2. 中国农业科学院兰州兽医 研究所, 家畜疫病病原生物学国家重点实验室, 兰州 730046
, CHEN Qiwei2, GONG Xiaowei2, WANG Yanping2, QIN Mingxing1, ZHU Yujia1, ZHENG Fuying2
, LIN Guozhen1
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，R. anatipestifer)是黄杆菌科里默氏菌属的一种杆状或椭圆状、无芽胞、无鞭毛、可形成荚膜的革兰阴性菌。该菌主要感染1~5周龄的雏鸭，可通过呼吸道、皮肤伤口和消化道等多种途径导致鸭的急性或慢性败血症和浆膜炎。目前公认的鸭疫里默氏杆菌的血清型有21种，我国主要流行的菌株为血清1型、2型和10型。目前鸭疫里默氏杆菌在全国均有流行，血清型也不尽相同，并且不同血清型的菌株之间无交叉保护作用，给疫苗预防增加了很大难度。所以利用抗生素进行预防和治疗成为控制鸭疫里默氏杆菌感染和流行的重要手段，同时很大程度上增加了多重耐药菌株的出现和传播[1]。
细菌耐药可分为固有性耐药和获得性耐药两大类。细菌的耐药机制有多种，如外排泵的外排、细胞膜通透性的改变、药物靶点基因的突变、灭活酶、钝化酶、修饰酶的产生等[2]。外排泵系统是介导细菌固有性和获得性耐药的一种主要机制，研究外排泵使我们更加了解转运蛋白的结构和功能[3]。到目前为止，已经发现了8种与细菌多重耐药相关的外排泵，其中有近一半属于普遍存在的ABC和MFS蛋白家族[4-5]。
MFS转运蛋白家族是目前已知的最大的膜转运蛋白家族之一，存在于从细菌到植物和哺乳动物的所有门中，其功能与许多生命活动息息相关[6]，通常作为单组分泵，能够将小溶质通过内膜转运。MFS转运蛋白主要作用于糖的吸收，但一些MFS蛋白也参与药物外排，从而导致细菌产生耐药性[7]。我们的前期研究发现多株鸭疫里默氏杆菌为多重耐药菌，对其进行全基因组测序和比较基因组学分析，并应用qPCR、EB外排、CCCP和PAβN外排泵抑制剂等方法进行研究后，发现在鸭疫里默氏杆菌基因组上主要存在MFS、RND和ABC三类外排泵[8]。本试验研究的Rant蛋白属于MFS外排泵，rant基因在目前已发表的鸭疫里默氏杆菌基因组序列中高度保守，核苷酸序列相似性为89.24%~100.00%，氨基酸序列相似性为94.07%~100.00%。
rant基因在RA-LZ01株基因组中的编号为GE296_RS02115，位于458 069—459 286 bp，开放读码框大小1 218 bp，编码405个氨基酸，其蛋白分子量大小为44.5 ku。用TMHMM2.0分析其结构，发现Rant蛋白的跨膜螺旋数为12个。依据MFS蛋白序列的水解分析和拓扑学结构预测，几乎所有的MFS蛋白都具有一个统一的由亲水环连接的12个跨膜α螺旋(TMs)组成的拓扑学结构，其N-端和C-端都位于细胞质中[9]。用TMHMM2.0预测出的Rant蛋白的结构符合MFS蛋白的结构特征，支持Rant蛋白属于MFS家族。
目前关于鸭疫里默氏杆菌MFS外排泵rant基因的功能还未见报道，因此本研究以野生株RA-LZ01作为亲本株，构建rant基因缺失株Δrant和回复株cΔrant，对野生株RA-LZ01、缺失株Δrant和回复株cΔrant进行药敏试验、测定菌株的生长动态和致病性，研究rant基因在菌株耐药性、生长和毒力等方面发挥的生物学功能。
1 材料与方法 1.1 试验菌株和质粒鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01(GenBank登录号：NZ_CP045564.1)和LJW-2保存于中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病创新团队实验室；大肠杆菌ATCC25922购自美国菌种保藏中心(American type culture collection)；大肠杆菌X7213和自杀质粒pRE112购自NTCC国家典型培养物保藏中心；穿梭质粒pCPRA由本实验室构建。
1.2 培养基、试剂及仪器胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)和胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购自美国DifcoTM公司；2, 6-二氨基庚二酸(DAP)购自东京化成工业株式会社；LB肉汤、LB琼脂、抗生素均购自北京Solarbio公司；DNA Marker、限制性内切酶XbaⅠ、SphⅠ、PstⅠ、T4连接酶、质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒均购自TaKaRa(大连)公司；0.22 μm无菌硝酸纤维素滤膜和滤膜装置购自Millipore公司；紫外分光光度计购于美国Backman公司；台式高速离心机购自Beckman公司；PCR仪购自杭州博日科技公司；酶标仪购自自美国Bio-Rad公司；CO2培养箱购自美国Thermo公司；摇床购自上海苏坤实业有限公司。
