2018, Vol. 47文章信息
- 邵洋, 胡延平, 刘勇
- SHAO Yang, HU Yanping, LIU Yong
- 慢性淋巴细胞白血病患者长链非编码RNA RP5-180C18.1的表达及其预后评价作用
- Long Non-coding RNA RP5-180C18.1 Expression and Its Prognostic Significance in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia
- 中国医科大学学报, 2018, 47(4): 341-345
- Journal of China Medical University, 2018, 47(4): 341-345
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文章历史
- 收稿日期：2017-04-05
- 网络出版时间：2018-04-09 11:15
引用本文 |
2. 中国医科大学附属盛京医院 血液研究室, 沈阳 110004
2. Department of Hematology, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China
慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是成熟样B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴结和脾脏大量蓄积为特征的低度恶性肿瘤。CLL在欧美较为常见，而在我国相对少见。目前对CLL的诊断主要依赖于WHO标准[1]，依据白细胞计数、血涂片免疫表型等对CLL进行诊断，目前CLL治疗参考NCCN指南[2]，需要根据患者年龄、细胞遗传学等分层治疗，预后判断参考Rai和Binet标准[3-4]，这两个传统标准主要依赖于体检及血细胞计数来判断预后，并不能充分满足患者需要。近年来一些分子生物学指标(IGHV、ZAP70、17p-和11q-等)也参与CLL的诊断治疗及预后判断[5]。为弥补缺陷，CLL-IPI (CLL international prognostic index)积分系统纳入了TP53缺失/突变、IGHV突变、血清β2-微球蛋白、临床分期和年龄5个指标辅助CLL患者的预后判断[6]。
长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200 nt的长链非编码RNA分子，它可在多层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达[7]。非编码RNA的异常表达可以辅助CLL的诊断及预后分层，已有研究证明，多种miRNA及LncRNA在CLL的发生发展中起到重要作用，miR-155提高BCR受体的敏感性，其高表达预示着较差的预后[8]，而与之相反，miR-150降低BCR受体的敏感性[9]，同时，也有多种lncRNA的下调被认为参与肿瘤的生成，包括HOTAIR、MALAT1和SChLAP1等[10]。本研究前期通过二代测序技术筛选CLL患者中相对于健康人B淋巴细胞中lncRNA的异常表达，结果发现超过20 000种lncRNA存在异常表达，其中RP5-180C18.1存在显著上调(P < 0.001)，提示RP5-180C18.1可能在CLL的发生发展中起一定的作用。本研究分析RP5-180C18.1的表达，探讨其在CLL诊断及预后判断上的作用。
1 材料与方法 1.1 研究对象收集2006年1月至2017年1月本院血液科就诊的初诊CLL患者，采用样本库中留存的临床废弃骨髓样本60例，其中男性27例，女性33例，中位年龄65岁。并采自30例造血干细胞移植供者骨髓液为健康对照。所有患者经过形态学、免疫分型、细胞遗传学及分子生物学综合确诊，实验室特点见表 1，诊断标准参照WHO标准。本实验经过中国医科大学伦理委员会批准(No. 2016PS352K)。根据相关分子生物学指标，分别根据IGHV突变、CD38及ZAP70对CLL患者进行分组比较。并对60例CLL患者进行了随访。
| Variables | Control group (n = 30) | CLL group (n = 60) | P |
| Male/female | 14/16 | 27/33 | 0.529 |
| Age (year) | 59 (23-79) | 65 (28-87) | 0.103 |
| Leukocytes (1×109/L) | 8.63±0.92 | 18.5±2.66 | < 0.001 |
| Hemoglobin (g/L) | 141.54±15.27 | 127.79±17.83 | 0.005 |
| Platelets (1×109/L) | 194.01±18.34 | 121.9±14.12 | < 0.001 |
| Prolymphocyte (1×109/L) | NA | 6.1±0.73 | NA |
