2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education/Sichuan Province, Chengdu 610041, China
羊肉的品质特性研究日益受到重视，肉质性状包括pH、肉色、大理石纹、系水力、嫩度、多汁性和肌内脂肪含量等，在影响肉质的众多因素中，肌内脂肪含量是影响羊肉肉质性状的重要因素。肌内脂肪含量受脂肪细胞的数量以及体积影响，在热量摄入增加的情况下，白色脂肪组织会通过增加现有脂肪细胞的大小和通过前体脂肪细胞形成新的脂肪细胞而扩大，从而导致脂肪细胞数量增加[1-3]。肌内脂肪沉积受多种因素干扰，近年来，转录因子对脂肪沉积调控的研究越来越多。
核受体超家族是一大群调节机体生理稳态与特定相关的转录因子。虽然该组中的许多核受体已被充分表征，但是存在大量且不断增加的具有未知功能或配体的受体，称为孤儿核受体[4-6]。核受体家族成员NR4A1(nuclear receptor subfamily 4 group a member 1)，也被称为Nur77、TR3和NGFI-B，分布在多种细胞内，具有功能多样性，对多种生理过程都发挥着重要作用[7]，包括细胞增殖和凋亡等生命活动[8-12]。在细胞凋亡的研究中，Liu等[13]的研究结果表明，干扰素刺激基因12a(ISG12a)及其相互作用伴侣NR4A1均参与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)介导的肝癌细胞凋亡；Yang等[14]研究发现，Nur77通过与谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)启动子上的特定结合位点结合来增强GPX1启动子的反式激活，从而上调GPX1的表达，进而保护胰腺β细胞凋亡。同时，NR4A1也有抗细胞增殖的作用，有研究证明，NR4A1/3通过直接结合造血特异性C/EBPα增强剂并激活C/EBPα转录，部分地通过激活C/EBPα驱动的抗增殖网络来限制HSC增殖[15]；Hedrick等[16]研究发现，在横纹肌肉瘤(RMS)中过表达或者干扰Nur77或用Nur77拮抗剂(DIM-C-pPhOH)均对RMS细胞有抗增殖作用。NR4A1也具有调节线粒体的功能，Zhu等[17]研究发现，NR4A1/DNA-PKcs/p53途径参与了乳酸加速血管钙化的机制，部分原因是过度的Drp介导的线粒体裂变和线粒体促凋亡蛋白基因相关的线粒体缺乏；Sheng等[18]研究发现，NR4A1干扰打断了线粒体外膜受体相关的线粒体裂变，并取消了帕金森介导的线粒体吞噬，从而减少了高血糖介导的线粒体损伤，改善了肾功能。线粒体是有氧呼吸产生能量的主要场所，而上述研究表明，NR4A1可以调节线粒体的功能，表明NR4A1可能与能量稳态有关。在脂肪方面的研究，秦丹丹[19]研究发现，过表达NR4A1可抑制小鼠的脂肪细胞分化，同时有研究表明，干扰Nur77可下调HFD饲喂雌性小鼠白色脂肪组织的乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)和脂肪酸(FAS)，进一步调控脂肪代谢[20]，Jung等[21]研究发现，用Nur77抑制剂抑制3T3-L1前脂肪细胞的脂肪形成，伴随着在脂肪形成早期发生的有丝分裂克隆扩增(MCE)减少, 以及MCE和细胞周期标志物所需的基因表达降低；Yi等[22]研究得到，NR4A1的低表达可以降低2型糖尿病小鼠的体重、血脂和血糖，并且脂肪细胞的大小和脂滴的体积相应减小。上述研究表明，过表达NR4A1可以抑制脂肪细胞分化，干扰其表达同样会抑制脂肪细胞的分化，但其具体调控机制需要进一步探讨。目前尚未见NR4A1对山羊皮下脂肪细胞影响的研究报道。
基于上述的不同研究结果，本试验在克隆山羊NR4A1 cDNA序列的基础上，利用qPCR技术检测NR4A1基因在山羊不同组织和不同分化阶段皮下脂肪细胞中的表达模式，并且探讨过表达NR4A1对山羊皮下脂肪细胞的影响，为进一步研究NR4A1基因在皮下脂肪细胞分化中的作用提供基础数据，并为最终阐明其调控山羊皮下脂肪沉积的分子机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究以1周岁健康的简州大耳羊(n=5)为试验动物，早晨空腹24 h，屠宰后采集心、肝、脾、肺、肾、皮脂、腹脂、背最长肌、股二头肌和臂三头肌等组织。
1.2 试验试剂Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；Kpn Ⅰ和Not Ⅰ内切酶购自Thermo公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit、Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司。
