反硝化过程是土壤氮损失的主要途径之一，而且该过程产生的N₂O和NO会给环境带来危害。其中，N₂O是重要的温室气体，与全球气候变暖和臭氧层破坏密切相关^[1–2]；而NO是一种具有高度活性且有毒的化合物，会损耗臭氧^[3]和污染空气^[4]，同时，NO经光化学氧化和水合作用生成HNO₂和HNO₃，对土壤和水体系统酸化产生影响^[5]。农业活动占全球人为活动排放N₂O和NO总量比例分别约为60%和10%^[6]。以我国农田土壤为例，其N₂O直接排放量为4.74 × 10 ⁵ t，占全国N₂O排放的55.8%^[7]。大量研究表明N₂O和NO的排放与氮肥的施用密切相关，施用氮肥后增加土壤N₂O和NO的排放量^[8–11]。

我国设施蔬菜种植系统中，农户为了追求高产，过量施用化学氮肥。大部分地区设施菜田每季化肥氮素投入量通常会超过1200 kg/hm^2[9]，约为小麦、玉米田的2～7倍^[10–12]。除了大量施用化学氮肥外，有机肥料的投入量也很大。以寿光设施菜田为例，有机肥年均施用量高达177 t/hm^2[13]。此外，该地区设施菜田全年灌溉水总量在748～1957 mm之间，平均灌溉量高达1307 mm^[14]。这些都为土壤反硝化微生物提供了大量的底物和适宜的环境条件，进而促进反硝化作用的发生和N₂O的大量排放。据估计，我国设施菜田反硝化年损失量可达N 45.8 kg/hm^2[15]，反硝化过程对N₂O排放总量的贡献率可达22.5%～57.7%^[16]。由于方法原因，土壤反硝化氮损失的直接定量测定比较困难。已有研究表明，利用反硝化产物比和大量的N₂O田间观测数据，可以估算土壤反硝化损失^[17–18]。

众所周知，土壤中每1 mol的NH₃-N氧化为NO₃^–-N即可释放1 mol质子，在没有生物利用的情况下，成为导致土壤酸化的重要原因之一。同时，在土壤根际微域环境中，根系对阳离子的吸收超过阴离子时产生的酸性分泌物也会造成土壤局部酸化。已有研究表明，设施菜田每年仅由施肥产生的土壤酸化潜势就超过H⁺ 220 kmol/hm^2[19]，相同区域设施菜田土壤pH值比粮田土壤低0.5个单位^[20]。土壤pH值的降低会显著影响反硝化的损失量^[21–22]和气态产物比的变化^[23]。而且，设施菜田表层土壤的可溶性有机碳含量显著高于农田土壤^[24]，这有利于其形成土壤微域厌氧环境。设施菜田通常底施大量的有机肥和大水漫灌，在生长季初期 (1到2周内) 也会产生较大范围的厌氧环境。有证据表明，施用有机肥后提高土壤水分含量，反硝化作用对N₂O的贡献可在64%～77%之间^[25]。

综上所述，土壤pH和有机碳是影响反硝化过程与N₂O排放的重要环境因子，它们之间存在着交互作用，但目前相关的研究较少、亟待深入。本研究选择pH下降明显、有机肥施用量很高的设施蔬菜集中种植区代表性土壤，通过在线连续监测的自动培养系统，研究外源碳加入和pH对反硝化产物比的影响，从而为探讨通过降低产物比以实现N₂O减排的措施提供理论依据。对土壤反硝化产物比及其影响因素的深入了解，又可为利用N₂O的田间观测数据准确估算土壤反硝化氮损失提供参考。

供试土壤采自中国农业大学山东省寿光市罗家村 (36°55′N，118°35′E) 设施菜田长期定位试验点。该地区年平均温度和降雨分别为12.4℃和558 mm。试验始于2004年2月，每年种植两季番茄，即每年2～6月为冬春季，8月至次年1月为秋冬季，7月份休闲。试验初始0—10 cm土层土壤理化性质为全氮1.37 g/kg，有机质18.3 g/kg，pH 5.7 (0.05 mol/L CaCl₂)，有效磷和速效钾含量均为299 mg/kg，有关试验点的更多信息可参见He等^[26]的研究。

