丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)存在于细胞中，是在细胞信号转导通路中发挥重要作用的丝/苏氨酸蛋白激酶。P38蛋白是MAPKs家族中重要的一员，许多生理性与化学性刺激都能激活P38的磷酸化。JOHNSON等^[1]研究发现，ERK、JNK、磷酸化P38(phosphorylated P38，p-P38)蛋白激酶所参与的细胞内信号转导通路在细胞增殖、分化、凋亡、神经元可塑性等多种生理病理过程中发挥重要作用。许力等^[2]研究发现，脊髓中的P38与TNF-α活化，抑制P38磷酸化可以减少TNF-α，提示P38可能参与疼痛的中枢敏化。P38广泛存在于脊髓和背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)，并在炎症反应中发挥着抗炎作用^[3-4]。

慢性背根神经节压迫(chronic compression of dorsal root ganglion，CCD)模型是一种外周神经病理性疼痛模型，是研究外周神经不完全性损伤的常用动物模型，本研究检测CCD大鼠DRG中p-P38表达情况，探讨p-P38在神经病理性疼痛大鼠DRG中的作用机制。

1 材料与方法 1.1 动物及分组

18只SD大鼠(160~180 g，雌性)由大连医科大学附属第一医院动物实验中心提供。室温饲养，12 h照明/12 h黑暗，水与鼠粮自由食用。实验前大鼠要适应实验室环境1 h。动物使用遵照大连医科大学动物管理委员会要求。大鼠随机均分为3组：假手术组(sham组)、CCD组、CCD模型SB203580给药组(治疗组)，每组6只。分别于术后14 d测完行为学取材。

1.2 试剂

P38抑制剂，4-(4-氟苯) -2-(4-甲磺酰苯) -5-(4-吡啶基) -1氢-咪唑(SB203580，美国Sigma公司)；内参β-actin抗体、p-P38抗体与P38抗体(美国Cell Signaling公司)。

1.3 CCD模型制备

大鼠腹腔注射l%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，用剃毛刀将腰背部的毛剃光，铺上纸巾暴露出手术野，沿着右侧脊椎从L_2-5切开皮肤、分离肌肉。将“L型” (长3 mm、直径0.6 mm)的不锈钢棒，与背部正中线成30°角，与脊柱侧面水平线成15°。分别插入L₃和L₄椎间孔，观察到大鼠右后肢抽动即为插入成功。术后腹腔注射青霉素预防感染。鞘内置管在CCD手术前实施，打开L₆的硬脑膜，将导管置入大鼠的蛛网膜下腔，大约位于L_3-4，缝合后固定导管，等待大鼠恢复24 h后再进行CCD手术。

1.4 大鼠机械疼痛阈值测试

检测大鼠后足对Von Frey丝(直径200 μm)刺激的缩足反应，使用机械缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)衡量机械疼痛的程度。大鼠放置在1个10 cm×10 cm×15 cm的透明玻璃盒中，底部放置金属网(0.5 cm×0.5 cm)。使用Von Frey丝垂直扎大鼠的足底，当大鼠后足突然扬足、缩足或舔足反应为阳性，每次刺激间隔10 min，每只大鼠重复测量5次，取平均值。

1.5 大鼠热痛阈值测试

通过检测大鼠后足底对热刺激产生的缩腿动作时间(paw withdrawal thermal latency，PWTL)来衡量热痛阈值。把待检测的大鼠单独放置于底部厚为0.22 mm的透明玻璃笼(20 cm×20 cm×40 cm)中，在安静环境下适应30 min后，使用热辐射疼痛刺激器(BME-410C，天津伯尔尼科技有限公司)在玻璃板下固定距离聚焦大鼠后足底，当大鼠产生缩足或舔足停止照射，记录照射起止的间隔时间。每只大鼠重复测量5次，间隔时间 > 5 min，取平均值作为PWTL。为避免给大鼠足底皮肤造成损伤，设置最高阈值为20 s。