| NA，not applicable. | |||
1.2 方法 1.2.1 试剂及引物
淋巴细胞分离液Lymphoprep (中国达科公司)，逆转录采用RrimeScript RT reagent Kit逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)。实时采用SYBR Green试剂盒(日本TaKaRa公司)。引物为RP5-180C18.1，F：GCAGCGTCCAGAGGCTGG，R：GGCAGCGAGGATGCTGAACC；TBP，F：CCACGGTGAATCTGTGCT，R：GGAGTCGTCCTCGCTCTT。
1.2.2 qPCR检测采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，然后Trizol-氯仿方法提取细胞总RNA，Oligo dT法进行反转录反应，以管家基因TBP为内参，同时进行RP5-180C18.1和TBP的实时反应。实时反应设置3个复孔，得出Ct均值，以正常人为对照，应用ΔΔCt相对定量法分析RP5-180C18.1表达水平的差异。ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct RP5-180C18.1-Ct TBP，2-ΔΔCt即为基因表达差异的倍数。
1.3 统计学分析应用SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料采用x±s表示。计量资料比较采用独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验，预后分析采用log-rank检验。P < 0.05 (双向)为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 RP5-180C18.1在不同CLL表型中的表达结果显示，与健康对照组(1.894±0.62)比较，RP5-180C18.1在CLL患者(12.93±2.98)表达较高(P= 0.013)。与突变型CLL患者(0.505±0.07)比较，IGHV野生型CLL患者(4.682±1.08) RP5-180C18.1表达高(P= 0.023)；与ZAP70高表达CLL患者(0.262±0.04)比较，ZAP70低表达CLL患者(1.728±0.42) RP5-180C18.1表达较高(P= 0.002)；CD38低表达(1.162±0.31)与高表达(2.183±0.67) CLL患者RP5-180C18.1表达差异无统计学意义(P= 0.206)。
2.2 RP5-180C18.1表达与CLL分型相关分析将60例CLL样本根据RP5-180C18.1相对表达量的中位数(2.863)进行分组[RP5-180C18.1低表达组(< 2.863)和RP5-180C18.1高表达组(> 2.863)]，分析CLL患者临床特征、分型与RP5-180C18.1表达相关性。结果显示，RP5-180C18.1表达与CLL患者性别、年龄、血红蛋白含量及幼稚淋巴细胞比例无关(P分别为0.604、0.128、0.133、0.058)；RP5-180C18.1高表达组CLL患者的白细胞计数较低(P < 0.001)，血小板含量较高(P < 0.001)。根据分子生物学特征分组结果显示，RP5-180C18.1表达与CD38表达无关(P= 0.796)；RP5-180C18.1高表达组CLL患者ZAP70表达率较高(P= 0.019)，野生型IGHV比例较高(P= 0.030)。见表 2。
| Variables | RP5-180C18.1 low expression(n = 30) | RP5-180C18.1 high expression(n = 30) | P |
| Male/female | 18/12 | 15/15 | 0.604 |
| Age(year) | 64(28-81) | 67(30-87) | 0.128 |
| Leukocytes(×109/L) | 20.82±2.05 | 14.27±1.22 | < 0.001 |
| Hemoglobin(g/L) | 128.65±12.21 | 123.42±14.3 | 0.133 |
| Platelets(×109/L) | 109.13±10.31 | 124.7±9.15 | < 0.001 |
| Prolymphocyte(×109/L) | 6.3±0.48 | 5.7±0.44 | 0.058 |
| ZAP70 [n(%)] | 0.019 | ||
| Negative | 19(63.3) | 9(30.0) | |
| Positive | 11(36.7) | 21(70.0) | |
| CD38 [n(%)] | 0.796 | ||
| Negative | 15(50.0) | 13(43.3) | |