在冬春季和秋冬季番茄移栽前，分别基施风干鸡粪8 t/hm²和10 t/hm² (约为N 146 kg/hm²和211 kg/hm²)，尿素作为追肥随灌溉水施用，每次用量为N 120 kg/hm²，冬春季为6次，秋冬季共5次。本试验以农户习惯施肥土壤作为供试样品，为避免鸡粪施用的影响，于2015年6月番茄最后收获期采集0—20 cm土壤样品，充分混合后用冰盒运回实验室，在4℃下保存备用。

原土壤硝酸盐的背景值过高，为比较初始C/NO₃^–比下土壤反硝化的产物比特征，同时也避免土壤高浓度硝酸盐造成NO测定出现超标的现象，本研究通过利用去离子水将土壤反复清洗4次，使土壤硝酸盐含量控制在50 mg/kg以下。待土壤水分自然蒸发至质量含水量10%～15%时，过2 mm筛，混匀后置于4℃下储存备用。称取一定质量的该土壤3份，将0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液均匀喷洒至过筛后的土壤中，每千克干土溶液添加量约为20～60 mmol^[27]，使调节的土壤pH分别在5.5、6.5、7.5左右。充分混匀后，将酸碱调节后的土壤置于20℃恒温培养箱中培养30 d左右，以保持土壤调节pH后的稳定性。培养结束后，测定各处理土壤实际pH和无机氮含量，土壤主要理化性质见表1。相同pH处理土壤，根据实际测定的硝酸盐含量添加一定质量的KNO₃以使土壤硝酸盐总量为N 50 mg/kg。同时，以谷氨酸钠 (C₅H₈NO₄Na·H₂O) 作为碳源，其添加量分别为C 214、643和1286 mg/kg，使添加的碳与土壤硝酸盐的比例 (C/NO₃^–) 分别为5∶1、15∶1、30∶1，未添加谷氨酸钠的处理作为对照处理 (CK)。

表1(Table 1)

表1 不同土壤pH下初始理化性质 Table 1 Initial soil physical and chemical properties with different soil pH

表1 不同土壤pH下初始理化性质 Table 1 Initial soil physical and chemical properties with different soil pH pH 全碳 (g/kg)Total C 全氮 (g/kg)Total N 铵态氮 (mg/kg)NH4+-N 硝态氮 (mg/kg)NO3–-N 5.63 ± 0.01 12.9 1.64 0 35.6 ± 2.7 6.65 ± 0.01 12.7 1.63 0 50.2 ± 1.6 7.83 ± 0.01 15.5 1.58 0 53.7 ± 5.0

分别称取相当于10.0 g烘干土重的新鲜土样于120 mL血清瓶中，根据已知的土壤硝酸盐含量和谷氨酸钠添加量配置一定浓度的溶液，将溶液用注射器加入至土壤中后，调节土壤质量含水量为25%。用橡胶塞和铝盖密封，并利用抽真空–充氦气系统 (北京帅恩科技有限公司) 反复用He (99.999%) 气冲洗血清瓶3次，最后充上He气。将所有血清瓶置于20℃恒温水浴槽中培养，平衡血清瓶内气压后，利用Robot自动培养系统每间隔8 h在线连续监测血清瓶内N₂O、NO、N₂和CO₂的浓度变化。每个处理均重复3次。

Robot自动培养系统包括自动进样和气体分析模块。其中自动进样模块包括双向旋转的蠕动泵 (Gilson Model 222，Gilson，法国) 和顶空自动采样器 (CTC GC-Pal)。气体分析模块由气相色谱 (Agilent 7890A) 和氮氧化物分析仪 (Model 200E，美国) 组成。而气相色谱中包含热导检测器 (TCD)、电子捕获检测器 (ECD) 和火焰离子化检测器 (FID) 3个检测器，能够监测N₂O (ECD、TCD)，N₂ (TCD)，CO₂ (TCD) 和O₂ (TCD) 气体浓度的变化。氮氧化物分析仪用来定量监测NO气体浓度。有关Robot自动培养系统的运行模块细节可参见Molstad等^[28]和McMillan等^[29]的研究。

