2. 贵州大学药学院, 贵阳 550025;
3. 西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心, 贵阳 550025
2. School of Pharmaceutical Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Engineering Research Center of the Utilization for Characteristic Bio-Pharmaceutical Resources in Southwest of Ministry of Education, Guiyang 550025, China
炎症是动物机体中一种最重要的保护和防御性反应，大多数动物疾病都与炎症有关，特别是一些感染性疾病，例如仔猪肠炎、牛乳腺炎等，尽管病因不同，但发病学基础是一致的。研究表明，核转录因子NF-κB活化与炎症的发生密切相关，其诱导炎性因子IL-1β、TNF-α、COX-2[1]、NO和炎症介质PGE2等的表达[2]，放大炎症反应、打破花生四烯酸平衡[3]以促进5-LOX产生LTB4，引起机体红肿热痛和氧化应激异常[4]，而机体对炎症的调节可以通过转录因子Nrf2/HO-1实现细胞免受炎症和氧化损伤[5]，该过程增加表达会使血红素产生胆绿素，同时增加Fe2+和低浓度CO来缓和促炎因子TNF-α和IL-1β表达，目前，Nrf2/HO-1的免疫调节性使其成为治疗炎症性疾病的重要药物靶点。在动物疾病治疗中，中药比化药更健康和安全，同时中药更加符合绿色经济发展，艾纳香油是植物艾纳香(Blumea balsamifera (L.)DC)提取的精油(BBO)，多产于中国西南部，据《现代本草纲目》记载，其具有清热明目、解毒消肿等功效[6]，目前的研究表明，BBO在预防皮肤老化[7]、抗菌[8-9]、抗炎[10]等方面有不错的效果，其可以缓解炎症发生，但对于BBO的抗炎作用机制未见深入研究，特别是涉及的炎性信号通路方面未见报道。
本研究采用LPS诱导的巨噬细胞炎性模型，考察炎性因子以及NF-κB和Nrf2/HO-1通路相关基因的表达来深入探究BBO的抗炎效果，并首次解释其可能的抗炎机制，为BBO在兽用抗炎药上的合理开发打下基础。
1 材料与方法 1.1 主要材料BBO由贵州艾力康中草药开发有限公司惠赠(前期利用GC-MS分析了其化学组成[8]，主要成分及占比为左旋龙脑25.382%、反式石竹烯24.439%、石竹烯氧化物5.843%、花椒素3.968%、芳樟醇1.655%等)；RAW264.7细胞购于昆明细胞库(编号: KCB200603YJ)；LPS (血清型O11:B4) 购自Sigma公司；胎牛血清购自Gibco公司(货号：21100-212)；DMEM购自Hyclone公司(货号：11965092)；细胞凋亡试剂盒C1056、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒P0027和PMSF100 mM本甲磺酰胺试剂(ST506)均购于碧云天试剂公司；PGE2(YM0603Mo)、LTB4(JYM0535Mo)、IL-1β(JYM0531Mo)和TNF-α(JYM0218Mo)ELISA试剂盒均购自武汉基因美生物科技公司；NO(A012-1-2)和iNOS (A014-1-1)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；RNApure、FastKing gDNA RT逆转录试剂盒均购于天根试剂公司；细胞总蛋白提取裂解液(10×RIPA buffer)和p-p65(93H1)、p-IKKα/β(16A6)、IKKα(3G12)、HO-1(E3F4S)、COX-2(DH5H) 抗体均购于美国CST生物科技公司；p65(YT3107)、5-LOX(YT0027)、p-IκB-α(YP0151)、IκB-α(YP2417)、Nrf2(YT3189)、β-actin(YM3138)、内参组蛋白H3(K80)、HRP标记二抗抗体均购自ImmunoWay生物技术公司；ECL发光试剂购自BIO-RAD公司。
1.2 主要仪器Multiscan GO酶标仪(美国Thermo公司)；PowerUp SYBRTM Green荧光定量PCR仪(赛默飞公司)；UVP Touch System化学发光成像仪(德国耶拿Analytik jena)；IX-71倒置相差荧光显微镜(日本Olympus公司)。
1.3 MTS法检测BBO的细胞毒性RAW264.7细胞使用含10% FBS胎牛血清、1% 双抗的DMEM高糖培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。试验取对数生长的RAW264.7细胞以1×104个·mL-1密度铺于96孔板，每孔加入100 μL细胞，正常贴壁培养6 h后，设立BBO终浓度分别为0、20、40、60、80、120 μg·mL-1的各组作为不加LPS共培养剂量组(其中BBO配制：BBO 100 mg加入50 mg吐温－80 ℃涡旋，用灭菌水溶解为100 mg·mL-1母液)、设立BBO终浓度分别为0、20、40、60、80、120 μg·mL-1的各组+LPS终浓度500 ng·mL-1共培养作为加LPS共培养试验组，共12组，每组设立3个重复孔。加入药物正常培养24 h，加入20 μL MTS后继续37 ℃培养4 h，用酶标仪在490 nm波长处测量各孔吸光值，检测细胞毒性。
