胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，按病理分级可分为Ⅰ~Ⅳ 4个级别。Ⅳ级胶质瘤又称胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)，是颅内致死率最高的肿瘤之一，生长呈浸润性，血运丰富，边界不清。目前GBM的主要治疗手段为手术切除，术后同步进行放、化疗。但由于肿瘤高度的侵袭性及增殖能力，预后往往不佳^[1]，患者平均生存期也仅有14个月^[2]，5年生存率仅5%^[3]。研究GBM相关的分子标志物有可能为GBM的诊断、治疗及预后评估提供新的策略。

微小RNA (microRNA，miRNA)通过与靶基因的3'端非编码区域相结合，能够在转录后水平调节基因的表达。研究显示，miR-194在喉癌^[4]、肾透明细胞癌^[5]、胃癌^[6]、非小细胞肺癌^[7]等多种恶性肿瘤中异常表达，但在胶质瘤中的作用尚未见报道。本研究旨在探讨miR-194在不同级别的胶质瘤组织中的表达情况，以及对U87细胞增殖、迁移和侵袭影响，以期为胶质瘤的诊断及治疗提供新的靶点。

1 材料与方法 1.1 胶质瘤组织

23例人脑胶质瘤组织均取于中国医科大学附属盛京医院神经外科，Ⅰ~Ⅱ级7例，Ⅲ~Ⅳ级16例，用于阴性对照的脑组织共5例，来源于脑出血、外伤组织。所有组织离体后立即放入液氮中保存。取材前所有患者均已签署知情同意书，并经过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及材料

Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；DMEM高糖培养基(美国Corning公司)；胎牛血清(天津灏洋生物科技有限公司)；DMSO (美国Sigma公司)；转染试剂Lipofectamine3000和Opti-MEM^®Ⅰ (美国Invitrogen公司)；TaqMan^® MicroRNA Reverse Transcription Kit (美国Ambion公司)；TaqMan^® Universal Master Mix Ⅱ (美国Ambion公司)；miR-194激动剂miR-194 agomir、拮抗剂miR-194 antagomir (苏州吉玛公司)；CCK-8 Kit (上海东仁化学科技公司)；基质胶Matrigel (美国BD Biosciences公司)；吉姆萨染液(北京雷根生物公司)；细胞凋亡试剂盒(上海东仁化学科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 组织总RNA提取与实时荧光定量PCR

胶质瘤组织4 ℃预冷的PBS清洗后加入1 mL Trizol试剂，吹打数次后移入1.5 mL EP管中，静置5 min后加入0.2 mL氯仿，手动剧烈震荡，室温下静置3 min。将样品放入4 ℃离心机中，12 000 g离心15 min，取上层水相至新的EP管中，向样品中加入0.5 mL异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10 min。4 ℃ 12 000 g离心15 min，弃上清，向样品中加入1 mL 75%乙醇。4 ℃ 7 500 g离心5 min，细胞间干燥10~15 min后加入30~40 μL DEPC水。获取的RNA应用TaqMan^® MicroRNA Reverse Transcription Kit及TaqMan^® Universal Master MixⅡ试剂盒及7500 Fast Real time PCR系统进行实时荧光定量PCR。以U6为内参，以2^-ΔΔCt表示mRNA的相对表达量。

1.3.2 U87细胞培养

U87细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高塘培养液中，于37 ℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。每2~3 d传代1次，传代次日更换培养液。取对数生长期、生长状态良好的细胞进行后续实验。

1.3.3 miR-194瞬时转染与分组

使用转染试剂Lipofectamine3000和Opti-MEM^®Ⅰ将miR-194激动剂、拮抗剂及阴性对照转染至U87细胞中，并检测转染效率。实验分为5组：空白对照组(Control)、转染miR-194 agomir阴性对照组(pre-NC)、转染miR-194 agomir实验组(pre-miR-194)、转染miR-194 antagomir阴性对照组(anti-NC)和转染miR-194 antagomir实验组(anti-miR-194)。

1.3.4 CCK-8实验检测细胞增殖能力

U87细胞铺于96孔培养板中，每孔大约2 000个细胞，每组细胞铺5个副孔。在37 ℃细胞孵箱中分别培养48 h，加入Cell Counting Kit-8 10 µL后放入37 ℃恒温培养箱中1 h。将96孔板放入酶标仪，选取波长450 nm，测定每孔的光密度(OD)值。

1.3.5 细胞迁移实验

向24孔板内每孔加入600 µL含有10%血清的DMEM高糖培养液，孔内放置孔径为8 µm的Transwell小室。待处理细胞用PBS清洗2次，消化。弃去消化液后加入适量无血清培养液，并吹打成单细胞悬液。细胞计数后取100 µL细胞悬液(约含10 000个细胞)均匀地铺在Transwell上室内，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。24 h后取出小室，用棉棒将上室内面没有迁移过去的细胞擦净，放入提前配制的固定液中(甲醇:冰乙酸= 3: 1)固定30 min。用PBS清洗小室后晾干。配制吉姆萨染液(染液:工作液=1: 9)。将小室倒置，吉姆萨染液滴于小室底面染色1 h。用PBS清洗2次，在倒置显微镜(400×)下观察细胞的迁移情况，每组随机5个视野，统计细胞个数，以此代表细胞的迁移能力。

