2018, Vol. 47文章信息
- 彭华童, 吴文艺, 张丽婷, 林建清, 余艺煌, 吴春林, 黄种心, 邱建龙
- PENG Huatong, WU Wenyi, ZHANG Liting, LIN Jianqing, YU Yihuang, WU Chunlin, HUANG Zhongxin, QIU Jianlong
- SIRT1沉默对人甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1生物学功能的影响
- Effect of Silencing SIRT1 on the Biological Behavior of the Human Thyroid Papillary Carcinoma Cell Line TPC-1
- 中国医科大学学报, 2018, 47(4): 321-328
- Journal of China Medical University, 2018, 47(4): 321-328
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文章历史
- 收稿日期：2017-09-28
- 网络出版时间：2018-04-09 11:15
引用本文 |
2. 解放军第一八零医院内分泌科, 福建 泉州 362000;
3. 解放军第一八零医院病理科, 福建 泉州 362000
2. Department of Endocrinology, The 180 th Military Hospital of Chinese People's Liberation Army, Quanzhou 362000, China;
3. Department of Pathology, The 180 th Military Hospital of Chinese People's Liberation Army, Quanzhou 362000, China
甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌(thyroid papillary carcinoma，TPC)是最常见的一种类型，占所有甲状腺癌的80%~85%。虽然TPC的总体预后较好，但仍有约10%的患者可能死于该病[1]。近年来，国内外的调查结果显示甲状腺癌的发病率呈显著增加趋势。然而，肿瘤的发生、发展是一个多环节、多因素、多阶段的复杂过程，甲状腺癌发生的原因及机制目前尚不清楚，绝大多数观点认为基因突变或表达异常在TPC的发生中起重要作用。
沉默信息调节因子2相关酶1 (silent information regulator 2 homolog 1，SIRT1)是Sirtuins家族中的一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶[2]，它可使多种蛋白质的赖氨酸残基发生去乙酰化，在肿瘤的发生发展中有着广泛的生物学功能[3]。HERRANZ等[4]研究发现，在磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)基因缺乏的小鼠甲状腺癌中，SIRT1蛋白异常升高，原癌基因c-MYC被激活，c-MYC蛋白表达上调。吴文艺等[5-6]研究证实，SIRT1在TPC组织中高表达，可能与TPC的发生、发展及淋巴结转移有关。
本研究利用脂质体法使SIRT1siRNA转染体外培养的人TPC细胞株TPC-1，用qRT-PCR方法检测siRNA的干扰效率，筛选出干扰效率最强的siRNA，并用Western blotting验证SIRT1蛋白的表达，利用CCK8法、Hoechst染色法、流式细胞仪及β-半乳糖苷酶染色法检测转染细胞的增殖抑制率、凋亡、周期与衰老的变化，旨在探讨SIRT1沉默对人TPC细胞株TPC-1生物学功能的影响。
1 材料与方法 1.1 材料人TPC细胞株TPC-1购自广州吉妮欧生物科技有限公司；SIRT1siRNA由Sigma公司设计合成(表 1)；胎牛血清、RPMI-1640培养基、青链霉素、PBS磷酸钾缓冲液购自美国Hyclone公司；Trizol、SYBR GREEN qPCR Super Mix购自美国Invitrogen公司；ImProm-ⅡTM Reverse Transcription System、dNTP、Ramdom Primer、M-MLV、DNase、RNasin Ribonuclease Inhibitor购自美国Promega公司；HRP标记的GAPDH内参购自上海康成生物公司；SIRT1一抗购自美国Cell Signaling公司；二抗山羊抗兔IgG (H+L)，Mouse/Human ads-HRP、兔抗鼠IgG (H+L) -HRP购自美国Southern Biotech公司；磷酸酶抑制剂、BCA法蛋白含量检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒购自江苏Keygen公司；RIPA裂解液、一抗稀释液、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、Hoechst 33258染色液、CCK-8溶液购自上海Beyotime Biotechnology公司；其他材料由福建医科大学附属第二医院中心实验室提供。
| Name[line] | Sequence (5’to 3’) | Size(bp) | Epsilon(1/mMcm) | MW(g/mole) | Qty/tube | |
| OD | nmoles | |||||
| SASI_Hs01_00153666 | GUGUCAUGGUUCCUUUGCAdTdT | 21 | 197.9 | 6 631 | ||