土壤样品中NH₄⁺和NO₃^– 的含量用1 mol/L KCl溶液浸提后用连续流动分析仪 (TRACCS2000，德国) 测定。土壤pH值测定的水土比为2.5∶1，用pH计测定。土壤全氮、全碳含量利用碳氮分析仪测定 (Thermo Scientific Flash 2000 NC Analyzer，美国)。

气体数据计算根据在线监测的血清瓶中气体数值和已知标准气体浓度，计算相应气体每克干土的产生量。研究厌氧培养下反硝化产物比N₂O/(N₂O + NO + N₂) 的变化，以计算N₂O的产生量指数 ${ I}_{{{\rm N}_2}{\rm O}} $ ，计算公式如下：

其中：N₂O (t)、N₂ (t)、NO (t) 均为培养时间t下的累积产生量。时间t的选择依据是以N₂O产生速率为正值或N₂O产生量达最大值时作为终止时间基准，即利用从初始培养至达到N₂O最大累积产生量时的反硝化产物比均值进行比较。

试验数据采用SigmaPlot 12.5作图，利用SPSS 20.0分析软件进行单、双因素方差分析。

由图1整体来看，连续培养过程中土壤反硝化N₂O产生量变化明显，且随土壤pH的增加N₂O产生量显著减少。除未添加谷氨酸钠的对照处理 (CK) 外，其它3个不同初始C/NO₃^– 处理中N₂O产生量的动态变化过程相类似，均呈现先增加达到峰值后再减少的趋势。在pH 5.63条件下，初始C/NO₃^– 比为5∶1、15∶1和30∶1的处理中，N₂O产生量分别在144、120和128 h时达到峰值，且三者均差异不显著 (图1)。在中性条件下 (pH 6.65)，初始C/NO₃^– 比为5∶1、15∶1和30∶1的处理中，N₂O产生量分别在72、48和40 h时达到峰值，分别为N 1.05、0.71和0.43 μmol/g，三者差异极显著 (P < 0.01)。单从峰值来看，在土壤pH为7.83时，添加谷氨酸钠的3个处理均在连续培养32 h时达到峰值，且初始C/NO ₃^– 为30∶1的处理显著降低了N₂O的排放 (P < 0.05)。可见，中性和碱性土壤中添加有效性碳有利于减少反硝化过程N ₂O的产生，而酸性条件下添加有效性碳并不能降低N₂O产生量。

与N₂O类似，土壤反硝化NO的产生量也随土壤pH的增加而减少。在酸性条件下 (pH 5.63)，添加谷氨酸钠的处理均在培养96 h后达到峰值，且差异不显著 (图1)。未添加谷氨酸酸钠的处理 (CK)，NO的产生量较少且下降缓慢，导致其累积排放时间较长，这可能与土壤中可利用性碳不足导致缺乏电子供体有关。在pH为6.65的中性土壤条件下，初始C/NO₃^– 为5∶1的处理在培养64 h时NO产生量达到峰值，为N 0.81 μmol/g，分别是初始C/NO₃^– 为15∶1和30∶1处理峰值的1.74和1.55倍 (图1)。而在pH为7.83的碱性土壤中，NO的产生量均在培养24 h时达到峰值，且初始C/NO₃^– 为5∶1、15∶1和30∶1的处理间NO产生量差异不显著。可见，酸性和碱性土壤中有机碳的添加对NO产生量不会产生显著影响，而在中性条件下有机碳含量会降低NO产生量。

图1(Fig. 1)

图1 不同pH和初始C/NO3– 下土壤N2O和NO产生量的动态变化 Fig. 1 Dynamics of N2O and NO production during the anaerobic incubation from soil under different pH (acidic, neutral and alkaline) and C/NO3– levels

由图2可知，随着培养时间的延长不同土壤pH下各处理的N₂产生量均呈上升趋势，且添加谷氨酸钠后N₂产生量均达到稳定状态。由其平衡的时间来看，随着土壤pH的增加N₂O还原为N₂的速率显著加快。除pH值为7.83的碱性土壤外，N₂产生速率在pH为5.63的酸性土壤和pH为6.65的中性土壤中均随初始土壤C/NO₃^– 的增加而增大。可见，在一定程度上增加土壤pH值并同时向土壤中添加可利用性碳可促进反硝化过程中N₂O向N₂的转化，有利于减少温室气体N₂O的排放。

