激作用复苏了缺磷土壤中微生物的代谢活性，可以长效缓解土壤缺磷对微生物活性的抑制。

图16(Fig. 16)

图16 添加葡萄糖培养0天、2天和70天的微量热曲线 Fig. 16 Power-time curves of incubated soils at 0 and 70 days after glucose addition

进一步对土壤有效磷和微生物生物量磷进行分析。在三个采样时间点，缺磷土壤有效磷含量都显著低于丰磷土壤 (图17)^[12]。添加葡萄糖后，有效磷含量迅速降低，而微生物生物量磷在葡萄糖添加两天后显著增加，在缺磷和丰磷土壤中分别提高245%和232%。第70天后，微生物生物量磷虽与第2天相比有所降低，但依然高于初始土壤，该现象在缺磷土壤中尤为明显。假设土壤有效磷和微生物生物量磷之和为土壤潜在有效性磷，那么葡萄糖的刺激作用显著增加了土壤潜在有效磷含量，且这种刺激作用在缺磷土壤中更为明显。

图17(Fig. 17)

图17 添加葡萄糖培养0天、2天和70天后各处理中有效磷和估计生物量磷含量 Fig. 17 Soil available P (AP) content and estimated microbial biomass P (MP) at 0 d, 2 d and 70 d afterglucose addition [注（Note）：不同天数比较，大写字母（小写）字母表示在P < 0.01 (P < 0.05)水平存在明显差异；NKG和NPKG比较，*—P < 0.05，**—P < 0.01，n.s. —无显著差异。With comparison among three dates, capital (lowercase) letters denote significant difference at P < 0.01 (P < 0.05) by one-way ANOVA. With comparison between treatments NKG and NPKG, * denotes P<0.05, **denotes P < 0.01 and n.s. denotes not significant by the t-test.]

微生物群落结构和功能变化的根源在于关键物种的响应。初始状态，在缺磷和丰磷土壤中主要微生物类群分布在变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和厚壁菌门。在丰磷土壤中主导群落变异的微生物主要是Bacillus属 (图18，A1)；在缺磷土壤中，四类主要微生物 (Paenibacillus属、Comamonadaceae科、Rhizobiaceae科、Pseudomonas属) 在添加葡萄糖后大幅度增加 (图18，A2)^[12]。这四类微生物都被报道具有解磷功能，它们在受到外源碳的刺激进行增殖后，有助于土壤磷素的活化。

图18(Fig. 18)

图18 添加葡萄糖培养0天、2天和70天各处理中细菌群落丰度 Fig. 18 Proportional abundance of bacteria at 0, 2 and 70 days after glucose addition [注（Note）：A—对葡萄糖刺激有正响应 (丰度提高)Positive response to glucose addition (abundance increased after glucose addition); A1—NKG中丰度增加量 < NPKG中的丰度增加量Rate of increase in the NKG treatment < NPKG; A2—NKG中丰度增加量 > NPKG中的丰度增加量Rate of increase in the NKG treatment > NPKG; B—对葡萄糖刺激无响应或负响应No or negative response to glucose addition; B1—最大丰度 > 5% Maximum abundance higher than 5%; B2—其余所有微生物总丰度All other abundances for these groups were summed.]

为了验证解磷微生物在外源碳刺激下是否被活化，我们结合BIOLOG和微量热两种技术来研究缺磷潮土中解磷微生物对碳源的响应^[13]。利用BIOLOG技术找到缺磷 (Control) 和丰磷 (OM) 土壤间微生物代谢能力发生分异的3种关键碳源，L-精氨酸，糖原，α-D-乳糖(表4)^[13]。将该3种碳源分别加入缺磷和丰磷土壤中，在缺磷土壤中添加糖原能显著提高微生物代谢活性，起到与补磷相似的效果 (图19a)，而在丰磷土壤中，糖原处理与葡萄糖处理的热动力学曲线重合度较高 (图19b)。糖原提高土壤微生物代谢活性的原因为它是一类解磷微生物 (phosphate-accumulating organisms，PAOs) 的碳源及能源物质^[14]。糖原的添加可以刺激PAOs将不可利用态的磷转化为生物可利用态，即提高了磷素的有效性。该结果证实了前面的研究，明确了添加外源碳能够刺激解磷微生物的功能，提高土壤潜在有效磷含量，达到添加磷素的效果。

表4(Table 4)

表4 与主成分1(PC1) 相关系数较高 (r > 0.5)的碳源 ( n = 3) Table 4 Substrates with high Pearson’s correlation coefficients(r > 0.5) for PC1 in the PCA of substrate utilization patterns of soil microbial community

表4 与主成分1(PC1) 相关系数较高 (r > 0.5)的碳源 ( n = 3) Table 4 Substrates with high Pearson’s correlation coefficients(r > 0.5) for PC1 in the PCA of substrate utilization patterns of soil microbial community 底物 Substrate r L-精氨酸 L-arginine 0.94 糖原 Glycogen 0.58 α-D-乳糖 α-D-lactose 0.53 注（Note）：土样采自河南省 Soil sample collected from Hennan Province.

