2. 石河子大学动物科技学院, 石河子 832000;
3. 新疆农垦科学院 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室, 石河子 832000
, SHAO Yanyan2, ZHAO Zongsheng2, ZHU Mengting2,3, NAN Ying2, WANG Mingyuan2, FANG Chenhui2, WU Pei2, XIE Mengting2, JIANG Baihui2
2. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, China;
3. State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Breeding, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi 832000, China
黄体(corpus luteum，CL)是母畜卵巢在生殖生理过程中的一个内分泌腺体，是建立和维持妊娠必需的内分泌器官[1]。在正常繁殖周期内，如果卵子受精，CL将分泌孕酮等来参与调节受精卵着床、胚胎发育及妊娠维持[2]。如果卵子未受精或处于妊娠末期(或分娩后)，CL将会正常退化成为启动下一个生殖周期的前提[3]。因此，CL退化在哺乳动物的生殖周期中起着重要的“关卡”作用，对于重启母畜生殖功能的周期性变化具有重要的意义。
前列腺素(prostaglandins，PGs)是一组内源性的酸性脂质，广泛分布于哺乳动物体内，涉及大量的生殖过程[4-5]。大多数内源性PGs由花生四烯酸代谢衍生而来，当花生四烯酸通过磷脂酶A2从质膜释放时，环氧合酶(COX或PTGS)1和2会将花生四烯酸转化为PGH2；在特定酶的作用下，PGH2被选择性转化为相应的PGs，包括PGF2α、PGE2、PGD2、PGI2和TXA2[6-7]。其中，PGF2α被认为是母畜CL退化的主效溶解素，而PGE2则被认为是CL维持的重要保护介质[4, 8]。通常在妊娠期间PGE2分泌水平较高，能够竞争性抑制PGH2向PGF2α的合成转化，从而降低PGF2α浓度，利于CL维持和胎儿发育；但在分娩启动后，随着胎儿保护机制的消失，CL维持则转而退化，PGE2合成下降，PGH2向PGF2α合成增加，从而促使产后或者空怀母体完成功能性(主要表现为P4下降)及结构性(主要表现为内皮细胞失去紧密的连接，黄体体积减少、完整性被破坏)的CL退化进程[9-10]，继而开启新的生殖周期。但是，与PGs家族其他成员(如PGF2α、PGE1和PGE2)不同的是，PGD2在繁殖方面的相关调控作用并未引起人们足够的重视，其有关研究更是鲜有报道。
目前，大量研究证实，前列腺素家族的作用机制并不是某一种单一PGs成员的效应，而是多个PGs家族成员通过其相应受体的结合而共同发挥作用[11-12]，因此，在子宫或卵巢黄体组织中不同的PGs成员之间可能会发生不同程度的协同作用或竞争性地拮抗效应。本研究选取哈萨克母羊为研究对象，探究PGD2与PGF2α在母体CL退化过程中可能存在的作用机制，为进一步优化母畜高效繁育技术、保障畜牧业的连续繁育生产提供新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及饲养管理2020年5月份选择购置同一个养殖场16只健康的哈萨克母羊(年龄3~4岁，体重47 kg左右，无繁殖疾病且发情周期正常)，将试验羊群饲养于石河子大学动物科技学院试验站。栏内散养，每天早上和下午饲喂，自主采食苜蓿干草，配置舔砖(防应激)，自由饮水、自然光照，保证羊栏里干净无杂物、管理及环境条件一致。待其饲养14 d适应圈舍环境后，再进行试验。
1.2 主要试剂PGD2与PGF2α兔源多克隆抗体，山羊抗兔IgG二抗均购自Abcam公司；PGF2α购自Macklin公司；绵羊孕酮(PROG)、雌激素(E2)、前列腺素F2α(PGF2α)和D2(PGD2)ELISA Kit均购自晶美生物工程有限公司；HE染色试剂盒、总RNA提取试剂盒、总蛋白提取试剂盒、SCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE试剂盒均购自Solarbio公司；HiFiScript cDNA Synthesis Kit购自北京康为世纪有限公司；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)购自TaKaRa公司；蛋白Marker购自博奥森生物公司；PVDF膜购自ThermoFisher Scientific公司；ECL显色剂购自上海信裕生物科技有限公司。
