犬乳腺肿瘤是犬最常见的肿瘤之一，严重影响犬的生命健康，在兽医临床上备受关注^[1]。犬乳腺肿瘤是一种具有复杂背景的异质性疾病，该疾病主要发生在未绝育的中小型雌犬上，其中，41%~53%的病例恶性程度较高，并且肿瘤有转移倾向，引起肿瘤的发生与多种因素的相互作用有关^[2-3]。犬乳腺肿瘤的早期症状不明显，并且犬乳腺肿瘤的发生发展机制尚未清楚，往往确诊的犬已经处于肿瘤发生的晚期，因此从分子机制上深入探讨犬乳腺肿瘤的发生发展至关重要。THBS1是血小板凝血酶蛋白家族(thrombospondin，THBS)中第一个被确定的成员，最初发现于血小板中，是可以由许多细胞合成和分泌的糖蛋白^[4]。THBS1不仅能够调节细胞的生物学功能、血管形成、蛋白质-蛋白质和蛋白质-黏多糖的相互作用，还参与了复杂的细胞凋亡过程，在各类肿瘤的凋亡机制方面起重要作用^[5-7]。在前期的研究中，作者发现THBS1 mRNA在犬乳腺肿瘤中高表达，并且犬乳腺肿瘤组织的THBS1 mRNA表达水平与患犬的纯杂品种具有显著性相关^[8]。目前，THBS1在犬临床上少有报道，研究THBS1对犬乳腺肿瘤发生发展的作用机制，可以为后续犬乳腺肿瘤的分子机制的深入研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞及质粒 　　人胚胎肾上皮细胞HEK293T、犬乳腺肿瘤细胞CHMp、慢病毒三质粒(pCDH-CMV-MCS-3flag-TST-EF1-CopGFP-T2A-Puro、PsPaX2、PMD2.G)以及逆病毒基因沉默质粒pSuper.Retro.Neo+GFP均由华南农业大学兽医学院外科教研室保存。

1.1.2 主要试剂产品及耗材 　　同源重组试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；限制性核酸内切酶购自宝日医生物技术有限公司；胎牛血清FBS、高糖培养基DMEM和磷酸盐缓冲液PBS购自以色列Biological Industries公司；Lipofectamine^TM 3000 reagent转染试剂购自赛默飞世尔科技有限公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；高效RIPA组织/细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；通用RNA提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自翌圣生物科技股份有限公司；鼠源单克隆抗体购自美国优宁维生物有限公司等。

1.1.3 主要仪器 　　QuantStudio 5荧光定量PCR仪、NanoDrop^TM微量分光光度计、细胞培养箱、细胞计数仪(赛默飞世尔科技有限公司)；凝胶电泳成像系统、红外双色激光成像系统(香港基因有限公司)；倒置荧光显微镜(德国徕卡微系统有限公司)；恒温培养箱(上海智城仪器有限公司)；核酸胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)；流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 THBS1慢病毒过表达载体的构建 　　根据NCBI发布的犬THBS1(GenBank登录号：XM_038441944.1)的序列及慢病毒质粒的序列，采用同源重组方法，设计THBS1基因全长CDS区的扩增引物，CDH-THBS1-F: 5′-gacaagggtaccccgctcgag-ATGGGGCTGGCCTGGGCA-3′，pCDH-THBS1-R: 5′-gatccttgcggccgcggatccTTAGGAATCTCTGCATTCGTATTTCA-3′，序列小写部分是5′端添加的质粒重组序列，下划线部分分别是XhoⅠ和Bam HⅠ酶切位点，引物由天一辉远基因科技有限公司合成。以犬乳腺肿瘤细胞CHMp提取的RNA反转录成cDNA作为模版进行PCR扩增，以获得THBS1基因。使用限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ对慢病毒质粒进行双酶切后，根据同源重组试剂盒将目的片段与慢病毒载体连接。将同源重组产物转化入DH5α感受态细胞，在氨苄抗性琼脂培养基上筛选培养后进行菌液PCR鉴定，选取结果为阳性的菌液样品送测序，测序结果正确的重组质粒命名为pCDH-THBS1。

