有机磷（organic phosphorus，OP）化合物属于极毒性化学物质，目前治疗方式主要是解毒剂给药（阿托品和肟类），辅助以洗胃、导泻、清洗皮肤及血液净化等。对氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）具有解救OP中毒的作用，可能与抗氧化应激作用有关。本研究通过建立敌敌畏（dichlorvos，DDVP）中毒大鼠脑组织损伤模型，探究PON1对解救DDVP中毒脑组织损伤的保护作用。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠（250~350 g）30只，购自北京华阜康生物科学技术有限责任公司[合格证号：SCXK（京）2014-0004]，由中国医科大学附属盛京医院本溪实验基地动物部饲养。

1.1.2 主要试剂

77.5%DDVP乳油（山东大成农化有限公司）；胆碱酯酶（cholinesterase，ChE）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；过氧化氢酶（catalase，CAT）测试盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，Sod1）抗体（美国BioVision科技公司）；PTEN诱导激酶1（PTEN-inducible kinase 1，Pink1）抗体（美国Novus科技公司）；过氧化物还原酶6（peroxidase reductase 6，Prdx6）抗体（美国Cell Signaling科技公司）；PON1（中国医科大学中心实验室使用层析分离纯化兔血清）。

1.1.3 主要仪器

BioTek全光谱酶标仪；Amersham成像仪600；普通光学显微镜CX-41（日本OLYMPUS公司），生物光学显微镜E800型（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备

30只雄性SD大鼠随机分为5组（6只/组）。空白对照组（A组）予大鼠腹腔注射1 mL/kg生理盐水；染毒组（B组）予大鼠15 mg/kg DDVP腹腔注射；PON1干预组（C组）于大鼠造模前30 min尾静脉注射兔血清PON1 9 600 U/kg，30 min后予15 mg/kg DDVP腹腔注射；传统治疗组（D组）予大鼠15 mg/kg DDVP腹腔注射，后立即予阿托品10 mg/kg+碘解磷定45 mg/kg腹腔注射；联合治疗组（E组）于大鼠造模前30 min尾静脉注射兔血清PON1 9 600 U/kg，30 min后予15 mg/kg DDVP腹腔注射，之后立即予阿托品10 mg/kg+碘解磷定45 mg/kg腹腔注射。造模后立即观察大鼠一般状态及症状并记录。

1.2.2 取材

各组大鼠造模后8 h处死，室温静置4 h，心脏抽取血液5 mL，3 500 r/min离心10 min后，取上清液（血清），-80 ℃冰箱保存待测。之后每只大鼠以300 mL生理盐水注射心脏灌洗，取脑组织，于冰上冠状面中间处切去3 mm厚度大脑组织，放入标记后于4%多聚甲醛中固定，剩余部分于冰上分离皮层大脑组织及海马区大脑组织，分别放入EP管中，标记后存入-80 ℃冰箱。

1.2.3 生化指标检测

从-80 ℃冰箱中取出各组血清，严格按照ChE测试盒说明书配制工作液，以双蒸水为对照，混匀，37 ℃孵育30 s，405 nm波长连续监测40 s，计算△A/min，根据说明书公式计算ChE活力，记录并计算各组活力值。严格按照CAT试剂盒说明书配制4种试剂，在37 ℃温度下按照说明书加样顺序操作，混匀，以双蒸水对比，于波长405 nm，光径0.5 cm，双蒸水调零，测定各管吸光度，按照说明书计算公式计算各组CAT活力。

1.2.4 Western blotting检测Sod1、Pink1及Prdx6在大脑皮层和大脑海马区中的表达

大脑皮层和大脑海马区分别经过冰上充分研磨、裂解后4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液测蛋白浓度，变性后电泳分离蛋白质，转至PVDF膜，封闭3 h，洗膜后孵一抗（Sod1、Pink1、Prdx6、β-actin），4℃冷房摇床上孵育过夜，洗膜，加二抗孵育，再洗膜，发光。

1.3 光镜检查

取出各组4%多聚甲醛固定3 d后的大脑组织，过缸脱水、透明、包埋后切片、晾片、烘片后进行HE染色，树脂封片，光镜下分别观察各组大脑皮层和海马区形态并照相。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学处理，比较各组大鼠血清ChE、CAT，大脑皮层及大脑海马区Sod1、Pink1、Prdx6表达水平，计量资料以x±s表示，每组数据先行方差齐性检验，后进行独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠临床表现

A组大鼠生命体征平稳，未出现任何中毒症状；B组大鼠立即出现流涎、流泪、大小便失禁、咀嚼肌震颤、四肢肌肉震颤、呼吸急促和躁动等中毒症状；C组大鼠立即出现轻微咀嚼肌震颤、呼吸略急促伴有轻微躁动中毒症状；D组大鼠立即出现轻微流涎、咀嚼肌震颤、四肢肌肉震颤、呼吸急促伴有轻微躁动中毒症状；E组大鼠仅出现轻微咀嚼肌震颤，无其他中毒症状。