1.3 试验方法1.3.1 子宫肌内注射处理 采用阴道埋孕酮栓和肌内注射氯前列腺烯醇法使母羊同期发情。为消除同期发情对试验的影响，待其同期发情处理第2个发情周期的黄体期(前期课题组已对同一批40只哈萨克母羊进行了2个发情周期的观察，发现哈萨克母羊群体中发情行为呈现较为明显的周期性变化，其发情周期为18 d左右，发情持续时间为24~48 h，为本试验选择黄体期中期即发情周期第11天进行子宫肌内注射处理提供了保障)进行试验分组处理，采用微创手术在有中期黄体的一侧子宫小弯处进行肌内注射药物，并将试验分为4组，即分别为PGD2组(1 mg·mL－1，0.2 mL)、PGF2α组(1 mg·mL－1，0.2 mL)、PGD2+PGF2α组(1 mg·mL－1，各0.2 mL)及生理盐水(0.2 mL，对照组)，每组4个重复。
1.3.2 HE染色 子宫肌内注射48 h后(避免此时黄体组织发生生理性周期性退化)进行屠宰，立即采集子宫、卵巢(黄体)组织于－80 ℃保存、备用。采集的黄体用4%多聚甲醛直接固定，待包埋切片后，利用苏木素-伊红(HE)染色，直接观察黄体组织形态。
1.3.3 血液采集、处理与激素测定 子宫肌内注射处理到屠宰间隔48 h，每隔6 h(0、6、12、18、24、30、36、42和48 h)采集一次静脉血，每次5 mL，4 000 r·min－1离心10 min，分离血清后，做好标记保存于－20 ℃备用。利用酶联免疫测定(ELISA)试剂盒检测血清中的P4、E2、PGD2及PGF2α浓度，分析不同处理组中上述激素在体内的浓度变化。
1.3.4 qRT-PCR测定 参照总RNA提取试剂盒说明书提取子宫、黄体组织中总RNA，使用Nanodrop2000检测RNA的纯度及浓度。按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书反转录成cDNA，使用Nanodrop2000检测cDNA的纯度及浓度，保存于－20 ℃。qRT-PCR检测7个引物(表 1)，由Sangon Biotech公司合成。按照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书操作实施qRT-PCR检测：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L－1)0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L－1)0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌水6 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s；2.55个循环：95 ℃ 5 s，56 ℃ 30~34 s。
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表 1 引物序列信息 Table 1 Primer sequence information |
1.3.5 Western blot测定 不同组别的子宫、卵巢(黄体)组织置于液氮中研磨后，将碾碎的组织放入蛋白裂解液中裂解，离心后，提取总蛋白，并利用SCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度；各组提取等量蛋白后，加入5×蛋白上样缓冲液，高温变性；再制备12%分离胶和5%浓缩胶，加入样品和蛋白Marker进行SDS-PAGE，并将目的蛋白切胶转移至PVDF膜上，置于摇床室温清洗封闭，取出PVDF膜加入一抗，4 ℃摇床、孵育过夜；最后，PBST摇床洗涤，加入二抗，室温摇床孵育，再添加ECL显色剂对蛋白条带进行照相分析。
1.4 统计分析实时荧光定量数据以2－ΔΔCt法处理，Western blot蛋白结果使用Image J软件分析灰度值，使用SPSS Statistics 19软件ANOVA比较基因、蛋白表达量差异，P＜0.05被认为具有统计学意义。