1.3 试验方法1.3.1 山羊NR4A1克隆及生物信息学分析 根据GenBank中的山羊预测序列(XM_018047733.1)设计克隆引物(表 1)。先用RT-PCR技术对NR4A1基因进行克隆，PCR反应体系：5倍稀释的背最长肌cDNA模板1 μL，12.5 μL的2×GC Rich-PCR，1 μL的正义链引物(10 μmol·μL-1)和1 μL的反义链引物(10 μmol·μL-1)，补充ddH2O至25 μL。克隆程序: 98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR产物用2% 琼脂糖凝胶进行电泳，用Gel Extraction Kit回收目的片段；构建pClone007载体后转化DH5α感受态细胞；挑取阳性菌落进行PCR鉴定并提取质粒，然后测序。
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表 1 克隆引物 Table 1 Primers for cloning |
通过ProtParam在线分析编码蛋白的理化性质；通过NCBI网站的ORF Finder寻找开放阅读框(open reading frame, ORF)；采用STRING预测NR4A1蛋白与其他蛋白的相互作用网络；使用Conserved Domains (CD)预测蛋白结构域。
1.3.2 山羊NR4A1的组织表达分析 根据上述克隆得到的NR4A1 CDS区序列设计qPCR引物，根据山羊不同内参基因的筛选，选择泛表达转录因子(UXT)和肽酰脯氨基顺反异构酶(PPIB)为内参基因[23]，qPCR的引物信息如表 1所示。以上述采集的山羊组织样进行总RNA提取和cDNA的合成，以分析NR4A1基因在山羊不同组织的相对表达水平。通过qPCR技术检测NR4A1基因在山羊不同组织的表达量，qPCR体系: SYBR ® Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，5倍稀释的cDNA 1 μL，1 μL的正义链引物(10 μmol·μL-1) 和1 μL的反义链引物(10 μmol·μL-1)，补充ddH2O至20 μL。qPCR程序: 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共39个循环。
1.3.3 山羊NR4A1的细胞时序表达分析 在无菌条件下从7日龄的简州大耳羊中分离出山羊的皮下脂肪组织(n=1)。先将分离出的肌肉组织切碎，用PBS冲洗3次，然后加入2倍体积的Ⅱ型胶原酶，接下来通过补充有10% 胎牛血清(FBS)相同体积的DMEM / F12(Hyclone)终止消化，并分别通过400目筛。将悬浮液以2 000 r·min-1离心5 min，加入红细胞(RBC)溶解液，然后以2 000 r·min-1离心5 min。皮下脂肪细胞的沉淀被DMEM/F12(Hyclone)和FBS重悬。将皮下前体脂肪细胞接种在细胞培养瓶中，4 h后更换培养基，每2 d更换1次培养基。当传至F3代的细胞长至80%融合时，添加油酸诱导液进行分化，并分别收集第0、12、36、60和96 h的细胞。用qPCR方法分析NR4A1基因在山羊不同时间段皮下脂肪细胞的相对表达水平。反应体系同“1.3.2”。
1.3.4 过表达载体的构建 利用上述克隆得到的NR4A1 CDS区设计亚克隆引物，NR4A1-S: CGGGGTACC ATGCCCTGTATCCAAGCCC，NR4A1-A: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAAGGGCAG TGTGTCC。以上述提取的质粒为模板，以上述设计的引物进行PCR扩增，将片段连接到19T载体后测序，质粒提取纯化后用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，胶回收产物利用T4连接酶连接，之后转化到DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落并进行PCR鉴定，对鉴定正确的菌落提取质粒进行测序。
1.3.5 NR4A1过表达效率以及细胞形态学的检测(油红O染色) 利用“1.3.3”的方法，细胞传至F3代时，加入适量载体，空白试验组以空载体感染皮下前体脂肪细胞，试验组以pcDNA3.1-NR4A1感染皮下前体脂肪细胞，感染2 d后收集细胞。转染体系：100 μL opti，1.5 μL Lipofectamine 3000，500 ng pcDNA3.1-NR4A1。
通过形态学(油红O染色)检测转染过表达载体后山羊皮下脂肪细胞的脂质含量变化情况。将油红O液加入蒸馏水配成油红O染色液，皮下脂肪细胞用10%甲醛溶液固定30 min后移除甲醛溶液，并用200 μL油红O染色液浸泡，染色后用PBS洗涤，于显微镜下观察山羊皮下脂肪细胞的脂滴形态。最后用250 μL异丙醇提取细胞内脂质，并测量490 nm处的吸光度。
1.3.6 过表达NR4A1对脂肪分化标志基因表达的影响 利用qPCR技术检测过表达NR4A1对脂肪分化标志基因表达量的影响。反应体系参照“1.3.2”。
1.3.7 统计分析 用“平均值±标准差(Mean±SD)”的形式来表示数据，用2-ΔΔCt方法对qPCR定量数据进行分析[24]。通过SPSS 15.0软件进行显著性分析和多重比较，当P < 0.01时认为差异极显著。
