畜牧兽医学报  2021, Vol. 52 Issue (1): 262-267. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2021.028    PDF    
引用本文
李少晗, 由欣月, 范君文, 徐一, 郝雲峰, 崔尚金, 秦彤. 14株北京地区犬细小病毒分离毒株的VP2、NS1基因序列分析[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(1): 262-267.  
LI Shaohan, YOU Xinyue, FAN Junwen, XU Yi, HAO Yunfeng, CUI Shangjin, QIN Tong. Sequence Analysis of the Complete VP2 and NS1 Genes of 14 Canine Parvovirus Isolates in Beijing[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2021, 52(1): 262-267.  
14株北京地区犬细小病毒分离毒株的VP2、NS1基因序列分析
李少晗1,2, 由欣月1,2, 范君文3, 徐一4, 郝雲峰1,2, 崔尚金1,2, 秦彤1,2     
1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
2. 兽用药物与兽医生物技术北京科学观测站, 北京 100193;
3. 北京市动物疫病预防控制中心, 北京 102629;
4. 中国动物疾病预防控制中心, 北京 100125
收稿日期：2020-06-22
基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目(ASTIP-IAS15)
作者简介：李少晗(1996-), 女, 河北邢台人, 硕士, 主要从事动物传染病病原学与流行病学研究, E-mail:1037017995@qq.com.
通信作者：秦彤, 主要从事动物传染病病原学与流行病学研究, E-mail:qintong@caas.cn.
摘要：从北京地区疑似细小病毒感染的犬粪拭子中成功分离鉴定出14株犬细小病毒（CPV）毒株，并对其完整的VP2和NS1基因进行了序列分析。结果表明，鉴定到的14株CPV毒株中，7株为New CPV-2a型，7株为CPV-2c型。此外，NS1的19、33、293、588、624和656位氨基酸以及VP2的13、574位氨基酸为新鉴定的氨基酸突变位点。基于VP2、NS1基因的系统进化分析表明，大部分的New CPV-2a型和CPV-2c型毒株与广西南宁和吉林长春地区的分离毒株亲缘关系密切，说明本次分离毒株与广西或吉林地区分离毒株具有相同的起源。本研究为更好地开展犬细小病毒流行病学调查提供了有益借鉴，也为深入研究犬细小病毒变异和传播的分子机制奠定了基础。
关键词：犬细小病毒    分离鉴定    VP2基因    NS1基因    进化分析    
Sequence Analysis of the Complete VP2 and NS1 Genes of 14 Canine Parvovirus Isolates in Beijing
LI Shaohan1,2, YOU Xinyue1,2, FAN Junwen3, XU Yi4, HAO Yunfeng1,2, CUI Shangjin1,2, QIN Tong1,2     
1. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
2. Scientific Observing and Experiment Station of Veterinary Drugs and Diagnostic Technology of Ministry of Agriculture, Beijing 100193, China;
3. Beijing Animal Disease Prevention and Control Center, Beijing 102629, China;
4. China Animal Diseases Control Center, Beijing 100125, China
Corresponding author: QIN Tong, E-mail: qintong@caas.cn.
Abstract: Fourteen strains of canine parvovirus (CPV) were successfully isolated and identified from feces swabs of dogs which were suspected to be infected CPV in Beijing, and their complete NS1 and VP2 genes were sequenced and analyzed. Among the 14 strains identified, the results showed that 7 strains were New CPV-2a and 7 strains were of CPV-2c. Besides, some new amino acid mutation sites were identified (amino acids 19, 33, 293, 588, 624 and 656 of the NS1 and amino acids 13 and 574 of the VP2). Phylogenetic analysis based on the VP2 and NS1 genes indicated that most of the New CPV-2a and CPV-2c strains were closely related to the isolated strains in Nanning, Guangxi, and Changchun, Jilin, indicating that the isolated strains had the same origin as the isolated strains in Guangxi or Jilin. This study provides a useful reference for better epidemiological investigation of canine parvovirus, and also builds a foundation for the in-depth study of the molecular mechanism of canine parvovirus variation and transmission.
Key words: canine parvovirus    isolation and identification    VP2 gene    NS1 gene    evolutionary analysis    

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)引起的，以出血性肠炎和心肌炎为主要特征的犬病毒性传染病。该病在全球范围内广泛流行，是危害犬类的重要传染病之一。CPV是一种无囊膜的单股负链DNA病毒，其基因组编码两个结构蛋白(VP1和VP2)和两个非结构蛋白(NS1和NS2)[1]。VP2是CPV主要的衣壳蛋白，抗原性较强，可以诱导产生高水平的中和抗体，且在决定病毒的宿主范围和组织趋向性方面发挥着重要作用[2-3]。NS1蛋白具有ATP酶和解旋酶的功能，能够调控其他蛋白的表达，且与病毒DNA的复制、转录以及诱导细胞凋亡等过程具有密切联系[4-5]，目前，对NS1基因的研究还不够充分。