碳源为反硝化微生物提供反应所需的电子供体和能源，CO₂的产生量可间接反映微生物的活性。由图2可知，各pH土壤在添加有效性碳后，CO₂产生量均显著高于对照处理 (CK)，且在相同培养时间和初始C/NO₃^– 下，CO₂产生量随土壤pH的增加而显著增大 (P < 0.01)。酸性土壤中，连续培养256 h后对照处理CO ₂产生量为2.14 μmol/g，初始C/NO₃^– 为5∶1、15∶1和30∶1处理的CO₂产生量分别是对照处理的3.55、3.93和3.92倍 (图2)。在土壤pH为6.65条件下，连续培养136 h后，初始C/NO₃^– 为5∶1处理的CO₂产生量为5.69 μmol/g (图2)，且与初始C/NO₃^– 为15∶1和30∶1的处理均差异极显著 (P < 0.01)。碱性土壤中，在土壤连续培养112 h后，CO ₂产生量在添加有效性碳的不同处理间差异显著 (P < 0.05)。此外，随着pH增加，土壤的平均呼吸速率也明显增加。

图2(Fig. 2)

图2 不同pH和初始C/NO3– 下土壤N2和CO2产生量的动态变化 Fig. 2 Dynamics of N2 and CO2 production from three pH soils (acidic, neutral and alkaline) during the anaerobic incubation with different C/NO3– levels

由图3整体来看，反硝化产物比 ( $ {I}_{{{\rm N}_2}{\rm O}}$ ) 随土壤pH的增加呈极显著下降趋势 (P < 0.01)。初始培养至达到N ₂O最大累积产生量时，反硝化产物比均值与不同初始C/NO₃^– 下的土壤pH整体拟合线性方程为 $I_{{{\rm N}_2}{\rm O}} $ = –0.1132pH + 1.1018 (R² = 0.5711，P < 0.01)。而且，在相同初始C/NO ₃^– 下，反硝化产物比随土壤pH的增加而下降，在初始C/NO₃^– 比为5∶1和15∶1时产物比差异尤为显著 (表2，P < 0.01)。与对照相比 (CK)，相同土壤pH下添加不同比例的谷氨酸钠后产物比也出现显著的降低 ( 表2，P < 0.05)。

由表3可知，当N₂O达最大累积产生量时，土壤pH和C/NO₃^– 分别对N₂O产生量有极显著作用 (P < 0.001)，且二者交互效应极显著 ( P < 0.001)。同时，整体来看，在不同初始C/NO ₃^– 下各土壤pH对N₂O累积产生量影响显著 (P < 0.05)。而对于不同初始C/NO ₃^– 来说，与对照处理 (CK) 相比，添加有效性碳后，显著增加了土壤N₂O的产生，但高C/NO₃^– 比值 (30∶1) 的N₂O最大累积量显著低于其他两个水平处理 (P < 0.05)。

图3(Fig. 3)

图3 不同初始C/NO3– 下反硝化产物比和土壤pH的关系 Fig. 3 Relationship between the product ratio of denitrification and soil pH with different initial C/NO3– levels

表2(Table 2)

表2 不同pH和初始C/NO3– 下厌氧培养土壤反硝化产物比 $I_{{{\rm N}_2}{\rm O}} $ 比较分析 Table 2 Compared analysis for the product ratio of denitrification $I_{{{\rm N}_2}{\rm O}} $ in soils under the anaerobic incubation with different pH and initial C/NO3– levels

