禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)是属于禽腺病毒科、禽腺病毒属的双链DNA病毒，是引起肝炎-心包积液综合征(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)的主要病原[1]。HHS于1987年最早发生于巴基斯坦，随后在印度、科威特、伊拉克、日本、韩国、墨西哥等国家以及中美洲、南美洲等地区发生。自2015年5月份以来，由FAdV-4新基因型导致的HHS在我国主要养禽地区流行，给我国养禽业造成了巨大损失[2-4]。目前，FAdV-4的致病机制尚不明了。现有的研究显示，致病性FAdV-4感染后诱导鸡天然免疫应答，肝中白介素1β(IL-1β)的表达量显著升高[5-6]。
IL-1β的表达和分泌与NLRP3炎症小体密切相关。多种刺激原可以激活胞质天然免疫信号受体NLRP3，激活后的NLRP3使NLRP3炎性小体组装活化，从而引发IL-1β的分泌[7-9]。NLRP3是宿主细胞的核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide binding oligomerization domain, NOD)样受体(NLRs)病原模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRS)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPS)或危险相关分子模式(danger associated molecular patterns, DAMPS)后，再与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain, ASC)及Caspase-1(cysteine requiring aspartate protease-1, Caspase-1)共同组成的多聚蛋白复合体[10-13]。NLRP3炎性小体是天然免疫系统的重要组成部分，可响应病原刺激和细胞损伤，介导Caspase-1激活和促炎细胞因子IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和分泌，从而引发炎症反应[14-16]。
鉴于NLRP3炎症小体的活化与IL-1β的表达和分泌密切相关，本研究尝试建立检测鸡NLRP3的实时荧光定量PCR方法，对FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行分析，以期为解析NLRP3在FAdV-4致病机制中的作用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料致病性禽腺病毒4型(FAdV-4)毒株CH/HNJZ/2015(GenBank登录号：KU558760)由河南农业大学传染病实验室保存；总RNA提取试剂盒购自TIANGEN；反转录试剂购自TOYOBO；质粒提取和DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；常规PCR试剂、pMD-18T vector、SYBR Green Ⅰ染料和DNA Marker均购自TaKaRa。
1.2 方法1.2.1 鸡NLRP3基因的RT-PCR扩增和标准质粒的制备 根据GenBank数据库中鸡NLRP3基因序列(GenBank登录号：KF318520.1)，设计鸡NLRP3荧光定量特异性引物，qNLRP3-F：5′-TGAGGATTTGGACACCTTCCACCT-3′和qNLRP3-R：5′-TGCTTGATGCAGAAGCAAAGAGCC-3′。利用总RNA提取试剂盒，提取4周龄SPF鸡肝总RNA，并反转录成cDNA。使用特异性引物进行RT-PCR扩增180 bp的NLRP3基因片段。将扩增片段连接到pMD-18T载体，构建pMD-18T-NLRP3重组质粒，测定质粒浓度并根据换算公式计算出重组质粒的拷贝数：拷贝数(copies·μL-1)=[6.02×1023×(质粒浓度ng·μL-1×10-9)]/[DNA长度(bp)×660]。
1.2.2 鸡NLRP3荧光定量PCR的建立 以标准质粒pMD-18T-NLRP3为模板，利用SYBR Green Ⅰ染料和鸡NLRP3荧光定量PCR特异性引物，进行荧光定量PCR扩增。以出现荧光的Cq值最小和相对荧光强度(RFU)最大及熔解曲线不出现非特异性扩增峰为标准，分别对引物终浓度、退火温度和循环数进行优化。将标准质粒pMD-18T-NLRP3进行10倍倍比稀释，取1.0×103~1.0×107 copies·μL-1稀释度的标准质粒作为模板，以最佳反应条件建立鸡NLRP3实时荧光定量PCR标准曲线。