2 结果 2.1 山羊NR4A1基因的克隆本试验成功克隆得到山羊NR4A1基因CDS区序列，长度为1 797 bp(登录号为MN19754 4)。经过ORF Finder分析发现，山羊NR4A1的ORF为1 797 bp，编码598个氨基酸，不稳定指数为60.06，亲水性的平均值为－0.269，理论等电点是6.85，带负电荷的氨基酸残基总数为58个，带正电荷的氨基酸残基总数为57个，通过CD在线软件分析得到山羊NR4A1具有1个锌指结构，1个DNA结构位点。山羊与绵羊的亲缘关系最近，与原鸡属关系最远，基本符合生物进化论(图 1A)；山羊的氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列相似性最高，其次为人，相似性最低为原鸡属(图 1B)。
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A.NR4A1的系统进化树；B.山羊NR4A1氨基酸序列与其他物种之间的相似性；C.山羊NR4A1相互作用蛋白的预测 A. Phylogenetic tree of NR4A1; B. Similarity between goat NR4A1 amino acid sequence and other species; C. Prediction of goat NR4A1 interacting proteins 图 1 山羊NR4A1基因的序列分析 Fig. 1 Sequence analysis of NR4A1 gene of goat |
本试验检测了NR4A1在山羊不同组织中的相对表达水平。以UXT为内参，心组织样本为校准样本，得到NR4A1基因在组织中的表达模式，发现NR4A1在山羊肺组织中表达较高(P < 0.01)，在山羊背最长肌中表达最高(P < 0.01)，在所有被检测10种组织中均有表达(图 2)。
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*. P < 0.05，**. P < 0.01，下同 *. P < 0.05, **. P < 0.01, the same as below 图 2 NR4A1基因在山羊组织中的相对表达 Fig. 2 Relative expression of NR4A1 gene in multiple tissues of goat |
为了获得NR4A1基因在山羊皮下脂肪细胞的表达模式，本试验还检测了NR4A1在山羊不同时间段皮下脂肪细胞中的表达量，NR4A1基因在皮下脂肪细胞分化0~60 h的表达量逐渐上升，在60 h达到最高(P < 0.01)，60 h后开始下降(图 3)。
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图 3 NR4A1在山羊皮下脂肪细胞分化中的相对表达水平 Fig. 3 Relative expression level of NR4A1 during goat subcutaneous adipocyte differentiation |
利用NR4A1过表达载体检测其对山羊皮下前体脂肪细胞的影响，qPCR结果显示，与对照组相比，NR4A1基因表达量上调了5 493倍(图 4A)。油红O染色显示，与对照组相比，过表达NR4A1后明显促进山羊皮下脂肪细胞脂质聚集(图 4C)，并且油红O染色提取结果显示，过表达后OD值极显著升高(P < 0.01，图 4B)。
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A.皮下脂肪细胞分化48 h过表达NR4A1后，通过qPCR检测NR4A1的相对表达水平；B.皮下脂肪细胞分化期间油红O染色，在492 nm处检测的OD值；C.皮下脂肪细胞分化期间对照组(上)和试验组(下)细胞的油红O染色图片(200×) A. Relative mRNA expression of NR4A1 was detected by qPCR after overexpressing NR4A1 for 48 h of subcutaneous adipocyte differentiation; B. The OD value was detected at 492 nm after Oil red O staining during subcutaneous adipocyte differentiation; C. Representative photographs of Oil red O staining of the cells in NC (up) and test groups (down) during subcutaneous adipocyte differentiation (200×) 图 4 NR4A1过表达对山羊皮下脂肪细胞的影响 Fig. 4 Effects of NR4A1 overexpression on subcutaneous adipocytes of goat |