1.4 Hoechst 33342和PI双染检测BBO对细胞凋亡的影响按参考文献[11]操作，将RAW264.7细胞以6×105个·mL-1密度进行12孔板铺板，正常培养6 h后加药。试验分组：空白对照组、80 μg·mL-1终浓度BBO阴性对照组、500 ng·mL-1终浓度LPS+(40、60、80 μg·mL-1)终浓度BBO治疗组、500 ng·mL-1的LPS模型组，每组重复3个孔，正常培养16 h后进行试验。当细胞生长至汇合度80%时，将每组用冰冷的PBS洗涤细胞2次，4 ℃下将细胞置于5 μg·mL-1 Hoechst 33342和2 μg·mL-1 PI中避光染色15 min之后，在10×倒置荧光显微镜下捕获荧光激发图像，同时将每组的复孔细胞用20×倒置相差显微镜观察记录细胞形态变化。
1.5 ELISA和分光光度法检测BBO对LPS诱导巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、PGE2、LTB4、NO含量及iNOS活力的影响细胞处理和分组同上，收集各孔细胞上清液。根据ELISA试剂盒的操作说明依次检测各组细胞上清液中PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量，采用分光光度计法检测各组细胞上清液中NO含量及iNOS活力，每孔3个重复。评价BBO对炎性RAW264.7细胞分泌PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β、NO水平及iNOS活力的影响。
1.6 RT-PCR检测BBO对细胞TNF-α、IL-1β mRNA表达水平的影响参考“1.4”中操作, 用6孔板培养细胞和分组。根据RNApure组织细胞试剂盒提取总RNA，测定浓度后，用FastKing gDNA RT逆转录试剂盒合成cDNA，RT-PCR检测目的基因mRNA水平。每组设置3个重复孔，GAPDH为内参。PCR反应体系：PCR Master Mix 12.0 μL, Primer1 1.8 μL, Primer2 1.8 μL，cDNA模板3 μL，ddH2O补至30 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环；12 ℃保温40 min。各基因相对表达量用2-ΔΔCt表示，实时定量PCR的引物序列如表 1所示。
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表 1 RT-PCR引物序列 Table 1 Primer sequences of RT-PCR |
细胞分组和处理同上，用含有PMSF的裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白，细胞核蛋白按Beyotime核浆提取试剂盒说明书进行提取，用BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。试验以每孔40~100 μg蛋白量上样电泳，经120 V电压转移到0.22 μm PVDF膜上后用5%脱脂牛奶在室温下持续摇晃封闭膜1 h。然后用5%脱脂牛奶及5% BSA分别稀释p-P65/P65抗体(1∶1 000)、p-IKKα/β/IKKα抗体(1∶1 000)、COX-2抗体(1∶1 000)、5-LOX抗体(1∶1 000)、p-IκB-α/IκB-α抗体(1∶1 000)、HO-1抗体(1∶500)、Nrf2抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶2 000)、组蛋白H3抗体(1∶1 000)，并与膜在4 ℃过夜孵育16 h。TBST中洗涤6 min × 3次后将膜与二抗室温孵育1 h，TBST中洗涤6 min×3次后ECL试剂显色，在Analytik Jena UVP ChemStudio工作站记录曝光条带灰度值A。细胞质和总蛋白以β-actin为内参，核蛋白以组蛋白H3为内参，计算相对表达量，试验重复3次。
1.8 统计学分析所有数据3次独立试验，以“平均数±标准差(x±s)”表示，采用SPSS 22.0软件(ANOVA；IBM，USA)进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 BBO对RAW264.7细胞毒性的确定如图 1A所示，0~120 μg·mL-1浓度范围内的BBO分别添加或不添加LPS(500 ng·mL-1)共培养时，BBO对RAW264.7细胞均无明显毒性或毒性不显著(P＞0.05)。以此作为标准，后续BBO选择40、60、80 μg·mL-1作为试验浓度。
