锌是植物必需微量元素，参与植物体内碳水化合物代谢、蛋白质合成、调节生长素代谢^[1–2]。缺锌影响植物根系生长发育^[3]。1985年，Cumbus在营养液中培养小麦植株，发现缺锌植株根冠比增加，侧根数量和长度明显增加^[4]。Genc等进行土培试验发现，缺锌时大麦根系变长^[5]。Widodo等研究表明，缺锌水稻根系发育受阻，节根数目减少，但节根伸长并未下降^[6]，Richard等报道，拟南芥27个品系的主根和侧根生长受到供锌影响效应不同，缺锌抑制拟南芥侧根发育^[7]。

植物体内生长素 (吲哚乙酸，即IAA) 合成主要存在两条途径，即依赖于色氨酸的合成途径与不依赖于色氨酸的合成途径。前一种途径来源于色氨酸的代谢产物，而后一种途径来源于色氨酸的前体—吲哚–3–甘油磷酸^[8–9]。缺锌植物体内生长素含量明显下降^{[1, 10]}。1948年Tsui发现IAA的合成前体—色氨酸的合成需要锌，缺锌时色氨酸含量降低，从而导致IAA合成减少；缺锌引起生长素下降的另一个原因可能是，缺锌植物体内活性氧自由基增多，IAA被氧化降解^{[1, 10]}。Widodo等发现，缺锌胁迫下水稻节根数目减少，但锌高效水稻品种RIL46能维持较好的根系生长能力，体内编码生长素反应蛋白OsIAA7 (Os02g13520) 和生长素诱导蛋白pCNT115 (Os04g26870和Os04g27060) 基因表达水平较高^[6]。

生长素影响植物根系生长发育^[11–12]。外源生长素IAA和IBA施用增加，水稻种子根长度逐渐变短^[13]。以拟南芥为模式植物，大量研究表明生长素是调控侧根发生发育的重要激素物质，影响侧根发生过程的各个时期^{[11, 14–15]}。对生长素刺激缺乏敏感性的突变体如aux1、alf4、axr1、axr4、axr6、pxa1、iaa28等表现为侧根数量减少，相反内源生长素水平高的突变体alf1和sur1侧根数量则显著增加。外源施加生长素可促进侧根的发育。生长素从地上部向根部的极性运输影响拟南芥侧根的生长发育。外源施用抑制生长素极性运输的化学物质—萘基邻氨甲酰苯甲酸 (NPA) 明显抑制侧根的形成。对NPA有抗性的突变体tir1和tir4侧根数量明显减少^[14]。生长素信号转导途径主要包括生长素受体 (F-box蛋白TIRl/AFB1/2/3)、Aux/IAA蛋白、生长素响应因子ARFs和泛素连接酶复合物SCFTIRl/AFB1/2/3。生长素通过与生长素受体结合，促进SCFTIRl/AFB1/2/3对Aux/IAA泛素化，Aux/IAA蛋白被26S蛋白酶降解，激活生长素响应因子ARFs (auxin response factors)，调节下游侧根发育形成的目标基因转录，促进侧根发生^[16–17]。

生长素主要在地上部生长点和根尖合成。根系内生长素极性运输包括向顶运输和向基运输。向顶运输是指茎部产生生长素从根茎交界处向根尖方向的运输，向基运输是指茎端运输到达根尖的部分生长素及根部自身合成的生长素从根尖顶端向基部根茎交界处的运输。生长素运输到达根系伸长区后，重新进入维管系统。在根尖，生长素在中柱中向下运输，而在皮层组织中逆转，形成一种被称为“倒伞”的现象^[18–20]。极性运输主要通过对细胞中极性分布的生长素输入和输出转运蛋白进行调控，转运蛋白协同作用，形成生长素浓度梯度，从而调节植物细胞的生命活动与植物根系生长发育^[19]。目前发现的生长素转运蛋白主要有五种，分别是负责向细胞内转运蛋白AUX1 (AUXIN-RESISTANT1)/LAXs (AUX1-LIKEs) 蛋白家族^[21]、向细胞外转运蛋白PINs (PIN-FORMEDs) 蛋白家族和ABCB (ATP-binding-cassette B)/PGP (P-glycoprotein) 蛋白家族^[22]、介导细胞内转运蛋白家族PILS (PIN-LIKES) 及定位于液泡膜介导由细胞质与液泡间生长素转运蛋白WAT1 (WALLS ARE THIN1)^{[18–19, 23]}。

