2018, Vol. 47文章信息
- 丁仁彧, 肇冬梅, 胡紫薇, 王亮, 李鑫, 孙旖旎, 章志丹, 马晓春
- DING Renyu, ZHAO Dongmei, HU Ziwei, WANG Liang, LI Xin, SUN Yini, ZHANG Zhidan, MA Xiaochun
- Rho激酶抑制剂通过抑制Toll样受体4和核因子κB信号通路缓解脂多糖诱导的肾损伤
- Rho-kinase Inhibitor Ameliorates Lipopolysaccharide-induced Kidney Injury by Inhibiting Toll-like Receptor 4 and Nuclear Factor-κB Signaling Pathway
- 中国医科大学学报, 2018, 47(1): 1-5
- Journal of China Medical University, 2018, 47(1): 1-5
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文章历史
- 收稿日期：2017-04-28
- 网络出版时间：2017-12-20 14:17
引用本文 |
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是脓毒症常见的并发症，病死率高[1-2]。研究[3]表明，脓毒症AKI病理生理机制复杂，包括炎症反应、肾内血流动力学改变、内皮功能紊乱、微循环障碍以及肾小球内微血栓形成等，而炎症反应一般被认为是导致AKI的直接机制[4]。
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌的细胞膜成分，是导致AKI的主要因素之一[5-6]。研究[7]表明，LPS通过激活Toll样受体4 (Toll like receptor 4，TLR4) /核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)信号转导通路，产生大量促炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6 (interleukin-6，IL-6)、IL-1β，这些炎症介质在LPS诱导的肾损伤中起重要的作用。
Rho激酶(Rho kinase，ROCK)是影响细胞功能的关键信号蛋白，参与细胞骨架重构、细胞的黏附和迁移、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的形成、细胞凋亡等[7-8]。本研究组在前期研究中发现ROCK抑制剂(法舒地尔)预处理能减少LPS诱导的炎症反应，减轻肺损伤，降低内毒素血症小鼠的死亡率[10]。然而，ROCK抑制剂对内毒素诱导肾损伤的影响及其分子生物学机制尚未阐明。本研究通过建立内毒素血症小鼠模型，检测肾损伤程度以及炎症相关指标，探讨ROCK特异性抑制剂Y-27632对内毒素血症小鼠肾损伤的影响及其分子生物学机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂capase-3、TLR4、磷酸化NF-κBp65抗体(北京博奥森生物技术公司)；LPS来源于大肠杆菌O55：B5 (Sigma-Aldrich公司)；Y-27632 (美国Selleck Chemicals公司)；尿素氮(urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TIANScript cDNA第一链合成试剂盒、总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.1.2 实验动物分组及模型制备8~10周龄雄性C57BL/6小鼠(共24只)，体质量20~25 g，购自中国医科大学动物部。将小鼠随机分为正常对照(control)组，LPS组，LPS+ Y-27632组，每组8只。腹腔内注射LPS (30 mg/kg)建立内毒素血症小鼠模型。于造模前18 h和1 h，给予LPS+Y-27632组ROCK特异性抑制剂Y-27632 (10 mg/kg)，正常对照组和LPS组在相应时间点予以等量生理盐水腹腔注射。造模8 h后，麻醉小鼠，心脏采血并处死，留取血清和肾脏组织做进一步分析。
1.2 方法 1.2.1 血清BUN和Cr水平测定将血液离心10 min (4 ℃，3 000 r/min)，提取上清液保存；根据试剂盒的说明书完成BUN和Cr测定。
1.2.2 肾组织病理观察取部分肾组织置10%甲醛溶液中，依次进行脱水、石蜡包埋、制切片(厚4 μm)、苏木精-伊红(HE)染色后，光镜下观察。
1.2.3 肾脏组织免疫组化10%甲醛固定肾组织，石蜡包埋，制成切片(厚4 μm)。以二甲苯脱蜡、水化，用柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH6.0)冲洗。滴加抗caspase-3多克隆抗体(1:100稀释)，于4 ℃孵育过夜。PBS彻底冲洗后，加入二抗，室温孵育30 min，滴加DAB (二氨基联苯胺)液，苏木精复染。梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