| SASI_Hs01_00153666_AS | UGCAAAGGAACCAUGACACdTdT | 21 | 207.8 | 6 681 | ||
| Duplex of above | 13 312 | 2 | 5 | |||
| SASI_Hs01_00153667 | CUGUGAAGCUGUACGAGGAdTdT | 21 | 208 | 6 779 | ||
| SASI_Hs01_00153667_AS | UCCUCGUACAGCUUCACAGdTdT | 21 | 193.8 | 6 628 | ||
| Duplex of above | 13 407 | 2 | 5 | |||
| SASI_Hs01_00153668 | CAACUAUACCCAGAACAUAdTdT | 21 | 210.1 | 6 634 | ||
| SASI_Hs01_00153668_AS | UAUGUUCUGGGUAUAGUUGdTdT | 21 | 208.9 | 6 728 | ||
| Duplex of above | 13 362 | 2 | 5 | |||
| NC | UUCUCCGAACGUGUCACGUTT | 21 | 196.2 | 6 563 | ||
| NC_AS | ACGUGACACGUUCGGAGAATT | 21 | 213.6 | 6 712 | ||
| Duplex of above | 13 275 | 1 | 2.5 | |||
1.2 方法 1.2.1 细胞培养
复苏细胞后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置入饱和湿度、37 ℃、5% CO2培养箱中，待细胞贴壁生长融合度达到80%后，进行传代培养。
1.2.2 siRNA筛选均匀地接种并培养细胞(5×104/孔)，次日待细胞融合度约40%时分别用浓度为25、50、100 nmol/L的NCsiRNA、SIRT1_66siRNA (SASI_Hs01_00153666)、SIRT1_67siRNA (SASI_Hs01_00153667)、SIRT1_68siRNA (SASI_Hs01_00153668)进行转染，转染24 h后弃培养基并收集细胞，用于PCR及Western blotting检测并验证siRNA干扰效率。
1.2.3 qRT-PCRTrizol溶液充分裂解收集的细胞，提取细胞总RNA，检测其纯度及完整性。内参片段18srRNA-112 bp；目的片段SIRT1-205 bp。SIRT1的上游引物序列为5’-AAGATGACGTCTTATCCTCT-3’，下游引物序列为5’-GCTTCATTAATTGCCTCTTG-3’，18srRNA的上游引物序列为5’-CCTGGATACCGCAG CTAGGA-3’，下游引物序列为5’-GCGGCGCAATAC GAATGCCCC-3’。反应体系总体积20 µL，其中cDNA (1︰20稀释) 5.0 µL、上游引物0.5 µL、下游引物0.5 µL、2×SYBR Green qPCR SuperMix 10 µL、dH2O 4.0 µL。反应条件为50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40个循环。分析融解曲线，计算结果。
1.2.4 Western blotting提取细胞总蛋白，用BCA法测量蛋白质浓度；取待测蛋白样品行SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部止；冰水浴中电转移至PVDF膜上，TBST洗膜；5%脱脂奶粉溶液4 ℃封闭过夜；TBST洗膜，加入SIRT1一抗(1︰1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜，加入相应的二抗(1 ︰10 000稀释)，37 ℃孵育1 h，洗膜后均匀涂抹荧光发光底物，曝光显影。
1.2.5 细胞爬片裁剪合适大小的爬片，消毒后备用。无菌条件下，将细胞传代到玻片上，培养24 h，使细胞适当扩增，取出玻片进行固定。
1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖实验分3组，即空白(TPC-1)组、阴性对照(NCsiRNA)组及实验(SIRT1 siRNA)组。取对数生长期细胞，调整各组细胞浓度，接种至96孔板(1×104/孔)；每组设置3个复孔。细胞贴壁后收集0、1、2、3 d的细胞，加入10 µL CCK-8溶液(1︰10)；孵育4 h后，酶标仪测定各孔吸光度值，采集OD450 nm数据。依据公式计算增殖率(同一样品) = (其他时间点OD值均值/0时OD值均值-1) ×100%。
1.2.7 β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老向6孔板中培养的细胞加入染色固定液(1 mL/孔)，固定15 min后弃染色固定液，加入染色工作液(1 mL/孔)，37 ℃孵育过夜。普通光学显微镜下观察。
1.2.8 Hoechst染色法检测细胞凋亡向6孔板中的细胞加入Hoechst 33258染色液(1 mL/孔)，充分覆盖并在适宜温度下培养20~30 min，弃染色液，用PBS洗涤2~3次后进行荧光检测。