1.3 引物设计本研究所用的引物的名称及其对应序列等信息见表 1，引物OmpA-F/OmpA-R引用自文献[10]，其他引物均为本研究中作者设计。引物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。
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表 1 PCR引物名称和序列 Table 1 PCR primers and sequences used in this study |
以亲本株RA-LZ01和LJW-2菌株基因组为模板，用引物Up-F/Up-R、Erm-F/Erm-R和Do-F/Do-R分别扩增出rant基因上游同源臂、红霉素基因ermF和下游同源臂，采用融合PCR将上述DNA片段依次融合，用XbaⅠ和SphⅠ将融合的DNA片段克隆至pRE112载体，转化于用CaCl2法制备的大肠杆菌X7213感受态细胞中，在含50 mg·L-1氯霉素和50 mg·L-1 DAP的LB固体平板筛选。用引物Up-F/Do-R进行PCR验证，并测序比对。得到重组自杀质粒pRE112-ErmF和阳性供体菌X7213-pRE112-ErmF[10]。
采用结合转移和同源重组的方法构建基因缺失株[10]。即将供体菌X7213-pRE112-ErmF和受体菌RA-LZ01分别培养至OD600 nm约0.6和1.0。收集菌体后用0.01 mol·L-1的MgSO4溶液洗涤、重悬后混合，用0.22 μm无菌硝酸纤维素膜过滤后将滤膜贴于含有50 mg·L-1 DAP的TSA平板，培养24 h，用MgSO4溶液洗下菌苔，在含1 mg·L-1红霉素、2 mg·L-1多黏菌素B、5%胎牛血清的TSA平板上筛选，用引物OmpA-F/OmpA-R、Rant-F/Rant-R和Erm-F/Erm-R进行PCR验证。同时用引物Rant-缺失测序-F/Rant-缺失测序-R扩增后进行测序并比对。鉴定合适的菌株命名为Δrant。
1.5 构建基因回复株cΔrant大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭质粒pCPRA系在前期工作中构建完成[11]。以亲本株RA-LZ01为模板，用引物“Co-F/Co-R”扩增出带有PstⅠ和SphⅠ酶切位点的rant基因，克隆进pCPRA载体，转化于用CaCl2法制备的大肠杆菌X7213感受态细胞中，在含100 mg·L-1氨苄和50 mg·L-1 DAP的LB固体平板上筛选。用引物“Co-F/Co-R”进行PCR扩增并进行测序比对。得到重组穿梭质粒pCPRA-Rant和阳性供体菌X7213-pCPRA-Rant。同样利用结合转移的方法将重组穿梭质粒pCPRA-Rant导入缺失株Δrant中构建回复株[10]。在含有1 mg·L-1头孢西丁的TSA平板上筛选，用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Rant-F/Rant-R”进行PCR验证，同时用引物“Rant-回复测序-F/Rant-回复测序-R”扩增后进行测序并比对。鉴定合适的回复株命名为cΔrant。
1.6 构建菌株稳定性测定缺失株Δrant在含1 mg·L-1红霉素的TSB中增菌至OD600 nm约1.0，划线于相同抗性的TSA平板，37 ℃ 5%CO2培养箱培养至长出单菌落，然后随机挑取单菌落增菌后继续划板，用此方法传30代。用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Erm-F/Erm-R”对第1、5、10、15、20、25、30代的菌液进行PCR以验证缺失株Δrant的稳定性。用同样的方法，将回复株cΔrant在含1 mg·L-1头孢西丁的TSB和TSA平板中传代，用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Co-F/Co-R”进行PCR以验证回复株cΔrant的稳定性。用引物“Rant-缺失测序-F/Rant-缺失测序-R”和“Rant-回复测序-F/Rant-回复测序-R”分别扩增第30代缺失株和回复株，测序并比对结果。