1.2.4 肾组织TNF-α、IL-1β mRNA表达的检测利用总RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录获得cDNA，行PCR检测。TNF-α forward primer序列为5’-TTCTACTGAACTTCGGGGTGAT-3’，TNF-α reverse primer序列为5’-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3’；IL-1β forward primer序列为5’-TTTGAAGTTGACGGACCCC-3’，IL-1β reverse primer序列为5’-ATCTCCACAGCCACAATGAGTG-3’；β-actin forward primer序列为5’-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3’，β-actin reverse primer序列为5’-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3’。扩增条件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。
1.2.5 Western blotting检测取部分肾组织置于冰冷的匀浆缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，2.7 mg/mL肝素)中进行匀浆，12 000 r/min离心10 min后，收集上清液。BCA法测定蛋白浓度，上样，电泳，转膜。4 ℃封闭过夜。一抗、二抗室温孵育2 h。暗室内曝光，显像，扫描结果并进行图像分析，以平均光密度值为标准对各组TLR4和磷酸化NF-κBp65蛋白进行评定。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，2组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ROCK抑制剂Y-27632预处理缓解LPS诱导的AKI如图 1所示，与对照组相比，LPS组小鼠肾组织内可见炎性细胞浸润，肾小管结构紊乱，部分刷状缘脱落(图 1B)，而LPS+Y-27632组肾损伤程度较LPS组明显减轻(图 1C)；LPS组小鼠血清中BUN和Cr水平较对照组明显升高(P < 0.001)，LPS+Y-27632组较LPS组则显著降低(P < 0.01)。
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| A to C, representative histologic features of liver from control (A), LPS (B) and LPS+ Y-27632 (C) group (×400);D to E, the serum BUN and Cr levels at 8 hours after LPS challenge. *P < 0.001 vs control group; #P < 0.01 and ## P < 0.001 vs LPS group. 图 1 ROCK抑制剂Y-27632预处理对LPS诱导肾损伤的影响 Fig.1 Effect of Rho kinase inhibitor Y-27632 pretreatment on acute kidney injury after LPS challenge |
2.2 ROCK抑制剂Y-27632预处理抑制内毒素血症小鼠肾脏凋亡蛋白caspase-3的表达
caspase-3是细胞凋亡的关键介质，因此，本研究用免疫组化法检测了3组小鼠肾组织中caspase-3蛋白的表达情况，如图 2所示，LPS组内毒素血症小鼠的肾脏中caspase-3表达显著增加；与LPS组相比，Y-27632预处理则明显减少了caspase-3的表达。
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| A to C, IHC staining with caspase-3 antibody of kidney sections from control (A), LPS (B) and LPS+Y-27632 (C) group. 图 2 ROCK抑制剂Y-27632预处理对内毒素诱导的肾脏caspase-3蛋白表达的影响 ×400 Fig.2 Effect of Rho kinase inhibitor Y-27632 pretreatment on caspase-3 expression in mouse kidney after LPS challenge ×400 |