1.2.2 慢病毒包装、感染及药物筛选稳定细胞系 　　将pCDH-THBS1质粒、pMD2.G质粒、PsPaX2质粒按3∶2∶2的比例用Lipofectamine^TM3000试剂共转染到HEK293T细胞中进行慢病毒包装。转染48 h后收集慢病毒液感染CHMp细胞。用不同终浓度(1、2、4、6、8、10、12 μg·mL^－1)嘌呤霉素筛选CHMp细胞的嘌呤霉素最适杀灭浓度，培养48 h后细胞基本死光的最低浓度即为嘌呤霉素最适筛选浓度。向感染慢病毒的CHMp细胞中加入筛选好浓度的嘌呤霉素，进行筛选直至CHMp细胞基本不死亡，筛选得到的THBS1慢病毒过表达细胞系命名为THBS1-CHMp、慢病毒空载细胞系命名为pCDH-CHMp。

1.2.3 靶向THBS1的沉默载体构建 　　根据犬的THBS1基因序列，设计靶向THBS1基因的特异寡肽核苷酸序列引物，同时设计了一条非特异的对照序列，具体序列如表 1。将合成的寡核苷酸序列通过PCR反应生成双链核苷酸延伸物：配制正反义链核苷酸各2 μL、10xDNA连接酶buffer 5 μL和ddH₂O 41 μL的体系，在PCR仪中设置相应程序进行连接反应，反应程序：1)95 ℃反应10 min；2)从95 ℃开始每8 s下降0.1 ℃，进行700个循环；3)得到核苷酸延伸物。使用内切酶BglⅡ和HindⅢ对沉默质粒进行双酶切后与核苷酸延伸物进行连接，得到沉默重组质粒。

1.2.4 沉默重组质粒的鉴定及转染 　　得到的重组质粒转化入感受态细胞，在氨苄抗性培养基上进行筛选培养，取阳性单菌落进行增殖培养后，提取重组质粒。使用Eco RI和Xho I内切酶对沉默重组质粒进行鉴定，将酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序，将序列正确的重组质粒用Lipofectamine^TM3000试剂共转染到CHMp细胞中，得到shRNA-THBS1-CHMp和shRNA-NC-CHMp细胞系。

1.2.5 CCK-8试验检测THBS1对CHMp细胞增殖能力的影响 　　取生长状态良好的细胞，将细胞密度稀释至1×10³·100 μL^－1，接种于96孔细胞培养板，设置3个重复组，以接种细胞的时间定位为0 h，向细胞培养板中每孔加入10 μL的CCK Solution，在细胞培养箱中培养3 h后，用酶标仪在450 nm波长处检测OD值。每隔24 h，重复上述操作，直至72 h，以时间(h)为横坐标，细胞OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，并根据公式：[(试验孔—空白孔)/(对照孔—空白孔)]×100%，计算各个细胞的存活率。

1.2.6 划痕试验检测THBS1对CHMp细胞迁移能力的影响 　　将细胞密度稀释成1×10⁶·孔^－1，接种于6孔细胞培养板，待细胞密度达到80%~90%时，用10 μL枪头垂直于背面所画的横线，对贴壁细胞进行划痕，然后用PBS将划痕划下的细胞洗涤干净，在显微镜下拍照。加入无血清培养基继续培养细胞，分别在12和24 h后再次拍照，结果用Image J软件分析细胞迁移的面积，通过细胞迁移面积的变化判断THBS1对CHMp细胞迁移能力的影响。

1.2.7 Transwell试验检测THBS1对CHMp细胞侵袭能力的影响 　　往Transwell小室中央加入60 μL稀释好的基质胶，将Transwell小室置于恒温细胞培养箱中进行风干，待Matrigel基质胶凝固后，将小室中的残余液体吸出，往小室中加入200 μL稀释好的细胞悬液(5×10⁵·mL^－1)。在24孔板中加入500 μL完全培养基，然后将Transwell小室放入24孔板中，置于细胞培养箱中培养24 h。经过漂洗、固定、染色液后。用棉签轻轻擦去小室内膜上未侵袭成功的细胞，在显微镜下观察滤膜底附着的细胞数并拍照，选取5个视野进行计数，取平均值进行统计学分析。

1.2.8 THBS1对CHMp细胞的细胞周期的影响 　　将细胞密度稀释成1×10⁶·孔^－1，接种于6孔细胞培养板，待细胞密度达到80%~90%时，参照细胞周期检测试剂盒收集细胞，进行细胞固定、碘化丙啶染色液的配制及染色，最后通过流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光，采用FlowJo软件分析细胞DNA含量情况。