表2 不同pH和初始C/NO3– 下厌氧培养土壤反硝化产物比 $I_{{{\rm N}_2}{\rm O}} $ 比较分析 Table 2 Compared analysis for the product ratio of denitrification $I_{{{\rm N}_2}{\rm O}} $ in soils under the anaerobic incubation with different pH and initial C/NO3– levels pH C/NO3– CK 5∶1 15∶1 30∶1 5.63 0.58 ± 0.06 aA 0.41 ± 0.05 bA 0.41 ± 0.05 bA 0.42 ± 0.06 bA 6.65 0.55 ± 0.07 aA 0.34 ± 0.05 bB 0.31 ± 0.02 bcB 0.26 ± 0.007 cB 7.83 0.34 ± 0.01 aB 0.17 ± 0.01 bC 0.17 ± 0.01 bC 0.16 ± 0.004 bB 注（Note）：同行数据后不同小写字母表示 C/NO3– 间差异显著 (P < 0.05)，同列数据后不同大写字母表示 pH 间差异极显著 ( P < 0.01); 表中数值为平均值 ± 标准差 ( n = 3)。Values followed by different lowercase letters in a row indicate significant differences (P < 0.05) among different C/NO 3– ratios and capital letters in a column indicate significant differences (P < 0.01) among different pH; Values are mean ± SD ( n = 3).

表3(Table 3)

表3 土壤pH和初始C/NO3– 对N2O产生量的因子分析 Table 3 Multivariate analysis of variance for the effects of pH and initial C/NO3– on the N2O production

表3 土壤pH和初始C/NO3– 对N2O产生量的因子分析 Table 3 Multivariate analysis of variance for the effects of pH and initial C/NO3– on the N2O production 因子Factor 自由度df 均方Mean square F 值 F value P 值 P value pH 2 24.6 15960 < 0.001 C/NO3– 3 1.53 992 < 0.001 pH × (C/NO 3–) 6 0.743 482 < 0.001

表4(Table 4)

表4 培养结束后不同pH和初始C/NO3– 下铵态氮及硝态氮含量及气态氮素损失总量 Table 4 Concentrations of ammonium and nitrate and the total N gaseous loss in the end of the incubation

表4 培养结束后不同pH和初始C/NO3– 下铵态氮及硝态氮含量及气态氮素损失总量 Table 4 Concentrations of ammonium and nitrate and the total N gaseous loss in the end of the incubation pH 培养时间 (h) Incubation time C/NO3– NO3–-N (mg/kg) NH4+-N (mg/kg) 气态氮损失总量 (mg/kg) Total gaseous loss 5.63 256 CK 28.9 ± 1.6 a 11.4 ± 1.0 d 27.4 ± 0.36 c 5∶1 0 b 28.2 ± 12 c 57.5 ± 0.36 a 15∶1 0 b 47.7 ± 0.7 b 56.5 ± 0.71 ab 30∶1 0 b 110 ± 8.3 a 55.9 ± 0.43 b 6.65 136 CK 34.0 ± 1.4 a 6.0 ± 0.6 d 13.4 ± 0.53 b 5∶1 0 b 20.1 ± 3.6 c 49.3 ± 0.52 a 15∶1 0 b 94.8 ± 2.6 b 48.9 ± 0.54 a 30∶1 0 b 157 ± 1.0 a 49.4 ± 0.43 a 7.83 184 CK 20.5 ± 7.6 a 3.4 ± 0.8 d 18.0 ± 0.19 b 5∶1 0 b 17.2 ± 3.6 c 60.0 ± 0.86 a 15∶1 0 b 106 ± 7.8 b 60.2 ± 0.86 a 30∶1 0 b 235 ± 8.1 a 58.6 ± 0.13 a 注（Note）：同列数据后不同小写字母表示相同 pH 值不同 C/NO3–间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant differences ( P < 0.05) among different C/NO 3– ratios; 表中数值为平均值 ± 标准差 ( n = 3) Values are mean ± SD ( n = 3).

土壤pH值是影响反硝化作用特征的重要因素。在低pH值条件下 (pH 5.63)，对照处理 (CK) 的氮素气态产物以N₂O和NO为主，这是由于低pH阻碍了N₂O还原酶的形成^[30]。同时，基于在Paracoccus denitrificans上研究的结果，低pH也会干扰周质空间下的蛋白组装^[31]。本研究发现，不同初始C/NO₃^– 下土壤N₂O产生量指数 $I_{{{\rm N}_2}{\rm O}} $ 随pH的增加显著下降，且二者呈极显著线性负相关关系 (图3)，这与Liu等^[32]和Qu等^[23]的研究结果类似。同时，在碱性土壤和中性土壤中添加有效碳后，反硝化作用N₂O产物比值 (0.16～0.34) 均低于Schlesinger等^[21]汇总的农田土壤反硝化产物比结果 (0.37)，而在酸性土壤中有无添加有效性碳N₂O产物比均较高 (0.41～0.58)。由于土壤pH对反硝化N₂O产物比的影响不可忽视，因而，对不同pH的土壤仅用单一的产物比并结合N₂O排放通量估算土壤反硝化的总损失量存在较大的误差。