2.3 ROCK抑制剂Y-27632降低内毒素血症小鼠肾脏炎性细胞因子的表达水平
注射LPS后8 h，LPS组小鼠肾脏TNF-α和IL-1β mRNA的表达较对照组显著升高(P < 0.001)；与LPS组相比，Y-27632预处理则能显著下调内毒素诱导的TNF-α和IL-1β mRNA表达(P < 0.001)。见图 3。
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| A, TNF-α; B, IL-1β. * P < 0.001 vs control group; # P < 0.001 vs LPS group. 图 3 ROCK抑制剂Y-27632预处理对内毒素诱导的肾脏炎性细胞因子表达的影响 Fig.3 Effect of Rho kinase inhibitor Y-27632 pretreatment on proinflammatory cytokine expression in mouse kidney after LPS challenge |
2.4 ROCK抑制剂Y-27632下调内毒素血症小鼠肾脏TLR4蛋白表达及NF-κBp65磷酸化水平
如图 4所示，与对照组相比，LPS组内毒素血症小鼠的肾脏组织中TLR4蛋白的表达以及NF-κBp65磷酸化均显著增加(P < 0.001)；与LPS组相比，Y-27632预处理则明显降低内毒素血症小鼠肾脏TLR4蛋白的表达以及NF-κBp65磷酸化水平(P < 0.01)。
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| * P < 0.001 vs control group; # P < 0.01 and ## P < 0.001 vs LPS group. 图 4 ROCK抑制剂Y-27632预处理对内毒素血症小鼠肾脏TLR4表达以及NF-κB磷酸化的影响 Fig.4 Effect of Rho kinase inhibitor Y-27632 pretreatment on TLR4 protein expression and NF-κBp65 phosphorylation in kidney tissue of endotoxemia mice |
3 讨论
本研究成功构建了内毒素肾损伤的动物模型，LPS显著上调了小鼠肾脏中炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的表达。这些细胞因子已被证明在LPS诱导的AKI的发病机制中发挥着重要的作用[11-13]，抑制这些炎性细胞因子的表达可以防止LPS诱导的AKI [14]。
越来越多的研究[10, 15-16]表明，ROCK参与了机体的炎症与免疫反应，包括炎症细胞的迁移、趋化因子和炎性细胞因子的产生。有文献[16]报道，ROCK抑制剂可能在脓毒症模型中发挥有益的作用。HASAN等[17]的研究也表明，ROCK能够调控腹腔感染小鼠T淋巴细胞功能障碍，ROCK抑制剂预处理可以降低脓毒症小鼠的全身炎症反应，抑制脓毒症诱发T细胞凋亡。研究[10]表明，ROCK抑制剂能够减轻LPS诱导的全身炎症反应，降低内毒素血症小鼠的死亡率。本研究中，进一步评估了ROCK抑制剂Y-27632对LPS诱导的小鼠AKI的保护作用，结果表明，Y-27632通过抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的生成缓解了LPS诱发的AKI。另外，Y-27632还显著下调了内毒素血症小鼠肾脏caspase-3的表达，提示Y-27632还可能通过抑制LPS诱导的细胞凋亡发挥肾脏保护作用。
Toll样受体(Toll like receptor，TLR)做为一种重要的模式识别受体，参与生物体的先天性免疫反应和炎症反应[18-20]。病原体感染机体时，各种不同的疾病相关分子模式被TLR识别，帮助先天免疫细胞识别微生物病原体，并引发适当的免疫反应[19-20]。LPS可通过与细胞膜上的受体TLR4结合，使TLR4胞内段招募特异接头蛋白MyD88，在信号介导分子肿瘤坏死因子相关因子6的作用下激活IκB激酶复合体，后者磷酸化IκB蛋白，导致IκB蛋白被泛素化和溶酶体降解，于是NF-κB被释放出来。活化的NF-κB进一步被磷酸化激活并转移入核，进而诱导下游一系列特异基因的表达[21-22]。以往的研究[23-25]表明，TLR4以及NF-κB的活化在LPS诱导的AKI中发挥重要作用。而且，NF-κB亚基p65的磷酸化水平常被用来间接反映NF-κB的活化[26]。本研究进一步探讨了ROCK抑制剂调控内毒素血症小鼠肾脏炎症反应的可能机制，结果显示，Y-27632能够显著抑制LPS诱导的TLR4表达以及NF-κB的活化。
综上所述，本研究结果表明，ROCK抑制剂Y-27632可以明显减轻内毒素诱导的肾损伤，且Y-27632可能通过抑制TLR4和NF-κB信号通路降低内毒素血症小鼠肾脏的炎症反应。
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