2 结果 2.1 处理前后黄体组织形态学观察HE染色结合物理拍照对比不同组别处理前后黄体形态变化，结果如图 1所示，各组之间的黄体组织结构形态均发生了不同程度的变化：1)PGD2组中，黄体体积未发生显著变化，但卵巢组织中出现多个卵泡，HE染色发现，黄体结构已发生空腔化并伴有CL结构退化的初期特征；2)PGF2α组中，黄体体积明显缩小，卵巢组织中出现单个较大卵泡，HE染色结果显示，黄体组织已发生显著结构性退化；3)与前两组相比，PGD2+PGF2α组中，黄体体积缩小更为明显，同时，卵巢组织中出现多个较大卵泡，HE染色发现，黄体组织已基本退化完成，并出现多个活性卵泡；4)对照组中，黄体体积未发生明显变化，同时卵巢组织呈现静止状态(无活性卵泡)，HE染色结果显示，黄体组织结构完整，并未发生CL退化现象。
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A. PGD2组；B. PGF2α组；C. PGD2+PGF2α组；D. 对照组；黑细箭头指示黄体结构，黑粗箭头指示卵泡 A. PGD2 group; B. PGF2α group; C. PGD2+PGF2α group; D. Control group; Black fine arrows indicate the corpus luteum, black thick arrows show ovarian follicle 图 1 处理前后卵巢黄体形态学变化 Fig. 1 Morphological changes in the corpus luteum before and after treatment |
2.2.1 不同组别P4水平的变化 使用ELISA法检测血清中P4水平，结果如图 2所示。PGD2组P4浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-0.212 5，在PGD2处理后24 h出现明显的单峰，峰值为8.65 ng·mL－1；PGF2α组P4浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-0.222 1，在PGF2α处理后30 h出现明显的单峰，峰值为8.37 ng·mL－1；PGD2+PGF2α组中P4浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-0.349，在PGD2结合PGF2α处理后6和36 h出现明显的双峰，峰值分别为10.69和8.70 ng·mL－1；对照组中P4浓度随时间变化不显著(P>0.05)，趋势线斜率为0.021 5，在生理盐水处理后24 h出现不明显波动性变化。此外，通过组间P4激素变化趋势对比分析，发现对照组与上述3个试验组之间均存在极显著性差异(P < 0.01)。
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A. PGD2组；B. PGF2α组；C. PGD2+PGF2α组；D. 对照组。下同 A. PGD2 group; B. PGF2α group; C. PGD2+PGF2α group; D. Control group. The same as below 图 2 各组母羊血清中P4浓度变化 Fig. 2 Changes in plasma P4 concentration in the ewes in each group |
2.2.2 不同组别E2水平的变化 结果如图 3所示，PGD2组E2浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-0.953 9，在PGD2处理后24 h出现不明显的单峰，峰值为211.35 pg·mL－1；PGF2α组E2浓度随时间变化呈显著上升趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为4.538 3，在PGF2α处理后12和36 h出现明显的双峰，峰值分别为252.44和282.26 pg·mL－1；PGD2+PGF2α组中E2浓度随时间变化呈显著上升趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为0.527 7，但在PGD2结合PGF2α处理后18 h出现明显的单峰，峰值为274.82 pg·mL－1；对照组中E2浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-1.556 3，处理后48 h内未出现明显的波动性变化。此外，通过组间E2激素变化趋势对比分析，发现对照组与上述3个试验组之间均存在显著性差异(P < 0.05)。