图19(Fig. 19)

图19 缺磷 (Control)(a) 和丰磷 (OM)(b) 潮土的微量热代谢图谱 Fig. 19 Power-time curve profiles for control (a) and OM soils (b)

本研究结果表明，长期缺磷使得外源碳经由微生物转化进入土壤有机碳库的比例少，即外源碳消耗比例高，不利于潮土对碳的积累，更多的碳会以CO₂的形式进入大气。但是，外源碳的添加能够长效刺激缺磷土壤中微生物的增殖，特别是刺激解磷微生物的代谢和生长。该过程可以使土壤化学固持的磷素转移到微生物体内，增加了土壤中潜在有效磷含量，后续可以提供给植物利用。综上所述，我们提出了潮土微生物驱动的碳磷交互初步设想：缺磷使得潮土微生物会消耗更多的外源性碳，即“缺磷耗碳”；向缺磷潮土中添加碳源物质，可以加速微生物周转，激活磷素循环的关键微生物物种，提高土壤磷的有效性，达到“增碳活磷”的效果。

土壤碳、氮、磷、硫、铁等关键元素的生物地球化学循环过程、耦合机理及驱动机制研究是土壤生物学研究的核心之一。解析土壤养分耦合循环的微生物驱动机制，不仅是深入理解土壤基本生态过程 (如土壤有机质的分解与积累、土壤硝化反硝化过程) 的重要突破口，也是指导科学施肥提高农田地力的理论基础。这给我们提出更高要求的科学目标和任务，激励我们去应对和挑战。

第一，土壤微生物理论体系需扩容。亟需在更高的层面来总结当前实验科学的认知。技术和方法的进步使得农田土壤微生物的研究试验取得了丰富的结果，这些发现还只是“管中窥豹”，比较零星化和碎片化，并且有些发现已经突破了之前的理论，需要一个更高的理论框架来综合和提升，例如科学施肥下农田土壤微生物群落的构建机制，物种间的交互机制和核心物种的进化机制，从热动力学平衡来解析物质转化 (或元素间电子传递) 的微生物学过程。这就需要我们引入其他学科，如群落生态学、进化生物学和物理化学等的理论，借鉴这些学科已有的理论基础，构建新的理论框架，并利用新的理论体系更全面地揭示微生物在农田生态系统中，特别是在农田土壤养分耦合循环中的重要作用。

第二，对土壤微生物介导的养分循环耦合性的认识需深化。农田土壤养分循环耦合性虽逐步受到重视，但仍处于起步阶段，更多工作需要细化和深化。今后应关注不同土壤类型异同性和多种元素循环过程间的耦合性和整体性；在关注碳氮磷等主要元素的同时，也需关注微量元素；关注元素耦合间的电子传递过程；关注元素耦合代谢的新途径以及发掘关键微生物物种和专性基因等；阐明同一营养层内和不同营养层间微生物互作与养分循环耦合性的驱动机制；揭示地上–地下协同作用对养分生物有效性的影响与互馈，最终达到通过定向调控微生物群落结构和功能，增加养分固持和持续供应能力，提高养分利用率。

第三，土壤微生物研究方法学需提升。学科的发展一直依赖于研究方法的改进和突破。近年来，土壤微生物学研究领域的迅猛发展得益于分子生态技术的发展和应用，但是相对于其他学科研究，土壤微生物研究方法仍相对落后。这需要我们继续借鉴生态、物理、化学、数学、计算机和工程等领域的先进技术和理念，拓展产生新的微生物研究方法与技术。今后应采用多种微生物组学研究的新技术和新方法，研究农田养分耦合循环的微生物多样性、群落结构、进化关系及与环境间相互作用关系；建立土壤养分耦合循环的微生物学评价技术和指标，以及完备的土壤微生物研究数据库服务云平台；在常规筛选菌种资源的基础上，关注高通量筛分筛选等新技术，在基因水平和细胞水平上提高筛选的成功率和菌种资源的获得率，以建立土壤养分耦合循环的关键微生物种的资源库和基因库。

第四，长期试验平台建设需重视。农业生态系统中很多生态过程的进展相当缓慢，短期试验不能揭示生态过程的变化趋势。只有持续稳定的长期定位试验才能揭示生态过程的演变机制，促进生态学理论的发展，提供科学合理的施肥参数和资源优化管理。因此，我们必须重视长期试验平台的建设和维护。

致谢:特别感谢中国科学院封丘农业生态试验站对本课题组工作的大力支持！感谢本课题组胡君利副研究员和王俊华实验师，青岛科技大学王发园教授，南京信息工程大学徐江兵老师在此工作中做出的贡献。