玉米是对缺锌敏感的作物。玉米为须根系植物，根系由种子根、节根、不定根组成的轴根及其上侧根组成^[24–25]。缺锌引起植物体内生长素含量下降，但是对缺锌胁迫下，生长素在根系的分布及相关转运蛋白编码基因的表达特征，缺少深入研究。本试验选择玉米品种郑单958为供试作物，进行营养液培养，研究缺锌胁迫下玉米根系中生长素的分布及编码转运蛋白ZmAUX1和ZmPIN1基因的表达，以期揭示缺锌胁迫玉米根系生长素运输与含量分布特征及对根系生长的影响。

1 材料与方法 1.1 植株培养

以玉米品种郑单958为试验材料，选取饱满一致种子经10% H₂O₂浸泡消毒15 min，超纯水冲洗3遍，浸泡24 h后，转移到铺有湿纱布的培养皿中，上盖一层湿纱布，25℃黑暗中催芽1 d。选择发芽一致的种子放入洗净的石英砂中，在培养箱中25℃下育苗。一周后，选择长势一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL玻璃培养管中，每管1株，培养管直径5 cm，高20 cm，外用黑色布包裹避光，超纯水培养1 d，后转移至营养液中培养。培养在光照培养箱进行，控制条件：光照时间12 h，光照强度18000 Lux，白天温度25℃、夜间20℃，相对湿度70%。

基础营养液配方 (mol/L)：Ca(NO₃)₂ 2.0 × 10 ^–3、K₂SO₄ 7.5 × 10 ^–4、MgSO₄ 6.5 × 10 ^–4、KH₂PO₄ 2.5 × 10 ^–4、EDTA-Fe(Ⅱ) 1.0 × 10 ^–4、H₃BO₃ 1.0 × 10 ^–6、CuSO₄ 1.0 × 10 ^–7、(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 5.0 × 10 ^–9。设置缺锌 (0 μmol/L) 和正常供锌 (1 μmol/L) 两个处理，代号分别为–Zn和+Zn。锌以ZnSO₄形式供给，每个处理6次重复。营养液pH用NaOH或HCl调至6.0，每隔两天更换一次营养液。

1.2 根系形态测定

处理培养20 d后，收获根系，保存于FAA固定液 (70%酒精∶38%甲醛∶乙酸体积比 = 90∶5∶5) 中待测。测定时，在盛有清水的有机玻璃盘中将根系平展，用直尺测量初生根和节根长度，并对初生根和节根进行计数。统计初生根上的侧根数量，以伸出根表3 mm (肉眼可见) 为侧根标准，单位长度 (cm) 初生根上侧根总数为侧根密度。

利用扫描仪 (EsponV 700) 扫描根系样品获取数字化图像，利用WinRHIZO根系分析系统 (Regent Instruments Inc.，Canada) 对图像进行分析，获得总根长、根系直径、表面积、不同直径范围内根系长度。

1.3 锌含量测定

收获植株地上部和根系，用超纯水洗涤根系多次，105℃下杀青30 min，70℃烘干至恒重，称量干重。干样用HNO₃–H₂O₂消煮，原子吸收分光光度计 (ZEEnit 700P，德国耶拿分析仪器股份公司) 测定消煮液中Zn浓度。

1.4 生长素测定

用超纯水洗涤根系多次，取种子根距离根尖1和2 cm区段，按照Ljung等^[26]所述的方法，80%甲醇提取，纯化过柱，三甲基硅烷化重氮甲烷己烷甲酯化，采用气相色谱–质谱联用仪 (型号：Agilent，7890A/5975C) 测定。测定条件：毛细柱型号Agilent 19091S-443 30 m × 250 μm × 0.25 μm；色谱柱升温起始温度100℃，以20℃/min速度升至280℃后保持1 min，250℃进样，不分流模式，进样体积1 μL。