1.2.9 THBS1对CHMp细胞的细胞凋亡的影响 　　参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，使用原位荧光检测方法，将细胞悬液的密度稀释成5×10⁵·mL^－1，接种于48孔细胞培养板，在细胞培养箱中培养24 h后，加入195 μL Annexin V-FITC结合液和5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。再加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻晃动混匀，室温避光孵育20 min，置于冰浴中，随即在荧光显微镜下观察、拍照。

1.2.10 qRT-PCR检测THBS1对细胞凋亡相关因子的mRNA表达量的影响 　　提取各个细胞的总RNA，将RNA反转成cDNA，qRT-PCR检测Bcl-2、Bax和p53 3种因子的mRNA，以ACTB基因作为内参基因，各因子的引物序列如表 2，反应条件：1)95 ℃预变性30 s；2)循环反应：95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40个循环；3)熔解曲线：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。每个样品做3个重复，使用2^-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。

1.2.11 Western blot检测THBS1对细胞凋亡相关蛋白表达量的影响 　　提取细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液，用沸水煮样10 min，冷却至室温后进行SDS-PAGE电泳，然后进行转膜，经过洗膜、封闭、孵育鼠源单克隆抗体、回收抗体、洗膜、孵育抗鼠二抗等操作后，进行Western blot分析Bcl-2、Bax、和P53蛋白的表达量。Western blot的结果通过Image J软件分析蛋白条带的灰度值，根据目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值的比值算出相对表达量。

2 结果 2.1 THBS1过表达细胞系及沉默表达细胞系的构建

对CHMp细胞的嘌呤霉素最适杀灭浓度进行筛选得出最适筛选浓度为4 μg·mL^－1。慢病毒液感染CHMp细胞后，用最适浓度的嘌呤霉素进行筛选得到慢病毒稳定过表达细胞系。将靶向THBS1基因的核苷酸延伸物与沉默质粒进行连接，使用双酶切方法对沉默重组质粒进行鉴定，结果如图 1，阳性重组质粒双酶切后，在约281 bp大小处有条带，符合阳性重组沉默质粒双酶切后的目的条带；而沉默空载质粒双酶切后大约在1 200 bp有条带，在约281 bp大小处的没有条带。将沉默重组质粒转染进CHMp细胞得到THBS1沉默表达细胞系。

2.2 CCK-8试验检测THBS1对CHMp细胞增殖能力的影响

通过连续4 d的检测，用测量的OD值变化以及细胞存活率反映细胞的增殖情况，绘制细胞生长曲线如图 2A所示，细胞存活率如图 2B所示：在第3天检测的细胞OD值中，过表达组THBS1-CHMp细胞的OD值和存活率极显著(P < 0.01)高于CHMp和pCDH-CHMp细胞，表明在THBS1过表达的CHMp细胞中，细胞的增殖能力明显增强；而沉默组shRNA-THBS1-CHMp细胞的OD值和存活率明显低于CHMp和shRNA-NC-CHMp细胞(P < 0.01)，表明在沉默THBS1表达的CHMp细胞中，细胞的增殖能力明显减弱。

2.3 划痕试验检测THBS1对CHMp细胞迁移能力的影响

各个细胞划痕后的横向迁移结果如图 3A和3B所示。通过Image J软件分析各个细胞划痕后的横向迁移面积的变化，结果如图 3C所示：在THBS1过表达组中，划痕间隔12 h后，THBS1-CHMp细胞的横向迁移面积与CHMp和pCDH-CHMp细胞相比无统计学差异(P>0.05)，在划痕间隔24 h后，THBS1-CHMp细胞的横向迁移面积明显大于CHMp和pCDH-CHMp细胞(P < 0.01)；在THBS1沉默表达组中(3D图)，划痕间隔12和24 h后测量shRNA-THBS1-CHMp细胞的横向迁移面积均显著小于CHMp和shRNA-NC-CHMp细胞的横向迁移面积(P < 0.05, P < 0.01)。

2.4 Transwell试验检测THBS1对CHMp细胞侵袭能力的影响

在显微镜下观察各个细胞系侵袭的细胞数，结果如图 4A、4B所示。选取5个视野进行计数和统计学分析，结果如图 4C所示：过表达组THBS1-CHMp细胞的侵袭数量均明显多于CHMp细胞和pCDH-CHMp细胞(P < 0.01)；而沉默组shRNA-THBS1-CHMp细胞的侵袭数量均明显少于CHMp和shRNA-NC-CHMp细胞(P < 0.05)。