1.2.9 流式检测细胞凋亡及细胞周期(1)细胞凋亡检测。将含5×105个细胞的培养液移至干净的离心管内，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min后1 000 g离心5 min，弃上清，加入0.5 mL预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬，加入10 μL溴化丙啶染色液，置于冰上避光保存。立即用流式细胞仪检测分析。(2)细胞周期检测。转染48 h后取1×106细胞加入预冷的70%乙醇，4 ℃固定过夜，离心收集细胞，加入50 μg/mL碘化丙啶，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min后用流式细胞仪检测分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行分析。实验均重复3次，数据采用x±s表示，2组数据的比较采用Student’s t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 转染TPC-1的SIRT1siRNA筛选及转染效果的验证通过qRT-PCR检测对比不同序列、不同浓度的SIRT1siRNA对TPC-1细胞转染后SIRT1mRNA表达水平的影响结果，最终选择序列SASI_Hs01_00153667进行后续实验，浓度为100 nmol/L。同时，Western blotting结果证实，转染该序列、该浓度SIRT1siRNA组(实验组)的细胞较TPC-1组(空白组)及NCsiRNA组(阴性对照组)的细胞中SIRT1蛋白均呈低表达(P < 0.05)，见图 1~2。
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| 66-25, 25 nmol/L SIRT1_66siRNA; 67-25, 25 nmol/L SIRT1_67siRNA; 68-25, 25 nmol/L SIRT1_68siRNA; NC-25, 25 nmol/L NCsiRNA; 66-50, 50 nmol/L SIRT1_66siRNA; 67-50, 50 nmol/L SIRT1_67siRNA; 68-50, 50 nmol/L SIRT1_68siRNA; NC-50, 50 nmol/L NCsiRNA; 66-100, 100 nmol/L SIRT1_66siRNA; 67-100, 100 nmol/L SIRT1_67siRNA; 68-100, 100 nmol/L SIRT1_68siRNA; NC-100, 100 nmol/L NCsiRNA. 图 1 qRT-PCR检测SIRT1在经过不同干扰转染处理后的表达水平 Fig.1 Relative expression of SIRT1 determined by qRT-PCR after siRNA interference |
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| 1, TPC-1 group; 2, NCsiRNA group; 3, SIRT1siRNA group. 图 2 Western blotting检测SIRT1蛋白的表达 Fig.2 SIRT1 protein expression detected by Western blotting |
2.2 转染SIRT1siRNA的TPC-1细胞增殖变化
CCK-8法检测结果如图 3所示，与TPC-1组及NCsiRNA组相比，SIRT1siRNA组的细胞增殖能力减弱，24、48、72 h SIRT1siRNA组细胞增殖率下降，细胞增殖受到抑制(均P < 0.05)。
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| A, effect of TPC-1 cell proliferation after SIRT1 interfered; B, effect of TPC-1 cell growth curve after SIRT1 interfered. *P < 0.05 vs TPC-1 or NCsiRNA group. 图 3 CCK-8法检测细胞增殖 Fig.3 Cell proliferation determined by the CCK-8 method |
2.3 转染组TPC-1细胞的细胞衰老变化
β-半乳糖苷酶染色结果如图 4所示，SIRT1siRNA组衰老细胞比例(54.6%±2.7%)较TPC-1组细胞衰老比例(26.4%±2.2%)及NCsiRNA组细胞衰老比例(29.8%±3.4%)明显升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。提示转染SIRT1siRNA可诱导TPC-1细胞衰老。
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| A, TPC-1 cells (×100);B, cells treated with NCsiRNA (×100); C, cells treated with SIRT1 siRNA (×100);D, aging proportion of TPC-1 cell after SIRT1 interfered. *P < 0.05 vs TPC-1 or NCsiRNA group. 图 4 β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老 Fig.4 Cell aging detected viaβ-galactosidase staining |
2.4 转染组TPC-1细胞的凋亡变化
Hoechst染色结果如图 5所示，TPC-1组凋亡细胞比例为0.03±0.01 (图 5A)，NCsiRNA组凋亡细胞比例为0.03±0.02 (图 5B)，SIRT1siRNA组凋亡细胞比例为0.09±0.01 (图 5C)，SIRT1siRNA组凋亡细胞比例明显高于TPC-1组及NCsiRNA组(P < 0.05，图 5D)。