1.7 各菌株MIC的测定用微量肉汤稀释法测定抗生素对RA-LZ01、Δrant和cΔrant的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)[12-13]。大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。将抗生素用TSB在96孔板中以2倍连续稀释，抗生素浓度为0.25~128.00 mg·L-1，同时设置阴性对照(培养基)和阳性对照(菌株)。将菌液增菌至OD600 nm约1.0，用TSB将菌液浓度调整为107CFU(colony-forming unit，CFU)·mL-1，每孔加入100 μL菌液(106 CFU)。37 ℃ 5%CO2培养箱中培养24~48 h，在酶标仪中测量其OD600 nm，确定抗生素抑制菌株生长的MIC。此试验重复3次。
1.8 各菌株生长曲线测定分别将RA-LZ01、Δrant和cΔrant培养至OD600 nm约1.0，并测定每个菌株的CFU，调整每个菌株的起始浓度均为109 CFU·mL-1。以1∶100的比例分别接种至10 mL TSB中，即每个菌株的接种量均为108 CFU。37 ℃ 200 r·min-1培养，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度计测量其OD600 nm值，共测定12 h。每个菌株做3组平行试验[14-15]。
1.9 各菌株致病性测定分别将RA-LZ01、Δrant和cΔrant培养至OD600 nm约1.0，并测定每个菌株的CFU，调整每个菌株的起始浓度均为109 CFU·mL-1。将1周龄樱桃谷鸭随机分为4组，每组10只，每只腿部肌内注射100 μL菌液(108 CFU)。1~3组分别接种RA-LZ01、Δrant和cΔrant，第4组注射生理盐水作为阴性对照。攻毒后连续观察14 d制作生存曲线。
2 结果 2.1 基因缺失株Δrant和基因回复株cΔrant的构建用引物Up-F/Do-R进行PCR扩增，并对得到的PCR产物进行测序，证实成功构建重组供体菌X7213-pRE112-ErmF。用引物“OmpA-F/OmpA-R”、“Erm-F/Erm-R”和“Rant-F/Rant-R”对基因缺失株Δrant进行PCR鉴定。若ompA和ermF基因扩增出目的条带，同时rant基因不能扩增出目的条带，即为Δrant。以引物“Co-F/Co-R”进行PCR扩增并测序鉴定后，证实成功构建重组供体菌X7213-pCPRA-Rant。用引物“OmpA-F/OmpA-R”“Rant-F/Rant-R”进行PCR鉴定回复株cΔrant，若ompA和rant基因均能扩增出目的条带，即为cΔrant。同时用引物“Rant-缺失测序-F/Rant-缺失测序-R”和引物“Rant-回复测序-F/Rant-回复测序-R”扩增并测序后，证实基因缺失株和基因回复株均构建成功(图 1)。
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A. 缺失株Δrant的鉴定；B. 回复株cΔrant的鉴定；M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. ompA基因的PCR扩增；2. ermF基因的PCR扩增；3. rant基因的PCR扩增 A. Identification of the deletion strain Δrant; B. Identification of the complemented strain cΔrant; M. DL2000 DNA relative molecular mass standard; 1. PCR amplification of ompA gene; 2. PCR amplification of ermF gene; 3. PCR amplification of rant gene 图 1 缺失株Δrant和回复株cΔrant的鉴定 Fig. 1 Identification of the deletion strain Δrant and the reverting strain cΔrant |
稳定性结果显示，第1、5、10、15、20、25、30代缺失株Δrant均可扩增出ompA和ermF基因(图 2)，回复株cΔrant可扩增出ompA和rant基因(图 3)，测序结果均正确。表明缺失株Δrant和回复株cΔrant均可以稳定传代。