2.5 流式细胞术检测THBS1对CHMp细胞周期的影响

细胞周期分布情况结果如图 5A~F所示。将每种细胞的3个重复按G0/G1期、S期、G2/M期进行统计学分析，结果如图 5G所示：在THBS1过表达组中，THBS1-CHMp细胞在G0/G1期的细胞数量的占比百分量均显著少于CHMp细胞和pCDH-CHMp细胞在G0/G1期的细胞数量的占比百分量(P < 0.01)，而THBS1-CHMp细胞的S期和G2/M期细胞数量的占比百分量却明显多于对照组和空载对照组(P < 0.01)；在沉默THBS1表达组中，shRNA-THBS1-CHMp细胞在G0/G1期细胞数量的占比百分量均显著多于对照组CHMp细胞和空载组shRNA-NC-CHMp细胞(P < 0.01)，而shRNA-THBS1-CHMp细胞的S期和G2/M期细胞数量的占比百分量均显著少于对照组和空载对照组(P < 0.01)。

2.6 THBS1对CHMp细胞凋亡的影响

通过Annexin V-FITC和碘化丙啶双染处理细胞，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况如图 6A所示，绿色荧光：Annexin V-FITC染色阳性细胞；红色荧光：PI染色阳性细胞。进行统计学分析的结果如图 6B所示：过表达组THBS1-CHMp细胞的细胞凋亡数量均明显少于对照组CHMp细胞和空载组pCDH-CHMp细胞(P < 0.01)；而沉默试验组shRNA-THBS1-CHMp细胞的细胞凋亡数量均明显多于CHMp和shRNA-NC-CHMp细胞(P < 0.01)。

2.7 qRT-PCR检测与细胞凋亡相关因子的mRNA表达量

为了进一步探讨THBS1在细胞凋亡方面的调控作用，采用qRT-PCR方法检测了p53、Bcl-2和Bax的mRNA表达量，结果如图 7所示：过表达试验组THBS1-CHMp细胞的p53和Bcl-2 mRNA表达量均明显增高，结果均具有显著性差异(P < 0.01)，而Bax mRNA的表达量明显减少(P < 0.01)；在沉默试验组shRNA-THBS1-CHMp细胞中，p53 mRNA和Bcl-2 mRNA的表达量均明显减少(P < 0.01)，而Bax mRNA的表达量明显增加(P < 0.01)。

2.8 Western blot检测与细胞凋亡相关蛋白的表达量

Western blot方法检测p53、Bcl-2和Bax蛋白表达量的结果如图 8A所示。通过Image J软件对Western blot的结果进行灰度值分析，以GAPDH作为内参蛋白，对p53、Bcl-2和Bax蛋白进行相对表达量的分析，结果如图 8B所示：过表达试验组THBS1-CHMp细胞的p53和Bcl-2蛋白表达量均明显增高(P < 0.01)，而Bax蛋白的表达量明显减少(P < 0.01)；在沉默试验组shRNA-THBS1-CHMp细胞中，p53和Bcl-2蛋白的表达量均明显减少(P < 0.01)，而Bax蛋白的表达量明显增加，结果具有显著性差异(P < 0.01)。

3 讨论

近年来，随着犬数量的增多，犬乳腺肿瘤病例中出现的频率越来越高，该病也得到了宠物主人和宠物医生的密切关注。目前，兽医技术水平发展有限，也反映出相关科学巨大的研究空间^[9]。THBS1作为一种细胞膜表面的黏附蛋白，通过影响肿瘤微环境从而影响多种癌症的发生发展^[10]。基于THBS1与犬乳腺肿瘤的关系未知，研究THBS1对犬乳腺肿瘤的影响具有重要意义，为研究THBS1对犬乳腺肿瘤细胞CHMp的影响提供了材料和平台，同时为犬乳腺肿瘤的其他分子机制研究提供了参考。