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A. MTS检测细胞毒性；B.损伤细胞与总细胞的比率；C.显微镜显示细胞形态(20×)；D.荧光显微镜显示细胞PI和Hochest染色(10×)。与空白组相比，*.P < 0.05，**.P < 0.01；与LPS组相比，#.P < 0.05，##.P < 0.01，下同 A. MTS detection of cytotoxicity; B. The ratio of apoptotic cells to total cells; C. The cell morphology (20×); D. The result of cell PI and Hochest staining (10×). Compared to control group, *.P < 0.05, **.P < 0.01; Compared to LPS group, #.P < 0.05, ##.P < 0.01, the same as follows 图 1 BBO对LPS刺激RAW264.7细胞增殖及细胞形态变化和凋亡的影响 Fig. 1 Effects of BBO on proliferation, morphological changes and apoptosis of RAW264.7 cells stimulated by LPS |
通过荧光倒置显微镜检测细胞形态以及细胞凋亡情况，如图 1C、1D显示，在LPS刺激细胞16 h后，RAW264.7细胞的形态发生改变，损伤细胞(PI)与总细胞(Hochest33342)的比率与对照组相比极显著增加(P＜0.01)；如图 1B所示，在0~80 μg·mL-1浓度范围内BBO治疗细胞后以剂量依赖的方式显著降低了这一比率，其中BBO中高剂量可以极显著降低该比率(P＜0.01)，并扭转LPS导致的细胞变形。总体来说，图 1结果表明，BBO在40~80 μg·mL-1剂量对LPS刺激的RAW 264.7细胞凋亡和形变有明显的抑制作用。
2.3 BBO对炎性RAW264.7细胞分泌PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β、NO水平及iNOS活力的影响PGE2、IL-1β、NO、TNF-α等是炎症发生的重要标志性产物。如图 2所示，相对于空白对照组，LPS刺激会使RAW264.7细胞极显著的增加PGE2、LTB4、IL-1β、NO、TNF-α分泌水平及iNOS活力(P＜0.01)；与LPS模型组相比，60~80 μg·mL-1中高剂量BBO可以极显著降低PGE2、LTB4、IL-1β、TNF-α、NO的产生量(P＜0.01)，并呈现浓度依赖性关系，并极显著抑制iNOS活力(P＜0.01)。
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图 2 BBO对RAW264.7细胞PGE2、LTB4、IL-1β、TNF-α、NO水平及iNOS活力的影响 Fig. 2 Effects of BBO on the secretion of PGE2, LTB4, IL-1β, TNF-α, NO and iNOS activity in RAW264.7 cells |
如图 3所示，与空白对照组相比较，LPS诱导细胞后IL-1β、TNF-α mRNA表达极显著增加(P＜0.01)；与LPS模型组相比，中高剂量的BBO可以极显著抑制IL-1β、TNF-α mRNA表达(P＜0.01)。
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图 3 BBO对RAW264.7细胞IL-1β、TNF-α mRNA表达的影响 Fig. 3 Effect of BBO on the expression of IL-1β and TNF-α mRNA in RAW264.7 cells |
如图 4所示，与空白对照组相比，LPS处理细胞后细胞中p-P65、p-IKKα/β、p-IκB-α、COX-2、5-LOX蛋白相对水平极显著增加(P＜0.01)，IκB-α蛋白相对水平极显著下调(P＜0.01)；与LPS模型组相比，60~80 μg·mL-1剂量的BBO可以极显著抑制IKKα/β(4B)、IκB-α(4C)、P65(4D)蛋白的磷酸化和COX-2(4F)、5-LOX(4G)蛋白表达(P＜0.01)，并极显著抑制IκB-α(4E)蛋白的降解(P＜0.01)。
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A.COX-2、5-LOX和NF-κB相关蛋白表达；B. p-IKKα/β相对表达水平；C.p-IκB-α相对表达水平；D. IκB-α相对表达水平; E.p-P65相对表达水平; F.COX-2相对表达水平; G. 5-LOX相对表达水平 A. Expression of COX-2, 5-LOX and NF-κB related proteins; B. p-IKKα/β relative expression level; C. p-IκB-α relative expression level; D. IκB-α relative expression level; E.p-P65 relative expression level; F. COX-2 relative expression level; G.5-LOX relative expression level 图 4 BBO对RAW264.7细胞COX-2、5-LOX和NF-κB相关蛋白表达的影响 Fig. 4 Effect of BBO on the expression of COX-2, 5-LOX and NF-κB related proteins in RAW264.7 cells |