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A. ompA基因的PCR扩增；B. ermF基因的PCR扩增；M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. 阳性对照；2~8. 第1、5、10、15、20、25、30代菌液；9. 阴性对照 A. PCR amplification of ompA gene; B. PCR amplification of erythromycin gene; M. DL2000 DNA relative molecular mass standard; 1. Positive control; 2-8. Amplification from the 1st, 5th, 10th, 15th, 20th, 25th and 30th generations; 9. Negative control 图 2 缺失株Δrant稳定性测定 Fig. 2 Determination of stability of deletion strain Δrant |
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A. ompA基因的PCR扩增；B. rant基因的PCR扩增；M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. 阳性对照；2~8. 第1、5、10、15、20、25、30代菌液；9. 阴性对照 A. PCR amplification of ompA gene; B. PCR amplification of rant gene; M. DL2000 DNA relative molecular mass standard; 1. Positive control; 2-8. Amplification from the 1st, 5th, 10th, 15th, 20th, 25th and 30th generations; 9. Negative control 图 3 回复株cΔrant稳定性测定 Fig. 3 Stability determination of the complemented strain cΔrant |
测定11类27种抗菌素对野生株、缺失株和回复株的MIC值，结果显示：与野生株RA-LZ01相比，四环素类抗生素中土霉素、强力霉素和四环素对缺失株Δrant的MIC均减小了75%；与回复株cΔrant相比，土霉素、强力霉素和四环素对Δrant的MIC分别减小了75%、50%和75%。其他类抗生素、去污剂和阳离子染料对3种菌的MIC值均无明显变化(表 2)。结果表明，rant基因介导鸭疫里默氏杆菌对土霉素、强力霉素和四环素的耐药性。
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表 2 抗生素对鸭疫里默氏杆菌野生株、缺失株及回复株的MICs Table 2 MICs of antibiotics to R. anatipestifer wild strain, deletion mutant and complemented strain |
在整个生长周期中，与野生株RA-LZ01相比，缺失株Δrant的生长速率都明显减慢(P < 0.05)。与回复株cΔrant相比，Δrant在第4—9小时的生长速率明显下降(P < 0.05)。回复株cΔrant的生长动态与野生株相比无明显变化(图 4)。
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图 4 野生株、缺失株及回复株生长动态的测定 Fig. 4 Determination of the growth rates of wild strain, deletion mutant and complemented strain |
与野生株RA-LZ01相比，缺失株Δrant在攻毒后的第5天雏鸭存活率为100%，而野生株RA-LZ01存活率为50%，回复株cΔrant存活率为60%。在攻毒后第10天缺失株Δrant的存活率为70%，野生株RA-LZ01的存活率为10%，回复株Δrant的存活率为30%。这表明rant基因的缺失导致其对雏鸭的致死率显著降低(图 5)，明显致弱了野生株RA-LZ01的毒力。当rant基因回复后，回复株cΔrant的毒力也相应得到部分回复。