3.1 THBS1对犬乳腺肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

犬乳腺肿瘤发展的过程表现出细胞无序地增殖，即细胞的增殖能力变强，细胞疯狂地增殖以满足肿瘤块的生长和肿瘤微环境的形成。研究表明，犬乳腺肿瘤往往会表现出迁移性，根据肿瘤的分级，恶性肿瘤还表现出明显的侵袭性，利于肿瘤在机体内的发展^[11-13]。据报道，THBS1可以促进癌细胞迁移，参与肿瘤的血管形成，与肿瘤的侵袭和转移密切相关^[14-15]。本研究在细胞水平上探讨了THBS1对犬乳腺肿瘤细胞生物学功能的影响。通过CCK-8试验和平板克隆形成试验、划痕试验、Transwell试验发现，过表达THBS1能有效促进犬乳腺肿瘤细胞CHMp的增殖、迁移、侵袭，而沉默THBS1表达能有效抑制CHMp细胞的增殖、迁移、侵袭。本研究结果与其他人报道THBS1在其他肿瘤上的作用相一致，也证明了THBS1在犬乳腺肿瘤上的潜在作用^{[6, 16]}。综上表明，THBS1能够影响犬乳腺肿瘤细胞CHMp的增殖、迁移、侵袭生物学功能，进而表明THBS1潜在参与影响犬乳腺肿瘤进展。

3.2 THBS1对犬乳腺肿瘤细胞CHMp细胞周期的影响

在正常的细胞周期中，细胞在G0/G1期会进行大量的物质合成，为DNA的合成做准备，在S期开始合成DNA和组蛋白，细胞在G2/M期DNA复制结束并且处于有丝分裂之间的间隙，即根据细胞S+M时期的百分比就可以判断处理后的细胞增殖能力。而肿瘤的形成是一种无序生长的过程，其细胞周期分布受到影响，进而影响细胞的DNA合成，最终导致细胞增殖特性的改变而影响肿瘤的发展^[17-18]。本研究通过流式细胞术检测细胞周期，得出在THBS1过表达的CHMp细胞中G0/G1期的细胞百分比明显减少，S期+G2/M期的细胞百分比增加；而沉默THBS1表达后CHMp细胞在G0/G1期的细胞百分比明显增多，S期+G2/M期的细胞百分比减少。细胞的S期+G2/M期是DNA合成的关键时期，这个时期被阻断，或者细胞周期停滞在G0/G1期，表明正常的细胞周期被破坏，即THBS1能够影响犬乳腺肿瘤细胞CHMp的细胞周期分布，进而影响犬乳腺肿瘤细胞CHMp的增殖特性，最终影响肿瘤的形成。

3.3 THBS1对犬乳腺肿瘤细胞凋亡的影响

在肿瘤进展中，细胞促凋亡基因和抑凋亡基因的表达往往出现异常，进而导致相关凋亡信号通路受到抑制。本研究通过原位荧光检测发现在THBS1过表达的CHMp细胞中，凋亡细胞的数量明显减少；而在沉默THBS1表达的CHMp细胞中，凋亡细胞的数量明显增多。Bcl-2、Bax和p53是与细胞凋亡相关的研究热点分子，在癌细胞凋亡方面起着重要作用，p53基因还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能，这点在肿瘤中表现最明显，是机体维持自身基因复制稳定的关键^[19-20]。本研究通过qRT-PCR和Western blot试验进一步探讨THBS1的异常表达对细胞凋亡相关因子表达影响，发现THBS1过表达后，CHMp细胞中p53和Bcl-2的表达量均明显增高，而Bax的表达量明显减少；在沉默THBS1后，CHMp细胞中p53和Bcl-2的表达量均明显减少，而Bax的表达量明显增加。表明THBS1的异常表达会影响CHMp细胞中p53、Bcl-2和Bax表达量，这与前人在相关癌症上的报道相一致。即THBS1通过调控细胞凋亡相关因子的表达进而影响凋亡相关通路，在犬乳腺肿瘤发挥重要作用，最终导致肿瘤的形成。以上结果与前面的犬乳腺肿瘤细胞生物学功能和细胞周期的检测结果相符，更加证明了THBS1在参与犬乳腺肿瘤发生发展方面的重要作用。

4 结论

本研究证实了THBS1的异常表达能够影响犬乳腺肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭、细胞周期以及细胞凋亡。此外，THBS1异常表达可以调控细胞凋亡关键因子p53、Bcl-2和Bax的表达，进而调控犬乳腺肿瘤的细胞凋亡通路，最终影响犬乳腺肿瘤的发展。