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| A, TPC-1 cells (×400);B, cells treated with NCsiRNA (×400);C, cells treated with SIRT1 siRNA (×400);D, apoptosis ratio of TPC-1 cell after SIRT1 interfered. *P < 0.05 vs TPC-1 or NCsiRNA group. 图 5 Hoechst染色法检测细胞凋亡 Fig.5 Cell apoptosis detected via Hoechst staining |
2.5 流式细胞仪检测转染组TPC细胞凋亡及周期变化
流式细胞技术检测结果显示，SIRT1siRNA处理组的总凋亡细胞比例(65.22%±0.41%，图 6C)较TPC-1组(5.84%±0.16%，图 6A)及NCsiRNA组(5.53%±0.05%，图 6B)明显升高(P < 0.05，图 6D)。细胞周期变化检测结果显示，SIRT1siRNA处理组的G1期细胞比例(67.99%±0.87%，图 7C)较TPC-1组(64.39%±0.77%，图 7A)及NCsiRNA组(64.08%± 0.53%，图 7B)明显升高(P < 0.05，图 7D)，提示SIRT1 siRNA处理组TPC细胞出现了G1期阻滞。
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| A, TPC-1 cells; B, cells treated with NCsiRNA; C, cells treated with SIRT1 siRNA; D, apoptosis proportion of TPC-1 cells after SIRT1 interfered. *P < 0.05 vs TPC-1 or NCsiRNA group. 图 6 流式细胞技术检测细胞凋亡 Fig.6 Cell apoptosis detected using flow cytometry |
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| A, TPC-1 cells; B, cells treated with NCsiRNA; C, cells treated with SIRT1 siRNA; D, cell cycle of TPC-1 cell after SIRT1 interfered. *P < 0.05 vs TPC-1 or NCsiRNA. 图 7 流式细胞技术检测细胞周期结果 Fig.7 Cell cycle analyzed using flow cytometry |
3 讨论
SIR2是一种首先在酵母中被发现的依赖NAD+组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶。Sirtuins家族是一类与SIR2同源蛋白质的总称，哺乳动物的Sirtuins家族包含了SIRT1~SIRT7的7个成员，其中SIRT1与SIR2的同源性最高[7]，亦是研究较为深入的1个成员。
SIRT1基因位于人类第10号染色体长臂上(10q22.1)，包含8个内含子和9个外显子，全长约33 000 bp，编码747个氨基酸。SIRT1蛋白位于细胞核内，其相对分子质量约为120 000 [7]。SIRT1蛋白中心含有大、小2个主要的结构域，NAD+分子与这2个结构域表面结合形成酶复合体，同时，底物通过NAD+分子的协同作用在这2个结构域的裂隙中结合并发生催化反应[8]。SIRT1对诸多底物有强大的去乙酰化作用，它在正常的胚胎发育、分化及维持自身平衡中扮演着多元化的角色，是一系列生命活动不可或缺的[9]。研究发现，SIRT1通过与不同的组蛋白和非组蛋白(如H3[10]、p53[11-12]、p21[13]、FOXOs[14-16]、Ku70[17-18]、p300[19-20]、PGC-1α[21-22]、NF-κB[23-24])相互作用，在肿瘤发生、基因沉默、DNA损伤修复、延长寿命、调控细胞分化与凋亡、调节细胞周期、调节糖脂能量代谢等[25]方面发挥不同的重要功能。通过这些不同功能的相互作用，使SIRT1在作用于不同系统、组织、器官、细胞中产生多元化的结果。研究[26-28]表明，在乳腺癌、肺癌、结肠癌中，SIRT1表达水平显著升高，它不但能加快细胞增殖，而且能抑制细胞衰老、凋亡，还可以促进细胞迁移，有肿瘤促进因子的作用。但SIMIC等[29]和SUN等[30]发现在乳腺癌及肺癌细胞中SIRT1亦能负向调节癌组织上皮细胞间质转型，从而促进癌细胞的衰老、凋亡，抑制癌细胞扩散、转移，故认为SIRT1在乳腺癌、肺癌的发生发展中起着肿瘤抑制因子的作用，而非肿瘤促进因子的作用。
本研究通过沉默体外培养人TPC细胞株TPC-1中SIRT1基因的表达，发现该细胞中SIRT1的表达水平与细胞增殖、衰老、凋亡及周期有关。本研究发现，在转染了SIRT1siRNA的TPC-1细胞中，SIRT1mRNA及蛋白的表达减少，细胞增殖明显受限，衰老细胞比例增多，凋亡细胞比例明显升高，细胞周期停滞于G1期，差异有统计学意义(P < 0.05)。
综上所述，本研究揭示了SIRT1基因沉默对人TPC细胞株TPC-1生物学功能的影响，发现转染SIRT1siRNA可降低TPC-1细胞SIRT1表达水平，使细胞周期停滞，抑制细胞增殖，并诱导癌细胞衰老及凋亡。
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