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图 5 鸭疫里默氏杆菌野生株RA-LZ01、缺失株Δrant和回复株cΔrant感染鸭的毒力试验 Fig. 5 The virulence experiment of R. anatipestifer wild strain RA-LZ01, deletion mutant Δrant and complemented strain cΔrant infecting ducklings |
鸭疫里默氏杆菌属于黄杆菌科，里默氏菌属，可感染鸭、鹅、鸡、火鸡等多种家禽，其发病鸭死亡率可高达75%，是危害养鸭业最严重的致病菌之一，给养鸭业造成严重经济损失。并且不同血清型之间没有交叉保护给疫苗预防增加了很大难度[16-17]。在实际生产中使用抗生素预防和治疗鸭疫里默氏杆菌感染是一个有效的防控手段，与此同时也导致细菌耐药性上升，多重耐药菌株不断出现和传播，给鸭疫里默氏杆菌病的防控带来巨大挑战。基于此，研究鸭疫里默氏杆菌的耐药机制对于控制耐药菌株的产生和传播，提高现有抗生素的应用效果，以及开发针对性更强的新型抗生素均具有重要意义[18]。
自MFS家族确立以来，家族成员被迅速扩大，目前由74个家族成员组成。MFS中众所周知的多重药物转运蛋白成员包括大肠杆菌的QacA，ErmAB-TolC系统的ErmB、ErmD、MdfA以及乳酸乳球菌的LmrP[9]。研究表明大肠杆菌MdfA是质子电化学梯度驱动的药物/质子反向转运体，同时发现MdfA在弗氏志贺菌、肠炎伤寒沙门菌和鼠疫耶尔森菌中具有同源序列。乳酸乳球菌的多重耐药转运蛋白LmrP可以利用膜电位和化学质子梯度的质子动力来介导两性底物排出细胞。MFS泵属于最大的继发性膜转运蛋白，是转运糖类、中间代谢产物和药物必不可少的系统。在MFS家族中研究最多的泵是金黄色葡萄球菌的NorA，枯草芽胞杆菌的同源物Bmr、Blt、Tet和MdfA[9]。
目前已经报道了几种介导鸭疫里默氏杆菌耐药的基因和外排泵，如鸭疫里默氏杆菌CH-1株中B739_0873基因的缺失导致其对氨基糖苷类和去污剂的敏感性增加[19]；RA-GD菌株中的ABC外排泵RanB介导其对有机溶剂的外排[10]，RND外排泵RaeE-RaeF-RopN介导其对氨基糖苷类抗生素和去污剂SDS的抗性[16]；CH3株中M949_0459基因的缺失导致其对替加环素敏感性增加[20]；Zhu等[21]从212株鸭疫里默氏杆菌中发现tet(A)、tet(B)、tet(M)、tet(O)、tet(O/W/32/O)、tet(Q)和tet(X)基因都参与了四环素类抗生素的耐药等。本研究的药敏试验结果显示，鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01为1株多重耐药菌株。当将rant基因缺失后菌株对四环素类抗生素的敏感性明显增加，而当rant基因回补后菌株对四环素类抗生素的抗性得到了完全或部分回复。
一些研究发现，多药外排泵除了介导细菌对抗生素的抗性，还与细菌的多种表型有关，其中包括细菌的生长和毒力，例如肺炎克雷伯菌中的AcrB[22]、肠炎沙门菌外排泵系统macAB[23]、结核分枝杆菌中的MmpL11[24]和鼠伤寒沙门菌中的AcrA[25]和AcrB[26]。本研究也发现，rant基因缺失后鸭疫里默氏杆菌的生长速率降低，说明rant基因参与菌株的生长。
近年来报道了几个与鸭疫里默氏杆菌毒力相关的基因，例如CH3株的铁离子利用相关基因tonB[27]和LPS合成相关基因M949_RS01915[28]；血清2型Th4株的OmpA基因[29]；CH-1菌株的荚膜合成相关基因wza [30]；Yb2株的调控相关基因luxE(AS87_03730)[31]。研究发现上述基因缺失后菌株毒力有明显的下降。Li等[10]报道当将鸭疫里默氏杆菌RA-GD菌株ABC外排泵基因RIA_1614缺失后毒力下降了43倍(原文献表述)。本文中rant基因缺失后导致菌株对鸭的感染力下降，特别是感染急性期鸭的发病率和死亡率均显著降低，而当rant基因回补后菌株毒力有明显回复。这些结果说明rant基因与鸭疫里默氏杆菌的毒力相关，但该基因灭活导致菌株毒力下降的机制可能比较复杂，需进行深入研究。
4 结论成功构建鸭疫里默氏杆菌rant基因缺失株Δrant和基因回复株cΔrant。通过基因功能验证，发现rant基因介导鸭疫里默氏杆菌对四环素类抗生素的耐药性，也与菌株的生长和毒力有一定的相关性。
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