为了进一步阐明山羊NR4A1对皮下脂肪细胞分化的调控机制，本研究检测了过表达NR4A1对脂肪细胞相关基因相对表达水平的影响。结果显示，过表达山羊NR4A1后C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1、AP2在山羊皮下脂肪细胞中的表达量显著上升(P < 0.05，图 5)。
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图 5 过表达NR4A1对山羊皮下脂肪细胞相关基因表达的影响 Fig. 5 Effects of overexpressing NR4A1 on the expression of related genes in goat subcutaneous adipocytes |
本研究成功克隆了山羊NR4A1基因CDS区序列，通过STRING软件分析发现, FOS、AKT2蛋白与NR4A1互作，Kokoroishi等[25]研究报道，FOS可以促进TGF-β1介导的信号传导，进一步调节脂肪分化；Pang等[26]研究表明，AKT2可以抑制脂肪的生成，由此推测，NR4A1基因可能与脂肪和脂肪酸代谢调控密切相关。为了得到NR4A1在山羊的组织特异性，因此本试验研究了NR4A1在山羊的组织表达模式，结果得到，NR4A1在背最长肌中表达水平最高，在肺组织中表达次之，在所有被检测的山羊10种组织中均有表达。结果与其他学者在其他物种中的报道存在相似或不同之处，Liu等[27]研究发现，NR4A1在猪的肝、胃和肌肉等组织中的相对表达水平很低；Nakai等[28]研究发现，NR4A1在人类胎儿肌肉和成人肝、大脑和甲状腺中广泛表达。基于上述报道结合本实验室结果推测，NR4A1基因组织表达具有物种和组织特异性。
3.2 NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响本研究发现，NR4A1在山羊皮下前体脂肪细胞分化中呈先上升后下降的趋势，且过表达NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞的分化，推测NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子。与本试验结果一致的是，Fumoto等[29]发现，NR4A1在3T3-L1细胞中瞬时过表达会促进脂质的积累。但是，Veum等[30]研究发现，NR4A1在人原代前体脂肪细胞分化期间下调，而本研究发现，NR4A1在山羊脂肪细胞前期分化上调，而在60 h后才出现下调的现象；并且，Qin等[31]研究表明，过表达NR4A1通过增强GATA结合蛋白2(GATA2)和p53的表达抑制小鼠脂肪细胞的分化和脂质积累；Chao等[32]发现，过表达NR4A1可以抑制3T3-F442A前体脂肪细胞的分化。上述这些报道与本研究的结果存在不同之处，由此推测，NR4A1基因在不同物种的脂肪细胞调控过程中可能存在物种特异性。
3.3 NR4A1调控山羊皮下脂肪细胞分化的可能作用机制本研究进一步检测了过表达NR4A1对山羊脂肪细胞分化标志基因表达的影响，结果显示，过表达NR4A1后脂肪分化标志基因的相对表达量上升。能量代谢的主要步骤是富含三酰基甘油的脂蛋白(TRL)水解，释放可使用或存储的脂肪酸，这是通过在血管内皮的“结合脂解部位” LPL实现的[33]；PPARγ是脂肪形成的主要诱导剂，C/EBPβ是诱导脂肪生成的早期转录因子，它通过调节其邻近启动子元件的转录来激活PPARγ，而PPARγ是脂肪细胞分化的正调节剂[34]，在之前的一些报道中，C/EBPα均以被证明为脂肪细胞分化的关键基因，此外，它还可以调节AP2的表达，并且可以促进脂滴的聚集；同时，C/EBPα可以和C/EBPβ、PPARγ相结合，调节脂肪酸合成酶(FAS)的表达[35-37]。推测, 过表达NR4A1可能主要通过上调C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和AP2的表达水平来促进山羊皮下脂肪细胞分化，并且, 赵莉鸽[38]的研究表明，NR4A1的过表达可减少神经系统细胞内淀粉样前体蛋白代谢的产物含量，提高β分泌酶的含量，导致APP水解释放能量，进一步调控生物进程，同时也有研究表明，NR4A1可以调节线粒体功能[39-41]，而线粒体又是产生能量和ATP合成的主要场所，因此推测，NR4A1的过表达也有可能通过调节ATP生化反应来进一步调节脂肪和脂肪酸的代谢，还需要通过体内和体外试验进一步揭示NR4A1在山羊皮下脂肪细胞分化中的深层机制。
4 结论本研究克隆得到包含ORF的山羊NR4A1基因cDNA序列，在山羊各个组织广泛表达，其中在背最长肌中相对表达量最高；NR4A1在山羊皮下脂肪细胞分化60 h的表达量最高；过表达NR4A1后可能通过上调C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1和AP2的表达来促进山羊皮下脂肪细胞分化，研究结果可为进一步阐明NR4A1基因调控山羊不同部位脂肪沉积的分子机理提供重要的理论依据。
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