牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)属于黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)，主要感染牛，导致腹泻、呼吸道症状、流产或黏膜糜烂^[1]。病毒基因组RNA包含5′UTR、开放阅读框以及3′UTR保守的结构，编码C、E^rns、E1、E2四种结构蛋白和7~8种非结构蛋白。E^rns、E1、E2镶嵌在病毒脂质双层囊膜上，与囊膜内由C蛋白和病毒RNA构成的衣壳共同组成完整的病毒粒子^[2]。E2是BVDV最主要的抗原蛋白，在诱导宿主体液免疫和细胞免疫中发挥重要的作用，是决定疫苗免疫保护的关键蛋白。E^rns为高度糖基化蛋白，具RNA酶活性，除参与病毒粒子组成，还可从感染细胞分泌至胞外。E^rns作为瘟病毒特有蛋白，也可诱导中和抗体的产生，可作为病毒持续感染的标志物，广泛用于BVDV持续与急性感染的鉴别诊断^[3]，但相关研究发现检测E^rns的免疫组织化学法或商品化试剂盒存在漏检现象，表明E^rns蛋白在毒株之间存在抗原差异^[4]。

BVDV分离株间抗原性、基因组核苷酸存在较大差异，目前主要依据5′UTR、N基因核苷酸差异将其分为BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因型以及BVDV-1a~BVDV-1w、BVDV-2a~2d等基因亚型^[5-6]。根据分离株的细胞培养特性，可将BVDV分为非致细胞病变(ncp)和致细胞病变(cp)两种生物型，田间分离株多为ncp型且与牛急性感染、流产和持续性感染(PI)有关，cp型BVDV感染PI牛可导致黏膜病。在我国报道的BVDV分离株表现为较高的亚型多样性，可分为13种基因亚型(BVDV-1：11种；BVDV-2：2种)及BVDV-3基因型^[6-12]。目前我国BVDV流行株的抗原基因E2的多态性已初步阐明^[13]，但关于毒株E^rns基因的信息较少。为了系统了解我国BVDV流行株E^rns基因的分子特征及遗传演化规律，本研究测定分析了2013—2019年间我国甘肃、青海、宁夏省区主要BVDV流行株的E^rns基因序列，以期进一步丰富我国BVDV的抗原变异基础研究，为疫苗的分子设计提供必要的技术储备。

1 材料与方法 1.1 材料

2013—2019年，甘肃、青海、宁夏规模化牛场送检的疑似牛病毒性腹泻发病牛的EDTA抗凝血150份(表 1)，冻存于－80 ℃。致细胞病变生物型对照毒株BVDV-AV69购自中国兽医药品监察所，无BVDV污染的牛肾细胞(MDBK)、BVDV-1p基因亚型分离株Camel-5，由本实验室保存，BVDV抗原检测试剂盒为爱德士公司产品，FITC标记的猪抗BVDV多克隆抗体为美国VMRD公司产品，RNAsimple总RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，一步法RT-PCR试剂盒HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DH5α化学感受态细胞、质粒提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品，Trans2K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，pMD18-T克隆载体购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 引物

根据GenBank中收录的BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因组序列，设计引物E^rnsF：5′-AGCATTGTTRGCRTGGGC-3′，E1R：5′-AACCAYAGTATRCCTTGYA-3′，用于扩增BVDV基因组E^rns-E1区，预期目的片段为1 296 bp。同时合成引物5′UTRF(5′-CTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTA-3′) 和5′UTRR(5′-CAACTCCATGTGCCATGTACAGCA -3′)，用于扩增BVDV基因组5′UTR区。

1.3 RNA提取及RT-PCR

参照RNAsimple总RNA提取试剂盒说明书，分别从250 μL EDTA抗凝血和Camel-5株培养物提取总RNA。利用一步法RT-PCR试剂盒HiScript II One Step RT-PCR Kit，以50 μL反应体系扩增E^rns-E1 DNA片段。电泳切胶回收后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定并将阳性克隆摇菌，委托生工生物工程(上海)公司测序。同时选取测序正确的样品RNA扩增5′UTR区并克隆测序。

1.4 病毒分离

根据爱德士BVDV抗原检测试剂盒操作说明检测抗凝血中BVDV抗原，参照文献[14]，利用阳性抗凝血样品制备牛淋巴细胞裂解液并接种至MDBK单层细胞，盲传3代后，接种MDBK单层细胞，利用FITC标记的猪抗BVDV多克隆抗体进行免疫荧光检测细胞培养物中的BVDV抗原。

1.5 序列分析

利用VecScreen、DNASTAR、BioEdit等软件对获得的序列进行分析。根据GenBank数据库中收录的SD-15毒株(登录号为M96751)的E^rns基因和5′UTR区，以Clustal W方法比对获得E^rns基因和5′UTR区核苷酸信息。利用DnaSP 5.10、BioEdit分析E^rns基因核苷酸以及推导氨基酸序列的变异位点。利用BLAST在线分析序列与GenBank中收录毒株E^rns基因的同源性，并利用Mega7.0软件包构建系统进化树。