1.2.3 致病性禽腺病毒4型(FAdV-4)感染鸡不同组织中NLRP3基因转录水平的检测 60只4周龄SPF鸡(购自山东昊泰实验动物繁育有限公司)被随机平均分成2组，FAdV-4感染组鸡用105TCID50致病性FAdV-4毒株CH/HNJZ/2015经口服途径感染，对照组口服PBS。FAdV-4感染鸡在感染后4~6 d，相继发病死亡。分别取发病/死亡鸡和对照鸡的心、肝、肺、脾、肾、腺胃和盲肠扁桃体等组织样品，立即冻存于-80 ℃。利用RNA提取试剂盒提取各组织的总RNA，定量1 μg RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，利用建立的NLRP3荧光定量PCR检测鸡组织中NLRP3基因的转录水平。再利用GraphPad Prism5.0软件进行单因子方差(One-way ANOVA)分析和t检验统计分析。**表示差异显著(P < 0.01)，***表示差异极显著(P < 0.001)。
2 结果 2.1 鸡NLRP3基因扩增和标准质粒的制备以鸡肝总RNA反转录得到的cDNA为模板，使用常规PCR扩增NLRP3目的基因。扩增产物经2%琼脂糖凝胶进行检测，可观察到180 bp目的条带，大小与预期相符合(图 1)。将PCR产物胶回收纯化后连接至pMD-18T载体，经测序鉴定成功得到pMD-18T-NLRP3重组质粒。测定pMD-18T-NLRP3标准质粒浓度为233 ng·μL-1，利用计算公式计算出该标准品拷贝数约为7.5×1010 copies·μL-1。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.扩增的NLRP3基因；2.空白对照 M. DL2000 DNA marker; 1.Amplified NLRP3 gene; 2.Blank control 图 1 NLRP3基因的扩增 Fig. 1 Amplification of NLRP3 gene |
经过一系列荧光定量反应条件的筛选，最终的反应体系为总体系20 μL，其中，SYBRⓇ Prexim Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，无菌DEPC水6 μL，qNLRP3-F/R(10 μmol·L-1)各1 μL，模板2 μL。最佳反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 8 s，共40个循环；95 ℃ 10 s；65 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s。在该条件下熔解曲线单峰，表明设计的引物特异性良好(图 2)。
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A.扩增曲线；B.标准曲线(X为拷贝数)；C.熔解曲线；1~5.1.0×107~1.0×103 copies·μL-1 A. Amplification curve; B. Standard curve (X.Copies number); C. Melting curve; 1-5.1.0×107-1.0×103 copies·μL-1 图 2 鸡NLRP3 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR标准曲线建立 Fig. 2 Establishment of standard curve of chicken NLRP3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR |
利用1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103 copies·μL-1稀释度的标准品为模板进行荧光定量PCR。荧光定量结果显示，以相对荧光强度(RFU)为纵坐标，循环数(cycle)为横坐标建立的扩增曲线光滑，扩增效率好；荧光定量标准曲线显示，以Cq值为Y、拷贝数为X建立的标准曲线方程为Y=-3.434lgX+37.777，相关系数R2为0.999，扩增效率E为95.5%，满足R2＞0.999，110%＞E＞90%。标准曲线显示质粒标准品拷贝数与Cq值之间具有良好的线性关系(图 2)。
2.3 致病性FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3基因转录水平的检测利用建立的鸡NLRP3 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，对致病性FAdV-4感染鸡和未感染对照鸡各组织中NLRP3的转录水平进行测定。结果显示，该方法能检测出鸡不同组织中NLRP3基因的转录，各组织中NLRP3的转录水平有所差异。FAdV-4感染鸡肝和脾中NLRP3的转录水平极显著(P < 0.001)高于对照组，盲肠扁桃体和法氏囊中NLRP3的转录水平显著(P < 0.01)高于对照组(图 3)。在致病性FAdV-4感染鸡的心、肝和脾组织中NLRP3的转录水平极显著(P < 0.001)高于法氏囊、肺、肾、腺胃和盲肠扁桃体，而心、肝、脾组织中NLRP3的转录水平差异不显著。法氏囊中NLRP3的转录水平极显著(P < 0.001)高于肺、肾、腺胃和盲肠扁桃体，且盲肠扁桃体中NLRP3的转录水平极显著(P < 0.001)高于肺、肾和腺胃，肾中NLRP3的转录水平极显著(P < 0.001)高于肺和腺胃，肺和腺胃组织中NLRP3的转录水平差异不显著。