1.3.6 细胞侵袭实验

Matrigel基质胶提前融化。取50 µL基质胶(500 ng/µL)均匀地铺在小室内面，放入37 ℃恒温箱中4 h，使基质胶凝固。后续实验方法及统计方法同迁移实验。

1.3.7 细胞凋亡实验

应用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，将细胞轻轻吹打成悬液后转移至1.5 mL离心管中，1 000 r/min离心3 min收集细胞。用PBS继续清洗，1 000 r/min离心3 min，离心后倒掉上清。重复2次。每管加入500 µL Binding Buffer悬浮细胞。每管相继加入5 µL PI和5 µL FITC混匀，室温避光15 min。上机前吹打均匀细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。

1.4 统计学分析

利用统计软件SPSS 18.0进行统计，数据采用x±s表示。组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 实时荧光定量PCR检测miR-194在胶质瘤组织及细胞中表达

与对照组脑组织比较，miR-194在胶质瘤组织中的表达量显著降低，并且表达量随胶质瘤组织级别的升高而减少(P < 0.05，图 1A)。与正常人脑星型胶质细胞比较，miR-194在人脑U87胶质瘤细胞中表达量也显著减少(P < 0.01，图 1B)。

2.2 miR-194转染效率的检测

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组miR-194的表达水平未见明显变化。与pre-NC组比较，pre-miR-194组miR-194的表达水平显著上调(P < 0.01)，与anti-NC组比较，anti-miR-194组miR-194的表达水平显著下降(P < 0.01，图 2A)。

2.3 miR-194对U87细胞增殖能力的影响

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组细胞增殖能力未见明显变化。与pre-NC组比较，pre-miR-194组细胞增殖能力明显下降(P < 0.01)，而与anti-NC组比较，anti-miR-194组细胞增殖能力显著增加(P < 0.01)。结果表明miR-194能够抑制胶质瘤细胞的增殖能力(图 2B)。

2.4 miR-194对U87细胞迁移、侵袭能力的影响

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组细胞迁移及侵袭能力未见明显变化。与pre-NC组比较，pre-miR-194组细胞迁移及侵袭能力明显下降(P < 0.01)，而与anti-NC组比较，anti-miR-194组细胞迁移及侵袭能力显著增加(P < 0.01)。结果表明miR-194能够抑制U87胶质瘤细胞迁移及侵袭能力(图 2C)。

2.5 miR-194对U87胶质瘤细胞凋亡的影响

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组细胞凋亡情况未见明显变化。与pre-NC组比较，pre-miR-194组细胞凋亡率明显增加(P < 0.01)，而与anti-NC组比较，anti-miR-194组细胞凋亡率显著下降(P < 0.01)。结果显示miR-194能够促进U87胶质瘤细胞的凋亡(图 2D)。

3 讨论

GBM由于其侵袭性生长的特点手术往往难以完整切除，肿瘤极易残余、复发。术后常规行放、化疗虽能一定程度上延缓疾病的进展，但血脑屏障、血肿瘤屏障的存在限制了治疗效果，患者仍然难以获得满意预后^[8]。近来大量研究^[9-10]显示，基因的异常表达以及基因间异常调控作用与胶质瘤的形成、发展密切相关。

miRNA是一类长度18~25个核苷酸的非编码RNA，具有高度保守性，不具备开放阅读框架，通过与靶基因的3'UTR区域相结合，在转录后水平抑制或降解靶基因表达，从而抑制蛋白合成。miRNA在胚胎形成、细胞分化、细胞凋亡、细胞死亡、肿瘤的形成等诸多方面发挥着多元化的调控作用。miR-194是miRNA的成员之一，在大部分肿瘤的生长、分化、迁移、侵袭及凋亡过程中起抑癌作用。在骨肉瘤中，离体及在体实验^[11]均证明miR-194能够通过靶向作用于CDH2和IGF1R来抑制细胞的增殖及转移。在结肠癌中，miR-194能够通过调控MAP4K4/c-Jun/MDM2信号途径抑制细胞的增殖能力^[12]。在膀胱癌中，miR-194通过抑制RAP2B的表达进而抑制膀胱癌细胞的增殖与侵袭能力^[13]。然而，也有报道miR-194在前列腺癌、卵巢癌、胰腺导管腺癌中分别通过作用于SOCS2^[14]、PTPN12^[15]以及DACH1^[16]来促进肿瘤细胞的转移、增殖、克隆形成、迁移及侵袭作用。这可能是基因在不同组织中的差异性作用所致。

本研究应用实时荧光定量PCR分析，证实了miR-194在胶质瘤组织中表达量明显低于对照脑组织，且表达量随胶质瘤级别升高而降低。将miR-194转染至U87细胞后，应用CCK-8法检测细胞增殖能力，结果显示过表达miR-194后U87细胞增殖能力显著下降，而沉默miR-194后细胞增殖能力显著增加。迁移、侵袭实验显示，miR-194过表达后细胞的迁移、侵袭能力显著下降，沉默miR-194后细胞的迁移、侵袭能力明显增加。凋亡实验显示，过表达miR-194后细胞的凋亡率显著增加，而沉默miR-194后细胞凋亡率显著减少。上述研究结果表明miR-194在胶质瘤U87细胞中发挥抑癌的作用，可以作为胶质瘤治疗的靶点之一。

然而，胶质瘤发生与发展机制极其复杂，miR-194是通过何种机制、哪些靶基因发挥的抑癌作用有待于今后进一步研究。