2.2 各组大鼠血清ChE和CAT

以A组为对照，B组ChE和CAT数值下降明显，C组下降程度较B组小，差异有统计学意义（P < 0.05），D组下降程度较B组小、较C组大，差异均有统计学意义（P < 0.05），E组下降程度较A组差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

2.3 Western blotting结果

应用“Quantity One”软件分析结果显示，以A组为空白对照组，B组表达量较A组明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）；C组表达量较A组少、较B组多，差异有统计学意义（P < 0.05）；D组表达量较A组、C组少，较B组多，差异均有统计学意义（P < 0.05）；D组较A组表达略少，多于其余3组。大脑皮层和海马区同组之间差距较少，无统计学意义（P > 0.05）。见图 1~3。

2.4 病理变化

以A组为对照，其余4组均出现不同程度损伤；B组出现严重结构疏松，镜下细胞严重水肿，出现较为严重的核固缩、空泡和脂肪变性，微血管周围空隙增宽，神经细胞也出现较严重水肿；C组出现中度结构疏松，镜下细胞中度水肿，少量细胞出现核固缩、空泡和脂肪变性，神经细胞也出现中度水肿，损伤较B组减轻；D组出现轻度结构疏松，镜下出现少量细胞水肿，偶可见核固缩、空泡和脂肪变性，神经细胞也有轻度水肿，损伤程度轻于C组；E组出现极轻度细胞水肿，未见细胞核改变，神经细胞出现极轻度水肿，损伤程度最轻。同组的大脑皮层和海马区的损伤程度相似。见图 4、5。

3 讨论

PON在人类基因里包含PON1、PON2、PON3 3种，兔血清PON1与人类PON1高度相似^[1]。DDVP按照半数致死量属于高毒类。PON1具有抗氧化及解救OP中毒性质，已经发现缺乏PON1的动物与野生型动物相比更易OP中毒，并且已经证明注射兔纯化PON1的各动物模型不易OP中毒^[2-3]。

各组大鼠染毒后出现的一般状态，可以判断大鼠中毒严重程度的大小，PON1干预组中毒严重程度较低，优于传统治疗组，但次于联合治疗组。

临床上ChE是评判OP中毒严重程度的一个较为成熟的检测指标，具有出结果快，结果准确等优势。CAT是一种十分重要的抗氧化解毒酶，它将过氧化氢分解成水和分子氧。CAT基因具有持家基因的所有特征，与在物种之间高度保守的核心启动子相关^[4-5]。本研究通过测定血清里ChE和CAT活力水平反映大鼠的中毒严重程度，说明PON1干预组损伤轻于传统治疗组。

OP中毒的神经毒性是主要死亡原因之一，其机理尚未明确阐明。有机磷酸酯能抑制乙酰胆碱酯酶，神经毒性主要是大脑不同区域中乙酰胆碱过度活化的结果，也是由于脑中乙酰胆碱酯酶抑制诱导的氧化应激所引起的。在纹状体中观察到高乙酰胆碱酯酶活性，随后是海马，小脑和皮质。中毒造成的延迟周围神经病变、锥体外系症状和神经精神症状在8 h后较明显，因此本研究选取大脑皮层和海马区于造模后8 h后比较其损伤程度^[6-7]。

Sod1是经典的抗氧化酶之一，在活性氧清除中发挥重要作用^[8-9]。Pink1是一种抗氧化蛋白，Pink1丢失与线粒体Ca²⁺处理不当、线粒体功能障碍以及神经元的易损性增加有关^[10-11]。Pink1蛋白的下调涉及线粒体功能障碍和氧化应激^[12]。Prdx6是一种独特的抗氧化酶，具有过氧化物酶和磷脂酶活性^[13-14]双重性质。通过Western blotting方法检测各实验组大脑皮层与海马区一种传统抗氧化指标Sod1和2种新型抗氧化指标Pink1和Prdx6的表达量，根据5组之间的对比，说明PON1干预组优于传统治疗组，联合治疗组优于传统治疗和PON1组，大脑皮层和海马区的表达量无统计学差异，说明PON1对于OP中毒大鼠大脑皮层和海马区的损伤均具有保护作用。

光镜下HE染色病理观察显示，细胞发生水肿，出现核固缩、空泡及脂肪变性，也印证了上述结论，染毒组组织损伤程度最严重，PON1干预组损伤程度轻于传统治疗组、重于联合治疗组，其病理结果与之前生化结果相一致。

综上所述，PON1对于OP中毒大鼠大脑皮层和海马区均具有保护作用。进而得出兔血清PON1对DDVP中毒大鼠大脑组织具有保护作用。