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图 3 各组母羊血清中E2浓度变化 Fig. 3 Changes in plasma E2 concentration in the ewes in each group |
2.2.3 不同组别PGD2水平的变化 结果如图 4所示，PGD2组PGD2浓度随时间变化呈显著上升趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为2.576 1，在PGD2处理后24和36 h出现明显的双峰，峰值为77.78和101.94 pg·mL－1；PGF2α组PGD2浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-1.240 4，在PGF2α处理后6 h出现明显的单峰，峰值为83.82 pg·mL－1；PGD2+PGF2α组中PGD2浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-0.841 3，在PGD2结合PGF2α处理后6和24 h出现不明显的双峰，峰值分别为92.34和92.38 pg·mL－1；对照组中PGD2浓度随时间变化呈显著上升趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为1.204 5，处理后48 h内未出现明显的峰值。此外，通过组间PGD2激素变化趋势对比分析，发现对照组与上述3个试验组之间均存在显著性差异(P < 0.05)。
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图 4 各组母羊血清中PGD2浓度变化 Fig. 4 Changes in plasma PGD2 concentration in the ewes in each group |
2.2.4 不同组别PGF2α水平的变化 结果如图 5所示，PGD2组PGF2α浓度随时间变化呈不显著下降趋势(P>0.05)，趋势线斜率为-0.000 8，在PGD2处理后24 h出现明显的单峰，峰值为33.50 pg·mL－1；PGF2α组PGF2α浓度随时间变化呈不显著上升趋势(P>0.05)，趋势线斜率为0.046，在PGF2α处理后6和18 h出现明显的双峰，峰值为34.07和33.03 pg·mL－1；PGD2+PGF2α组中PGF2α浓度随时间变化呈显著下降趋势(P < 0.05)，趋势线斜率为-0.456 4，在PGD2结合PGF2α处理后18 h出现明显单峰、峰值为34.79 pg·mL－1，36 h出现明显谷峰，谷值为24.95 pg·mL－1；对照组PGF2α浓度随时间变化呈不显著上升趋势(P>0.05)，趋势线斜率为0.026 2，在处理后24 h出现明显的谷峰，谷值为24.42 pg·mL－1。此外，通过组间PGF2α激素变化趋势对比分析，发现对照组与上述3个试验组之间均存在显著性差异(P < 0.05)。
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图 5 各组母羊血清中PGF2α浓度变化 Fig. 5 Changes in plasma PGF2α concentration in the ewes in each group |
不同方案处理后48 h分别提取总RNA和蛋白，进行qRT-PCR和Western blot检测子宫端PGs的关键合成酶表达水平。结果如图 6所示，与对照组相比，PGD2组HPGDS mRNA和蛋白表达量显著上调(P < 0.05)，PGF2α组和PGD2+PGF2α组HPGDS mRNA和蛋白表达量显著下调(P < 0.05)；而PGFS mRNA和蛋白表达量在上述3个试验组中均呈显著性上调表达(P < 0.05)。
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图 6 PGD2和PGF2α关键合成酶mRNA(A)和蛋白相对表达量(B和C) Fig. 6 Relative expression of PGD2 and PGF2α key synthetase mRNA (A) and protein (B and C) |