| Positive | 15(50.0) | 17(56.7) | |
| IGHV [n(%)] | 0.030 | ||
| Wild type | 19(63.3) | 27(90.0) | |
| Mutant type | 11(36.7) | 3(10.0) | |
2.3 RP5-180C18.1表达与CLL患者预后相关分析
对60例CLL患者随访结果显示，中位总生存期(overall survival，OS) 93个月，中位无进展生存期(progression-free survival，PFS) 75个月。RP5-180C18.1低表达组中位OS 98个月，RP5-180C18.1高表达组中位OS 39个月，两者具有统计学差异(P= 0.048)，见图 1A，RP5-180C18.1高表达CLL患者OS更短。如图 1B所示，RP5-180C18.1低表达组中位PFS 81个月，RP5-180C18.1高表达组中位PFS 25个月，两者具有统计学差异(P= 0.041)，RP5-180C18.1高表达的CLL患者PFS更短。RP5-180C18.1高表达组预后相对于RP5-180C18.1低表达组更差。
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| A, overall survival of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) according to RP5-180C18.1 expression; B, progression-free survival of patients with CLL according to RP5-180C18.1 expression. 图 1 根据RP5-180C18.1表达量对CLL患者进行的Kaplan-Meier生存分析结果 Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of patients with CLL according to RP5-180C18.1 expression |
3 讨论
RP5-180C18.1位于1号染色体，编码一段596 bp的转录本，基因ID为ENST00000413901，本研究发现lncRNA RP5-180C18.1在CLL不同表型中存在差异性表达，并且发现其在CLL诊断及预后判断具有辅助作用。结果显示RP5-180C18.1在CLL患者中相对于健康对照存在高表达，提示RP5-180C18.1有作为检测CLL诊断学标志物的潜力。已有研究证明，lncRNA在肿瘤中存在显著差异性表达，可以作为生物标志物辅助肿瘤检测。有研究[11]证明在患者尿液样本中检测lncRNA PCA3可以比前列腺特异性抗原更敏感更特异诊断前列腺癌。血清中检测rp11-445h22.4发现其在乳腺癌组织中高表达，并且具有92%敏感性和74%特异性，显著优于常规生物标志物(CEA、CA125、CA153、AFP) [12]。另外，在胃癌患者体液样本中检测lncRNA tincr，ccat2，aoc4p，bancr，linc00857，aa174084和H19发现，这些lncRNA可以有效鉴别胃癌患者与健康人，并且可以判断胃癌发展的阶段[13]。需要注意的是，本研究对照组设置相对于实验组在参数(幼稚细胞比例及血常规)上存在统计学差异，但这并不违背统计学原理，本研究目的是探索RP5-180C18.1作为CLL生物学标志物的潜力，需要把CLL从健康人中鉴别出来，因此必须采用健康人群作为对照，而幼稚细胞数及血常规指标正是CLL的常见异常。外周血标本来源便捷，临床上最理想的检测标志物采用外周血指标，但是因为标本收集受限，本研究未检测外周血RP5-180C18.1含量，本研究骨髓检测RP5-180C18.1表达可靠，同时期待应用于临床CLL诊断，后续将进一步完善外周血RP5-180C18.1表达检测。
对CLL患者随访分析结果显示，RP5-180C18.1高表达患者具有更差的预后。研究[14]证明lncRNA在肿瘤预后判断起重要作用，lncRNA CCAT2在多种肿瘤(结肠癌、前列腺癌和甲状腺癌等)中过表达，并且预示着较差预后。也有研究[15]认为treRNA降低CLL中DNA损伤，其高表达预示着较差预后。本研究发现RP5-180C18.1在野生型IGHV和ZAP70高表达CLL患者中表达更高，这是否与RP5-180C18.1高表达CLL患者预后较差有关尚未证实，需进一步研究。研究[16]证明IGHV未突变型或ZAP70高表达CLL患者具有较差预后，这也从另一方面支持本研究结果。
综上所述，lncRNA RP5-180C18.1在CLL中高表达，与CLL侵袭性表型相关，并且其高表达具有较差预后。今后应对RP5-180C18.1表达深入研究，为阐明CLL的发病机制提供科学依据。
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