1.5 生长素运输关键基因表达检测

1.5.1 总RNA提取　培养15 d后，取种子根上距离根尖3 cm组织放入研钵中，用液氮研磨至粉末。按天根生化科技 (北京) 有限公司的植物总RNA提取试剂盒 (DP432) 说明书进行RNA提取。用普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1.5.2 cDNA合成　使用Biotool公司All-in-One cDNA Synthesis SuperMix，产品号B24403。步骤如下：

1) 在离心管中加入 (冰上操作) RNA溶液623 ng (6 μL)、All-in-One cDNA Synthesis SuperMix 4 μL、RNase-free Water > 20 μL；

2) 将EP管内液体混匀并在42℃条件下孵育15 min；

3) 在85℃条件下孵育2 min将All in one逆转录酶失活，并在冰上冷却至室温。保存于–20℃，作为基因扩增及实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 的模板。

1.5.3 引物设计　用软件Primer 5.0设计目的基因ZmAUX1和ZmPIN1c以及内参基因β-actin引物，由中美泰和公司合成。引物序列如下：

ZmAUX1-F：5′-CATCCCCTCCTTCCACAACT-3′

ZmAUX1-R：5′-TCGCGTGCATGATCTCCACT-3′

ZmPIN1c-F：5′-TACATCATCTGGTACACGCT-3′

ZmPIN1c-R：5′-TATCCTGCCGTCCTCCCTGA-3′

β-actin-F：5′-TGCCTACGTTGCCCTTGATT-3′

β-actin-R：5′-TACGGCCTCATGGACGCT-3′

1.5.4 qRT-PCR　采用Biotool公司的2x SYBR Green qPCR Master Mix预混合试剂，按下列组份配置成PCR反应液 (冰上进行，体积量为20 μL)，利用荧光定量PCR仪 (型号：LineGene9600 Plus，博日科技公司) 检测。在微量离心管中配置下列反应液：模版cDNA溶液1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、2x SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL、dd H₂O补充到20 μL。PCR反应条件为 50℃ 2 min，95℃ 2 min，然后95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s进行40个循环，72℃终延伸10 min，4℃保存。

1.6 数据处理

通过t检验比较两个锌处理数据之间的差异，Duncan检验比较两个锌处理和两个根区域IAA含量数据之间的差异。

2 结果与分析 2.1 生物量和含锌量

培养15 d后，缺锌处理植株出现明显缺锌症状：地上部矮化，节间缩短，叶片变小，新叶基部出现白化或黄化，20 d后，叶片出现坏死性褐色斑块。

据表1可知，缺锌处理15 d的植株地上部与根系干重明显降低，根冠比增大。不施锌植株地上部和根系中锌含量明显降低。

2.2 根系形态

缺锌处理15 d的玉米根系生长状况如图1所示。表2数据表明，根系的总根长、根表面积、根体积、根系直径均下降，根系发育明显受抑。侧根总长、平均侧根长缩短，侧根密度增加。

缺锌条件下，0.45～1.05 mm和 ≥ 1.05 mm直径范围内的根系长度明显减少，≤ 0.45 mm直径范围内的根系长度与正常供锌处理之间无明显差异，但在总根长中所占比例增加，表明根系变细 (表3)。

2.3 根系生长素含量

如图2所示，缺锌条件下，距根尖1 cm根系区域中生长素含量与正常供锌处理之间无显著性差异，而距根尖1～2 cm的根系区域中生长素含量较正常供锌处理降低约30%。正常供锌条件下，靠近根尖部分生长素含量较远端降低，而缺锌条件下，距离根尖0～1 cm与1～2 cm区域中生长素含量差异不大。

2.4 ZmAUX1、ZmPIN1c表达

2.4.1 总RNA提取结果　利用试剂盒法提取总RNA，核酸测量仪测定结果表明，缺锌处理和加锌处理的OD 260/280值分别为1.92和1.98，但缺锌处理总RNA浓度较低，为530.1 ng/μL，而加锌处理为1180.1 ng/μL。琼脂糖凝胶电泳结果 (图3) 显示，无DNA和蛋白质污染，效果良好，RNA无明显降解。