NO是反硝化作用过程的中间产物，同时也是编码亚硝酸盐还原酶 (NIR) 和一氧化氮还原酶 (NOR) 转录的诱导因子^[33]。Bergaust等 ^[33]发现，在模式菌株P. denitrificans上NO还可以诱导nosZ基因的转录。本研究结果表明，NO的最大累积量在低pH土壤 (pH 5.63) 中显著高于其他pH处理 (图1)，且在土壤溶液中NO浓度的最大值为6.2 μmol/L (数据未显示)。这是由于NO在低pH条件下的产生速率大于其消耗速率，还可能与低pH下的微生物会优先将硝酸盐完全还原为亚硝酸盐，而不是还原亚硝酸盐有关。此外，在低pH土壤条件下，尤其在土壤亚硝态氮出现累积时，化学分解反应等非生物因素对NO的排放贡献也不容忽视^[34]，还需进一步探究。

与对照相比 (CK)，各pH土壤在添加谷氨酸钠后均显著增加了反硝化速率，且土壤反硝化速率的最大值也随有效性碳含量的增加而增大，这与Jahangir等^[35]的研究结果相一致。原因可能是有效性碳增加了土壤nir和nosZ的基因拷贝浓度^[36]，促进了反硝化微生物酶的活性^[37]。同时，可利用性碳源的添加也会增加细胞的呼吸作用，显著促进CO₂的排放，且随土壤pH值的增加呈上升趋势 (图2)。在同一初始C/NO₃^–比土壤下，土壤pH的调节对N₂O和CO₂两种温室气体的排放存在某种程度上的“此消彼长”效应 (trade-off effect)。增加土壤pH后，N₂O产生量明显减少的同时CO₂的产生量也会显著增加，这可能与提高土壤pH后促进了土壤碳、氮的矿化有关^[38]。

土壤pH和初始C/NO₃^– 均对设施菜田土壤反硝化作用和N₂O产生显著影响，且二者有显著的交互效应 (表3)。室内培养研究结果表明，任何影响土壤中碳矿化速率的因素，如温度、施用有机和无机肥料以及添加秸秆等都会影响土壤反硝化潜势。宋贺等^[39]发现在设施菜田土壤中添加小麦秸秆可显著降低追肥和灌溉后产生的N₂O排放通量，这主要是由于增加了微生物可利用的碳源，从而促进了反硝化过程中N₂O的还原；同时，可利用性碳源也影响反硝化作用酶的活性和微生物的群落组成^[40]。而Obia等^[41]研究发现，酸性土壤中添加生物炭能够抑制反硝化过程N₂O和NO产生量，原因可能是添加生物炭增加了土壤的pH。此外，由于在不同土壤pH下反硝化潜势的差异，造成其培养终止时间有所不同，但根据相同pH土壤培养前后的铵态氮变化 (表1和表4)，对照处理土壤铵态氮含量升高可能来源于厌氧条件下土壤矿化作用和硝酸盐的异化还原 (DNRA) 过程。

虽然在低pH条件下，有效碳的添加对反硝化N₂O的产物比没有影响，但在中性和石灰性土壤上，碳的有效性显著影响该产物比。因此，在利用N₂O排放通量来估算土壤反硝化损失时，活性有机碳含量是应该予以重视的一个重要因素。

综上所述，设施菜田土壤通过增加土壤pH和初始C/NO₃^– 比可以增加反硝化速率，减少N₂O排放。在田间条件下，通过施用石灰或者生物炭等改良土壤pH以及施用秸秆等增加土壤中可利用性碳含量是减少土壤N₂O温室气体排放的重要措施。而且，在利用产物比并结合N₂O排放通量观测数据来估算反硝化氮素损失量时，土壤pH和碳的有效性是必须引起重视的两个因素。