最初的CPV-2型在鉴定后不久就开始产生抗原变异。1978年，两个新型抗原突变体出现：CPV-2a和CPV-2b型，与CPV-2相比，CPV-2a的VP2包含了5个氨基酸位点的突变(Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp305Tyr、Val555Ile)；1984年，另一个突变体CPV-2b被发现，其VP2发生Asn426Asp和Ile555Val两个位点的突变[6]。随后，CPV-2a和CPV-2b VP2基因发生Ser297Ala的突变，产生了New CPV-2a和New CPV-2b变异株[7-8]；2000年，在意大利首次报道了另一种新颖的抗原变体，其特征是Asp426Glu，遂命名为CPV-2c[9]，并快速在多个国家传播流行。相对于最初的CPV-2，抗原突变体CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c对犬的致病性更高，且病毒的宿主范围不断扩大[10]。

本研究从北京地区采集的犬粪便拭子成功分离鉴定到14株CPV毒株，并对其VP2和NS1基因进行序列分析，以期了解北京地区当前CPV的流行趋势，为控制该病的传播提供参考和依据。

1 材料与方法 1.1 样品采集及处理

从北京地区宠物医院收集了17份疑似细小病毒感染的犬粪便拭子，样品信息见表 1。将粪便拭子置于1 mL含10%甘油的PBS(pH 7.2)中，待PBS浑浊后，于4 ℃、12 000 r·min-1条件下离心10 min，取200 μL上清液用0.22 μm滤器过滤除菌，制备好的样品于－20 ℃保存，用于病毒DNA的提取。

表 1 临床样品采集的详细信息 Table 1 Details of the isolated CPV strains
1.2 DNA提取及PCR鉴定

采用艾德莱公司的DNA快速提取试剂盒提取样本DNA。根据VP2基因保守序列设计引物，序列：IdenP1：5′-TGATGGAGCAGTTCAACCAGA-3′，IdenP2：5′-TCAGATCTCATAGCTGCTGGA-3′，扩增片段大小为574 bp。引物由北京华大基因公司合成。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，IdenP1、IdenP2各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 病毒的分离及鉴定

经PCR鉴定为阳性的样本用于病毒的分离。将样品上清液接种至刚刚传代未贴壁的F81细胞悬液中，吹打混匀后，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中静置培养，每隔12 h观察细胞病变(CPE)。当CPE达到80%时收获病毒，反复冻融3次后，对病毒进行传代。待CPE稳定后，按照Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。并进行间接免疫荧光(IFA)鉴定。

1.4 分离毒株VP2、NS1全基因的扩增及克隆

利用提取的样本DNA，对VP2、NS1全基因进行扩增，扩增片段大小：VP2基因1 755 bp，NS1基因2 007 bp。引物序列：VP2-F：5′-CGGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTCAA-3′，VP2-R: 5′-GG- AATTCTTAGTATAATTTTCTAGGTGCTAGTT -3′；NS1-F：5′-GACCGTTACTGACATTCGC-3′，NS1-R: 5′-CGGCGTCAGAAGGGTT-3′。PCR反应体系：LA Taq酶0.5 μL，10×LA BufferⅡ 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，DNA模板2 μL，引物各1 μL，ddH2O补足至50 μL。将扩增的VP2和NS1基因克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司)中，并送北京华大基因公司进行测序。

1.5 分离毒株VP2、NS1基因的遗传进化分析

使用DNAStar软件对测序结果进行分析，并根据VP2基因中关键氨基酸位点对分离毒株进行基因型鉴定。从GenBank中检索来自世界各地的29个细小病毒序列，在Mega 6.0中使用最大似然法评估VP2和NS1的系统发育关系(重复数n=500)。

2 结果 2.1 病毒的分离鉴定

经PCR鉴定，17份临床病料为CPV阳性。将病料接种F81细胞，盲传3代后，14株毒株能够引起典型的CPE，PCR和IFA检测均为阳性(图略)，成功分离到14株CPV，分离株在F81细胞上生长良好，病毒滴度为106.19~106.76 TCID50·mL-1(表 1)。

2.2 CPV基因型的鉴定及VP2基因氨基酸位点的突变分析

获得14个毒株NS1和VP2基因完整ORF序列，426位氨基酸的突变被用来区分CPV-2a (426Asn)、CPV-2b (426Asp)和CPV-2c (426Glu)，297位氨基酸的差异用来区分CPV-2a/2b与New CPV-2a/2b(Ser297Ala突变被用作“New CPV-2a/2b”的标记)[8, 11]。14个CPV毒株中，7株为New CPV-2a亚型(CPV-BJ01-1、CPV-BJ01-2、CPV-BJ01-3、CPV-BJ01-6、CPV-BJ02-1、CPV-BJ02-3、CPV-BJ02-4)，7株为CPV-2c亚型(CPV-BJ01-5、CPV-BJ01-8、CPV-BJ01-9、CPV-BJ01-10、CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-6、CPV-BJ02-7)，未发现CPV-2a、CPV-2b或New CPV-2b亚型的毒株。