2.4.2 实时荧光定量PCR结果　缺锌处理下，根系中编码ZmPIN1c和ZmAUX1基因表达明显受到抑制 (图4)，这可能导致生长素极性运输受阻。

3 讨论与结论

锌是植物必需微量营养元素。植物正常Zn含量为25～150 mg/kg (干重)。当Zn含量低于20 mg/kg时，植物可能表现出缺锌症状^[1]。根系Zn含量较地上部高^[1]。本试验缺锌处理下的郑单958植株地上部Zn含量低于10 mg/kg，低于缺Zn临界水平。缺锌导致节间缩短，植株矮化，新叶基部出现失绿或白化。1 mmol/L适量锌供给明显改善玉米生长，地上部生物量显著提高。

良好的根系形态和生理特性对植物高效吸收利用土壤锌具有重要意义^{[2, 6, 27–28]}。汪洪等^[27]试验表明水稻根系形态和构型变化影响植株Zn吸收积累及体内Zn利用效率。利用盒维数法结合根系图像分形分析程序法研究发现分形维数和分形丰度与植株地上部干重、单位Zn浓度所产出的地上部生物量、地上部Zn吸收量之间呈显著正相关关系。Dong等^[28]报道，Zn高效小麦品种Excalibur与Zn低效硬粒小麦品种Durati相比，直径 ≤ 0.2 mm细根在总根长中比例较高。细根比例高，根系比表面积增加，有利于提高植物对土壤中锌的吸收。本试验发现，缺锌抑制玉米根系发育，其总根长、总根表面积、总根体积、直径、总侧根长、平均侧根长均下降，0.45～1.05 mm和 ≥ 1.05 mm直径范围内的根系长度减少，≤ 0.45 mm直径范围内根系在总根长中所占比例增加。

缺锌植物体生长素含量下降。生长素是由细胞快速分裂的组织合成，如茎尖、幼嫩叶片、根尖。在植物体内，以色氨酸为前体，通过若干途径合成IAA。根据主要中间产物可以把IAA合成的色氨酸途径分为吲哚–3–丙酮酸途径、吲哚–3–乙醛肟途径、色胺途径和吲哚-3-乙酰胺途径四条支路^[29]。缺锌植株体内色氨酸含量降低，使得IAA合成途径受阻，IAA含量下降；也有人推断，IAA含量的降低是因为缺锌导致氧自由基含量增加，IAA氧化降解增加^[1]。

生长素极性运输表现为在茎中生长素向基部运输，在根中向根尖运输，这一现象被认为是生长素转运蛋白在质膜上的极性分布所致^[21]。IAA进入细胞需要AUX1蛋白协助，IAA经PIN转运蛋白作用才能运出细胞^[21]。PIN成员通过不同的表达模式以及细胞极性分布使得生长素精细的时空分布能够在特定的细胞类型或细胞层中得以实现，负责调控地上部IAA向基运输以及根中IAA的向顶运输。PIN1定位于初生维管组织，在根的表皮和皮质中也存在表达。PIN1、PIN2、PIN3、PIN4、PIN7共同调控根分生组织的发育。PIN1主要负责将到达根尖后的生长素与根尖合成的生长素向顶运输^[22]。本研究发现，缺锌的玉米根尖生长素含量明显降低，且较正常供锌处理相比，玉米根尖并未产生IAA浓度梯度差；同时发现转运蛋白编码基因ZmAUX1和ZmPIN1c表达相对较弱，这可能会影响在根系中的极性运输，生长素浓度梯度分布紊乱，从而影响根系发育生长。

缺锌条件下，ZmAUX1和ZmPIN1c基因表达较少，原因可能与缺锌影响植物体内RNA含量有关。植物缺锌时体内RNase酶活性提高，RNase降解RNA，造成RNA含量降低^[1]。RNA聚合酶含有锌^[1]，该酶保护核糖RNA免造降解，缺锌时该酶活性降低。锌与植物体内蛋白合成也有密切关系，锌能保持核糖核蛋白体完整性^[1–2]。转录因子锌指蛋白含有锌，锌指蛋白主要功能是与特定的靶DNA或靶蛋白结合从而参与基因的表达的调控，影响蛋白质合成，缺锌可能会使锌指蛋白含量降低^[1]。

综上所述，玉米缺锌导致根系内生长素含量下降，根系中生长素运输蛋白编码基因ZmPIN1c和ZmAUX1表达减弱，生长素在根系中浓度分布梯度变化，从而影响根系生长发育，但仍需要进一步通过生长素及其转运蛋白分布和功能的精细定位开展研究。