2 结果 2.1 基因克隆及序列测定

从150份抗凝血提取总RNA，经RT-PCR扩增病毒E^rns-E1区(1 296 bp)，共获得56份DNA，测序均为BVDV特异序列，总体阳性率为37.33%，其中甘肃省、青海省、宁夏回族自治区BVDV阳性率分别为37.68%、35.71%、40.00%。比对并去掉相同序列后获得33条E^rns序列，长度均为681 bp，无核苷酸插入或缺失，编号并提交GenBank数据库，登录号为KY675201~KY675227、MW560180~MW560185。

2.2 病毒分离与相似性分析

GenBank中未收录BVDV-1p亚型毒株的E^rns序列，因此测定实验室保存的Camel-5株E^rns序列(登录号为KY675228)并作为参考序列。分析发现这些流行株属于9个基因亚型：BVDV-1a(2株)、BVDV-1b(5株)、BVDV-1c(1株)、BVDV-1d(3株)、BVDV-1m(11株)、BVDV-1o(1株)、BVDV-1p(4株)、BVDV-1q(4株)、BVDV-2a(1株)。利用BVDV抗原阳性抗凝血GS5、QH4、QH9、NX1、NX3、NX201902进行病毒分离，在MDBK细胞未见细胞病变，经免疫荧光鉴定分离株均为非致细胞病变型，利用细胞培养物提取RNA并扩增E^rns基因测序，与利用抗凝血样品扩增测序结果一致。在这些亚型株中，BVDV-2a亚型NX3株E^rns基因序列与美国分离株9231(登录号：MH806437)相似性最高(97.75%)，高于国内新疆分离株XJ04(FJ527854，94.73%)、山东分离株SD-1(MK599227，92.13%)以及吉林分离株JZ05-1(GQ888686，91.59%)。GS11、QH2、QH11、QH18株E^rns序列相似性为89.4%~98.9%，与Camel-5株E^rns基因核苷酸序相似性为90.0%~95.1%，同属BVDV-1p基因亚型。NX2019/02株与GenBank中收录的BVDV-1m亚型SD-15株E^rns基因(登录号：KR866116)核苷酸一致性为84.73%，其5′UTR与1v毒株EN-19(登录号：MN417826)的核苷酸一致性为96.39%，因此暂定NX2019/02株为BVDV-1v基因亚型。各基因亚型株间E^rns序列相似性矩阵结果表明，BVDV E^rns核苷酸在1a~1d经典亚型相似性较高(79.8%~85.9%)、在1m~1v较新亚型也表现为较高相似性(81.0%~87.3%)，以BVDV-1m和BVDV-1p流行株亚型间相似性最高(87.3%)，与作者前期在各亚型BVDV株E2基因比较结果类似^[13]。E^rns基因在经典亚型组和新亚型组株间差异较大，以BVDV-1d亚型与BVDV-1p亚型流行株间相似性最低(76.7%)。BVDV-1v NX2019/02株与BVDV-1m~1q亚型BVDV株E^rns序列相似性(82.0%~86.3%)高于经典亚型BVDV-1a~1d(77.8%~80.7%)，表明BVDV-1m~1v等新出现毒株在起源上关系较为密切。

2.3 基因变异性分析

变异位点分析显示流行株E^rns基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列变异位点分别为49.34%(336/681)和26.43%(60/227)，小于作者前期测定的BVDV E2基因(核苷酸和氨基酸变异位点分别为61.76%和60.69%)。在推导的E^rns氨基酸序列，His₃₀、His₇₄、Glu₇₅、Lys₇₈、His₇₉ RNA酶活性位点以及₁₃₉KKGK₁₄₂ dsRNA作用基序保守。在E^rns蛋白存在7个N-糖基化位点，位于氨基酸第2、11、26、65、95、100、217位，其中第26位糖基化位点(26 NRSL)在BVDV-1m、1o、1p、1q、1v亚型株糖基化位点移位(24 NVSR)(图 1)。此外，在1m亚型GS25株、1p亚型QH2株参与链内二硫键形成的第171位半胱氨酸发生变异，1 d亚型QH9株该位点半胱氨酸转位至第181位。