不同方案处理后48 h分别提取总RNA和蛋白，qRT-PCR和Western blot检测黄体端PGs的受体表达水平。结果如图 7所示，与对照组相比，PGD2组、PGF2α组中DP1 mRNA和蛋白表达量显著上调(P < 0.05)，PGD2+PGF2α组中DP1 mRNA和蛋白表达量呈不显著上调(P>0.05)；类似地，PGF2α组、PGD2+PGF2α组中CRTH2 mRNA和蛋白表达量显著上调(P < 0.05)，PGD2组中CRTH2 mRNA和蛋白表达量呈不显著上调(P>0.05)；而FP mRNA和蛋白表达量在上述3个试验组中均呈显著性上调表达(P < 0.05)。同时，通过组间的数据对比发现，PGD2单独使用对DP1受体的影响呈最大促进效应，PGF2α单独使用时，对CRTH2受体的影响呈最大促进效应，PGD2+PGF2α结合使用时，对FP受体的影响呈最大促进效应。此外，PGD2两种类型受体的表达中，发现PGD2组中DP1表达量显著高于CRTH2(P < 0.05)，而PGF2α组中CRTH2表达量显著高于DP1(P < 0.05)。
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图 7 PGD2和PGF2α不同受体mRNA(A)和蛋白(B和C)相对表达量变化 Fig. 7 Relative expression of PGD2 and PGF2α receptor mRNA (A) and protein (B and C) |
CL是哺乳动物卵泡排空后形成的一个暂时的内分泌腺体，是建立和维持妊娠的必需内分泌器官。正常繁殖周期中，哺乳动物的CL必须有规律地退化，才能保证生殖活动的正常进行。目前，普遍认为PGF2α是引起CL退化关键因素[9, 13]，PGE2是CL维持的重要保护介质[11, 14]。妊娠CL维持期间，PGE2合成酶会竞争性抑制PGH2向PGF2α的合成转化，降低体内PGF2α浓度，利于CL维持[15-16]；但在CL启动退化机制后，PGE2合成的竞争性抑制效应减弱，体内PGF2α的合成增加，从而加速CL退化的进程[17-18]。因此，不难发现，PGF2α和PGE2在CL维持与退化过程中存在竞争性拮抗效应，这为本试验开展PGD2在CL退化过程中的作用机制研究提供了重要参考。
目前，大量研究显示，PGs对CL组织的调控取决于每个PGs成员之间形成的叠加效应[12, 15-17]。本研究通过HE染色结合物理拍照对比不同方案处理前后CL组织形态学变化，发现PGD2与PGF2α对母羊CL组织的作用效应一致，均能够促进CL组织的退化；但其效果呈现明显的差异，即PGF2α组>PGD2组，说明单独使用PGD2时并不能够有效的促进CL的退化。然而，PGD2不同于PGE2，它能够协同PGF2α共同促进CL的退化，其效果明显优于前两者单独使用的退化效果，这一结论与邵焱焱等[19]在黄体化细胞中分别添加PGD2、PGF2α及PGD2+PGF2α观察CL细胞退化结论一致，这提示，在CL维持与退化过程中，PGD2与PGF2α之间可能存在协同效应，而不同于PGE2与PGF2α之间的拮抗效应。
CL作为母体合成和释放孕激素的重要内分泌器官，其结构或功能的改变直接或间接地影响着机体卵巢-子宫轴内分泌功能的变化[20-21]。本研究通过检测外周血P4分泌水平发现，3个试验组P4浓度随时间变化均呈现下降趋势，其下降程度分别为PGD2+PGF2α组>PGF2α组>PGD2组。这一结果与上述形态学观察结果一致，提示PGD2与PGF2α单独使用或联合使用均能够引起CL发生功能性退化。但是，由于PGs作用于CL组织存在一定的时效性，导致不同组别中CL功能性退化时间出现差异，效果也不相同[22-24]。本研究发现，PGD2组中P4浓度曲线峰值出现的时间(24 h)，比PGF2α组提前6 h，这可能是由于PGD2舒张了子宫-卵巢轴血管丛系统(UOP)血管，导致其血流加大、速度加快，使其PGs(内源性PGF2α和外源性PGD2)被迅速转运至黄体组织而发挥生物学效应[25-26]；但是这种退化机制效应没有PGF2α强烈。不过，与对照组和上述试验组相比，PGD2结合PGF2α使用时，P4浓度曲线呈现双峰状态，峰值出现在6和36 h，说明二者结合使用能够更早地启动CL的功能性退化。P4和E2作为CL组织自分泌或旁分泌的调节剂[27]，在CL退化过程中P4浓度的降低会导致LH搏动性增加，从而加快发育中卵泡的生长速率和E2生成水平[28]。这一结果与本研究中PGD2+PGF2α组和PGF2α组的结果相吻合，即在CL退化机制启动后，卵巢卵泡的抑制效应被解除，从而导致E2浓度升高[29-30]。但是，值得注意的是，PGD2+PGF2α组中E2浓度曲线单峰最大值出现的时间明显早于PGF2α组，这与本研究中P4浓度曲线变化趋势相吻合。但与前者不同，PGD2单独使用时，E2水平却呈现明显下降趋势，这一现象也与Farhat等[31]发现的PGD2能够调节卵巢颗粒细胞增殖、促进E2的分泌结果相悖；推测产生这种差异的主要原因，可能是相较于卵泡结构，PGD2更倾向于优先靶向CL组织，以参与其维持与退化过程的调节；但其具体机制仍有待于进一步研究。