VP2蛋白共有6个突变的氨基酸位点(第5、13、370、426、440、574位)，其中, 仅有1样本(CPV-BJ01-9)在第5位和13位氨基酸发生突变(第5位：A→G，13位P→S)，有4个样本(CPV-BJ01-1、CPV-BJ01-3、CPV-BJ01-8、CPV-BJ02-1)在第574位发生E→K氨基酸突变；此外，VP2基因上15个核苷酸发生同义突变，对氨基酸序列没有影响。这些结果表明，少数氨基酸突变(残基5、370和440)被保存下来，随着CPV不断传播，新的氨基酸突变(13和574 aa)频繁发生。

2.3 NS1氨基酸位点的突变分析

NS1出现12个氨基酸位点的突变(第19、33、60、293、544、545、572、583、588、624、630、656位)，其中，第19、33、293、583、588、656位氨基酸仅发生1次突变(CPV-BJ02-6毒株第19位：K→R，CPV-BJ01-10毒株第33位：D→G，CPV-BJ01-9毒株第293位：V→F，CPV-BJ01-2毒株第583位：E→K，CPV-BJ02-4毒株第588位：S→N，CPV-BJ01-6毒株第656位：S→F)。另外，NS1基因上28个核苷酸突变为同义突变，对氨基酸序列没有影响。

2.4 VP2、NS1基因的遗传进化分析

VP2基因进化分析表明，大部分的CPV-2c亚型毒株(CPV-BJ01-8、CPV-BJ02-7、CPV-BJ01-5、CPV-BJ02-2、CPV-BJ01-10)与2016年广西南宁地区分离毒株(MK332001、MK332007)亲缘关系密切，CPV-BJ01-9株与2014年吉林地区分离株(KT162005)亲缘关系密切，另外1株(CPV-BJ02-6)与2014年黑龙江分离毒株(KT156832)亲缘关系密切，分离毒株与国外毒株明显分离(图 1)；大部分的new CPV-2a亚型毒株(CPV-BJ02-1株除外)均与广西南宁或吉林长春地区的分离株聚集在一起，说明本次分离毒株与广西或吉林地区分离毒株具有相同的起源。NS1基因系统进化分析发现，虽然14个毒株分别属于New CPV-2a和CPV-2c亚型，但它们的NS1基因都与New CPV-2a毒株亲缘关系较近(图 2)。

图 1 犬细小病毒VP2基因的遗传进化分析 Fig. 1 Maximum-likelihood tree based on VP2 gene sequences of canine parvoviruses (CPVs)
图 2 犬细小病毒NS1基因的遗传进化分析 Fig. 2 Maximum-likelihood tree based on NS1 gene sequences of canine parvoviruses (CPVs)
3 讨论

尽管疫苗已广泛应用，犬细小病毒仍是目前危害犬最重要的肠道病原之一，因此，进行持续的流行病学监测具有重要意义。对NS1和VP2基因的序列分析发现，除了已有报道的突变位点外，本研究首次发现了NS1基因上第19、33、293、588、624、656位氨基酸的突变，以及VP2基因上两个新的突变位点(13和574 aa)。这可能归因于新的选择压力，随着CPV的传播NS1、VP2基因仍在不断地发生突变，未来有可能会出现新的毒株。然而，这些突变位点是否与NS1、VP2发挥功能有关仍需进一步研究。

在基因系统进化分析中，虽然14个毒株分别属于New CPV-2a和CPV-2c，但是它们的NS1基因都与New CPV-2a毒株亲缘关系密切，这一现象可用于解释New CPV-2a和CPV-2c之间的重组。混合感染和连续的单向链置换复制机制可能有助于重组的发生[12]。从VP2和NS1基因的系统发育分析可以得出两个结论：1)即使VP2基因相同，NS1基因也可能不同。即拥有相同VP2基因序列的两种病毒不一定是同一株病毒；这可以解释CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-7和CPV-BJ01-8之间的关系，CPV-BJ01-1和CPV-BJ02-3之间的关系，CPV-BJ01-6和CPV-BJ02-4以及CPV-BJ01-5和CPV-BJ01-10之间的关系；2)可能CPV毒株VP2基因间关系不能完全代表NS1基因间的关系。例如，从VP2基因系统进化分析来看，CPV-BJ01-5、CPV-BJ01-8、CPV-BJ01-9、CPV-BJ01-10、CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-6、CPV-BJ02-7 7个毒株虽属于CPV-2c型，但其NS1基因却与New CPV-2a亲缘关系密切，造成这种差异的原因尚不完全清楚，但选择压力或重组可能有助于解释VP2和NS1相互冲突的系统发育树。对于病毒来说，表面抗原和内部抗原经历的选择压力不同，所以VP2比NS1的变异频率更快。因此，病毒频繁变异可能是逃避宿主免疫监视的重要因素[13]。

4 结论

成功分离鉴定到14株CPV毒株，New CPV-2a和CPV-2c型各7株。基因序列分析表明NS1、VP2基因仍在不断产生新的突变。分离毒株与广西或吉林地区分离毒株可能具有相同的起源。

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