2.4 系统进化分析

利用Mega7.0对获得E^rns基因核苷酸序列与GenBank中收录的参考株进行序列比对并进行系统进化分析，结果表明，在西北地区BVDV表现为区域亚型多样性(甘肃省7种：1a、1b、1c、1m、1o、1p、1q基因亚型；青海省5种：1b、1d、1m、1p、1q基因亚型；宁夏区5种：1d、1m、1q、2a以及1v新基因亚型)。在3省区均存在1m、1q基因亚型BVDV株，以1m基因亚型株最为普遍(33.33%，11/33)，且1m亚型株E^rns基因相似性较高(93.5%~97.9%)，未发现明显地域性差异；其次为甘肃及青海2省共存的1b亚型(5/33)和1p亚型(4/33)(图 2A)。为验证基于E^rns基因的系统进化分析结果，进一步扩增测定NX2019/02株等19条5′UTR序列，构建系统进化树(图 2B)，证实NX2019/02株属BVDV-1v新基因亚型。1p基因亚型双峰驼分离株Camel5 E^rns基因与甘肃株GS11的E^rns基因核苷酸相似性(95.1%)高于QH2、QH11等青海流行株(90.0%~90.4%)，1q基因亚型GS26株、QH5株、QH8株分别与Camel-6双峰驼分离株以及SD0803猪源分离株存在较高E^rns基因相似性(分别为98.3%和96.4%~98.6%)。利用E^rns基因进化树和5′UTR进化树分析BVDV株亲缘关系结果较一致，但5′UTR进化树揭示GS6株与青海分离株的进化关系效果略次于E^rns基因进化树(图 2A、B)。由于E^rns基因在BVDV株间差异性略小于E2基因但显著高于5′UTR区段，因此在精细定位BVDV株的进化关系中具有显著优势。

3 讨论

自1946年美国首次报道牛病毒性腹泻，至今已有70余年。BVDV以牛为主要宿主，还可感染羊、猪、牦牛、鹿等家畜和多种野生偶蹄动物^[15]。BVDV-1基因型在世界各地普遍流行，而BVDV-2基因型在北美、南美、欧洲、亚洲流行，目前已发现BVDV-1a~1w、BVDV-2a~2d等基因亚型。BVDV-3基因型主要分布于巴西、泰国、意大利、孟加拉国、印度、阿根廷、土耳其等国家。相关研究表明，在我国牛BVDV总体抗体阳性率高达57%，RT-PCR阳性率约为27.1%^[16]，但病毒抗原阳性率较低(0.71%~ 3.66%)^[17-18]，流行株主要有BVDV-1a~1d、BVDV-1m~1q、BVDV-1u~1w、BVDV-2a~2b等亚型^[6-12]。此外，在河南、山东省相继报道山羊、绵羊以及肉牛因BVDV-3自然感染发病^[19-20]。本研究利用疑似BVDV感染牛抗凝血样本研究不同亚型株E^rns抗原基因的差异，RT-PCR总体阳性率(37.33%)和抗原阳性率略高于前期普查性研究。作者发现在西北地区1a、1b、1d、1q亚型BVDV流行态势与前期报道类似^[21-23]，但BVDV-1m亚型株目前流行最普遍。BVDV-1p基因亚型株最早于2007年分离于北京奶牛^[7]，在我国江苏和西南地区山羊以及西北区双峰驼均有报道^[24-26]，在本研究中发现其在西北省区其检出率与1q株相当，仅次于BVDV-1m株。在宁夏首次检出BVDV-2a基因型，但其与我国前期分离株的亲缘关系相对较远，与之类似近期北美商品血清来源的BVDV-2分离株的报道^[27]，提示国外传入BVDV-2株的风险不容忽视。

目前，BVDV分离株的亚型鉴定大多基于5′UTR、N基因核苷酸相似性，由于不同亚型株的基因重组可能造成BVDV株遗传分析的偏差^[28]。因此日本学者曾增加E2 N端编码区、NS3基因片段、NS5B-3′UTR的系统进化分析以提高准确性^[29]。抗原编码基因在BVDV株间变异最大，在揭示病毒遗传演化规律中更具优势。与作者前期发表的BVDV流行株E2基因的分析结果类似^[13]，本研究发现E^rns基因也可作为研究BVDV遗传演化的靶标基因，精细定位BVDV株进化关系。此外，我们发现RNA酶活性位点在BVDV不同亚型株高度保守，但1m~1q、1v等新亚型株E^rns糖基化位点错位，由于E^rns RNA酶活性位点、dsRNA结合活性位点、糖基化在影响病毒抗原性以及宿主细胞INF产生中具有重要调控作用^[30-31]，国内流行株E^rns糖基化位点错位是否影响毒株抗原性或宿主细胞IFN反应的差异，还有待深入研究。

近期研究人员提出了1f、1g、1h、1m~1o、1q亚型株进化的关联性^[32]，本研究聚焦于国内流行株，首次全面获取了BVDV E^rns编码基因信息，通过同源性分析进一步揭示了1m~1v亚型BVDV流行株的密切亲缘关系。前期研究人员在山东奶牛^[6]和黑龙江肉牛^[33]报道了BVDV新亚型1v，本研究进一步发现在宁夏区奶牛中也存在同亚型流行株，这一结果提示1v亚型株在我国的时空分布规律及其在我国BVDV株演化中扮演的角色值得关注。

4 结论

首次选用E^rns靶标基因对西北部分省区牛源BVDV株进行同源性及系统进化分析，发现10个基因亚型流行株，以1m亚型株最为普遍，1m~1q及1v等亚型BVDV株亲缘关系密切。