1.6 Western blotting检测大鼠DRG神经元中p-P38的表达

所有蛋白取自实验大鼠L₃和L₄的DRG。每个样品总蛋白25 μg，使用10%的SDS-PAGE进行电泳，在4 ℃转膜1 h到PVDF上，使用TBST (20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5，0.15 mol/L NaCl，0.05% Tween-20)冲洗，共洗3次，每次10 min；接着用含10%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h，然后用一抗p-P38抗体(1:500) 4 ℃孵育过夜，第2天用TBST洗3次，每次10 min，之后应用二抗(1:1 000)室温孵育1 h，使用发光试剂盒(英国ECL kit公司)检测发光信号。所有实验使用等量蛋白进行P38 (1:1 000)和β-actin抗体(1:2 000)检测。p-P38和P38的蛋白条带灰度值用Image J软件(美国NIH公司)分析。

1.7 统计学分析

使用统计软件SPSS 12.0进行数据处理。实验数据用x±s表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠机械疼痛行为学结果比较

大鼠机械疼痛行为学结果显示，大鼠在进行CCD手术前对机械刺激的缩腿反应的基础阈值是20.5 g。与sham组比较，CCD组大鼠的机械缩腿阈值明显降低(P < 0.01)，并表现为时间依赖性，手术后1、3、5、7 d后持续降低，但手术后14 d大鼠的机械缩腿阈值增加，恢复近正常。与CCD组比较，治疗组大鼠除第1天外，其他时间点的机械缩腿阈值明显升高(P < 0.05)。3组大鼠在手术后14 d，机械缩腿阈值都恢复至正常，没有统计学差异(P > 0.05)。见表 1。

2.2 各组大鼠热疼痛行为学结果比较

热刺激反应结果显示，大鼠在进行CCD手术前对热刺激缩腿反射基础阈值是13 s。与sham组比较，CCD组、治疗组大鼠对热刺激的缩腿反射时间明显缩短(均P < 0.01)。鞘内注射SB203580不能改变CCD引起的热痛觉过敏，见表 1。

2.3 各组大鼠DRG中p-P38的表达

Western blotting结果显示，sham组大鼠DRG仅有少量p-P38蛋白表达。与sham组比较，CCD组大鼠手术14 d后DRG中p-P38蛋白表达明显增加(P < 0.01)。与CCD组比较，治疗组大鼠手术14 d后DRG中p-P38蛋白表达明显减少(P < 0.01)。各组大鼠P38蛋白表达没有变化。见图 1。

3 讨论

p-P38抑制剂是吡啶咪唑衍生物，主要有第一代SB202190、SB203580、SB220025，第二代SB239063等。其中，SB203580是可以通过细胞的分子，与ATP竞争性结合P38上的位点而发挥抑制作用。SB203580抑制P38磷酸化，减少脊髓中TNF-α合成，从而缓解神经病理性疼痛^[2]。

本实验结果发现，CCD能引起大鼠对机械与温度刺激的痛觉异常。提前鞘内注射SB203580能够抑制机械刺激引起的痛觉异常，对热刺激引起的痛觉异常没有作用。PIAO等^[6]研究发现，CCD引起三叉神经节损伤，激活胶质细胞与小胶质细胞中的p-P38，引起痛觉过敏。因此，SB203580可能在DRG的神经元细胞中具有相似功能，通过抑制P38的磷酸化来保护DRG中的神经元细胞，防止神经病理性疼痛的发生。

胡建雷等^[7]报道，脊髓背角中P38磷酸化，能够引起CCD大鼠的神经病理性疼痛。韩光等^[8]报道，高压氧可能通过活化脊髓中的P2X4受体，激活p38 MAPK信号通路，进而缓解CCI大鼠的机械痛与热痛。近年有学者^[9-10]报道，MAPK信号通路中的P38在炎症细胞、应激、凋亡和神经病理性疼痛中发挥着重要作用。本研究结果显示，SB203580注射可以引起大鼠DRG中p-P38蛋白表达增加。P38只是MAPK信号通路中的作用蛋白，还需要对该信号通路的上下游进行深入研究，探讨其他蛋白的表达变化情况。SB203580有可能通过增加p-P38蛋白表达，从而调控下游信号通路，引起ERK-κBp65磷酸化，发挥缓解神经病理性疼痛的作用。

综上所述，SB203580能够减轻CCD所引起的机械痛，但对CCD所引起的热痛没有作用。p-P38蛋白可能是神经病理性疼痛的作用靶点，今后有可能指导临床用于缓解慢性疼痛。