如图 5所示，与空白组相比，LPS处理后细胞质中Nrf2极显著增加(P＜0.01)，细胞核中Nrf2少量减少，HO-1蛋白表达未见明显变化；与LPS组相比，60~80 μg·mL-1剂量BBO可以极显著减少细胞质中Nrf2的蛋白水平(P＜0.01)，并极显著增加细胞核中Nrf2以及总HO-1蛋白表达(P＜0.01)；与0 h相比，24 h内BBO以时间依赖性增加HO-1蛋白表达，其中4~8 h为显著增加(P＜0.05)，12~24 h为极显著增加(P＜0.01)。
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A.总HO-1、细胞质Nrf2、细胞核Nrf2蛋白表达; B.细胞质和细胞核Nrf2相对表达水平; C.不同时间HO-1相对表达水平; D. HO-1相对表达水平 A. Total HO-1, cytoplasm Nrf2, nuclear Nrf2 protein expression; B. Cytoplasm and nuclear Nrf2 relative expression level; C. HO-1 relative expression level at different time; D. HO-1 relative expression level 图 5 BBO对RAW264.7细胞Nrf2/HO-1相关蛋白表达的影响 Fig. 5 Effect of BBO on the expression of Nrf2/HO-1 related proteins in RAW264.7 cells |
炎症是机体对外源物引起的感染和刺激做出的正常防御性免疫反应，多数情况下，当机体在接触病原体后，细胞会通过程序性死亡来阻止病原体在细胞内的复制增殖，同时细胞死亡会启动炎症放大反应[12]，释放细胞膜破裂和内源性危险信号，使转录因子如NF-κB活化并诱导促炎因子表达，从而导致炎症发展[13]。花生四烯酸限速酶COX-2、5-LOX[14]控制白三烯LTs、前列腺素PGs、血栓素TXs等炎症介质的产生[15]，它们广泛参与机体的炎症及癌症发展[16]和呼吸系统[17]等的调节，最近，网络药理学研究发现，5-LOX与炎症相关基因P65等相互作用[18]，其可能会促进NF-κB的激活，而目前5-LOX/COX-2双重抑制剂在有效控制炎症方面发挥着很大的作用。当受到刺激时，免疫细胞如巨噬细胞会从规则的圆形变成不规则的分支形状[19]，加速导致细胞凋亡和坏死。本研究中，不同浓度BBO可以减轻LPS诱导的细胞形态学改变，并缓解细胞凋亡的发生比例，还能有效抑制LPS诱导的COX-2、5-LOX蛋白表达，以减少炎症介质PGE2、LTB4产生。
NF-κB途径的紊乱激活是许多自身免疫性、炎症性疾病[20]、癌症[21]的发病机制之一，并调节凋亡相关基因的转录[22]，抑制该途径可实现抗炎作用[23]。NF-κB信号传递以P65磷酸化入核引起炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS等的转录启动，增加NO及LTB4、PGE2的分泌，加剧炎症。IκBα是P65磷酸化的抑制基因，IκBα磷酸化会释放P65入核。而IKKα负责IκBα的激活和非经典NF-κB途径激活[24]，控制炎症和恶性肿瘤发生[25]。本研究发现，LPS刺激后RAW264.7细胞中NF-κB相关基因明显激活磷酸化，导致炎性因子和炎症介质过度分泌，在BBO干预下能显著抑制LPS诱导的IKKα、IκBα、P65磷酸化，并阻止IκBα的解离，进而控制NF-κB核转录及下游炎症因子的启动，减少IL-1β、TNF-α、COX-2的产生及iNOS的激活。
Nrf2是氧化应激的关键调节因子，炎症会加剧氧化应激，导致细胞凋亡和受损发生[26]。暴露于应激源时，Nrf2解离并迁移到细胞核促进抗氧化酶HO-1的表达[27]，而HO-1在抗氧化和炎症刺激的细胞防御机制中参与促炎因子iNOS、NO和COX-2等的产生，增加HO-1的表达可以抑制细胞损伤和凋亡[28]，并阻断NF-κB依赖的转录机制[29]。研究证明，双氢青蒿素可通过Nrf2调节LPS引起氧化应激[30]，同时，最近的研究证实，乌司他丁[31]、哌泊索仑[32]、邻苯二酚[33]、Sageretia[34]等药物也可通过增加Nrf2/HO-1水平来抑制NF-κB激活[35]而减少促炎因子和炎症介质的分泌。本试验发现，BBO可上调Nrf2进入细胞核，进而以剂量和时间依赖的方式启动HO-1的表达，减少氧化应激对炎症的促进作用，实现减少细胞炎症和细胞死亡发生。但是，Nrf2/HO-1是否为关键抗炎途径还需要进一步基因沉默验证，同时BBO中成分复杂，主要包括左旋龙脑、反式石竹烯、樟脑、石竹烯氧化物、香树烯、花椒素、芳樟醇[36]、有机酸[37]等，这使我们对BBO中发挥抗炎作用的成分归属问题产生兴趣，而据文献报道，芳樟醇有潜在抗炎活性[38]，但其是否就是BBO发挥抗炎效果的主要成分也有待进一步成分加减配方验证，由于体内代谢的复杂性使得BBO抗炎效果也需要进一步在动物模型试验中验证。
4 结论本研究结果表明，作为中药艾纳香提取物的BBO，其一定剂量内可以抑制细胞炎性和凋亡发生，并抑制NF-κB中关键蛋白磷酸化，同时促进抗炎基因Nrf2/HO-1的蛋白表达，减少炎性因子及炎症介质的释放。本研究结果为BBO抗炎的细胞机制提供了全新的研究途径，也为其临床预防LPS所引起的炎症性疾病提供了理论依据，在其兽用抗炎方面也提供了基础数据。
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