CL退化过程中，不同PGs家族成员之间既相互制约、又相互促进。本研究通过ELISA法检测外周血液PGD2和PGF2α浓度发现，在PGD2组中，PGD2在处理后24和36 h出现明显的双峰，而PGF2α浓度则仅在处理后24 h出现一个明显的单峰，提示在24 h出现的CL功能性退化很可能是由于“外源PGD2+内源性PGF2α”分泌的短暂增加所致[32-33]。但与前者不同，PGF2α单独使用或联合PGD2使用时，发现PGD2浓度呈现下降趋势，说明在此时PGF2α能够抑制内源性PGD2的生成，从而导致体内PGD2浓度下降[34]。与PGD2类似，在本研究中PGD2+PGF2α组中PGF2α浓度也呈下降趋势；但产生这一下降趋势的原因与PGD2不同，在PGD2+PGF2α组中很可能是由于超生理浓度的PGD2较大程度地舒张了UOP血管[25-26]，导致大部分外源和内源性PGF2α能够及时地被转运至CL组织发挥生物学效应而产生损失。这一趋势结果与HE观察结果相一致，说明当PGD2和PGF2α联合使用时，PGD2很可能发挥着双重调控作用：即一方面促进内源性PGF2α的产生、延长其衰减时长，另一方面促进UOP血管舒张、增加外源性PGF2α的有效利用，从而呈现了明显的优于单独注射PGF2α时CL退化效果。
PGs属于类二十烷酸的多不饱和脂肪酸的衍生物，它们是由特定的PGs关键合酶催化反应产生。其中，PGD2关键合成酶是HPGDS，PGF2α关键合成酶是PGFS。本研究通过检测HPGDS和PGFS的表达水平发现，无论是单独使用还是结合注射外源性PGF2α，子宫端HPGDS的表达均呈显著性下调，提示当体内PGF2α浓度升高时能够明显地抑制其内源性PGD2的合成，从而引起外周PGD2浓度的下降；这一结论与ELISA检测PGD2的结果相吻合。但与前者不同，PGD2单独或联合PGF2α使用时，子宫端PGFS的表达呈显著性上调，说明当体内PGD2浓度增加时能够明显促进其内源性PGF2α的合成，从而导致机体CL退化呈现最大化。造成这一现象的原因很可能与体内E2含量变化有关，即E2处于低水平时，能够促进PGD2的合成，而当E2水平升高时，则促进PGF2α的合成；Chaud等[35]、Acosta等[36]和Hayashi[37]的研究也证实了这一观点。同时，依据不同的受体类型，PGs在靶标组织中发挥着不同的生物学效应。本研究发现，PGD2或PGF2α单独使用时，主要影响PGD2受体(DP1和CRTH2)的表达，即PGD2促进DP1受体的高表达，而PGF2α则促进CRTH2受体的高表达。但两者不同的是，当PGD2浓度升高时，PGD2主要是通过结合DP1受体扩张UOP血管[38-39]，以加速内源性PGF2α向CL组织的转运，促进CL退化；而当PGD2浓度较低时，PGD2则主要是通过结合CRTH2受体开启CL细胞的凋亡过程[40]，以“外源性PGF2α促进+内源性PGD2启动凋亡”的机制形式，双重促进CL退化，这一观点也在本研究中HE染色与形态学观察结果中得到验证。此外，当PGD2结合PGF2α使用时，发现二者对PGF2α受体(FP)的作用呈最大促进效应，且此时DP1和CRTH2受体也均呈较高水平，说明PGD2结合PGF2α使用时之所以能够表现出最佳的CL退化效果，很可能是开启了两种机制：即一是促进主效激素PGF2α的合成与受体的表达，二是提高PGD2受体DP1和CRTH2受体的均衡表达，最终以“PGF2α+ PGD2”协同作用于CL退化过程。
4 结论本研究发现，PGD2无论单独使用或结合PGF2α使用，均呈现促进CL退化的效应。但单独使用时，其促进CL退化效果不明显，而当其与主效促溶素PGF2α联合使用时，呈现出最佳的促进CL退化效果，这为全面探析CL退化机制以及进一步优化哺乳动物高效繁殖技术(尤其是PGs方案)提供了新的参考依据。
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