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组间比较，**.差异显著(P < 0.01)；***.差异极显著(P < 0.001)。感染组组织间比较，不同字母表示差异极显著(P < 0.001). Comparison between groups, **. Significant difference (P < 0.01); ***. Extremely significant difference (P < 0.001). Comparison among organizations of infected group, different letters indicate significant differences (P < 0.001) 图 3 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测FAdV-4感染鸡组织中的NLRP3基因转录水平 Fig. 3 SYBR Green I real-time PCR for quantitative detection of NLRP3 gene in FAdV-4-infected chicken tissues |
炎症小体既是宿主天然免疫应答的重要组成部分，同时也在病毒致病机制中发挥重要作用[17]。NLRP3炎性小体是天然免疫系统的重要调节剂，在正常细胞中保持较低的水平，然而，一些病原的刺激会引起NLRP3炎性小体的过度活化，从而诱发细胞炎性因子风暴导致机体的病理损伤[18-19]，NLRP3分子是NLRP3炎症小体复合物的重要组成成分[20-21]，很多病毒感染与NLRP3炎症小体的激活相关[22]。参与激活过程的病毒组分主要包括病毒核酸、离子通道蛋白和非结构蛋白等。如人腺病毒感染巨噬细胞可以导致IL-1β的快速释放，这种反应依赖于NLRP3炎症小体的形成和Caspase-1的活化[23-24]；流感病毒的RNA和M2通道蛋白均可激活炎症小体[25-26]；脑心肌炎病毒的通道蛋白2B可以激活NLRP3炎症小体[27]；猪瘟病毒的p7通道蛋白可激活猪巨噬细胞炎症小体[28]；猪繁殖与呼吸综合征病毒通过NLRP3炎症小体活化诱导巨噬细胞表达IL-1β[29-30]。丙型肝炎病毒感染会刺激肝巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化产生IL-1β进而造成肝炎症[31]。迄今为止，与病毒感染相关的NLRP3炎症小体的研究报道主要集中在哺乳动物模型，而与禽类病毒感染相关的禽NLRP3炎症小体的研究相对较少，主要原因是受限于禽类NLRP3炎症小体相关分子的检测方法和研究材料。Ye等[32]首次研究了中国三黄鸡体内NLRP3的组织特异性表达图谱和组织分布。陶志云等[33]开展了鸡小肠上皮细胞的分离培养和NLRP3在该细胞中的表达研究。Wang等[34]证明新城疫病毒(NDV)可以激活小鼠和人巨噬细胞中的NLRP3和增加IL-1β的表达。Gao等[35]首次证实了NDV在感染的鸡细胞中通过活化NLRP3/Caspase-1炎症小体诱导IL-1β的高表达。建立鸡NLRP3分子的检测技术有助于研究其在禽病发生中的作用。目前国内外尚未见有关鸡NLRP3分子实时荧光定量PCR检测方法的报道。
自2015年5月份以来，由FAdV-4导致的鸡HHS给我国养禽业造成了巨大损失。研究显示，致病性FAdV-4感染鸡的肝、肺、脾和法氏囊等组织存在严重的淋巴细胞变性、坏死等炎症损伤，而且这些组织中IL-1β的表达量与未感染对照鸡相比显著升高[5-6]。鉴于NLRP3炎症小体的活化与IL-1β的表达和分泌密切相关，本研究设计鸡NLRP3特异性引物，建立了检测鸡NLRP3的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示，所建立方法对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好，标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系，所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因。
应用所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR对致病性FAdV-4感染鸡和正常鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了检测。结果显示，该方法能检测出不同组织中NLRP3基因的转录。与对照组比对发现，NLRP3分子在致病性FAdV-4感染鸡肝、脾中的转录水平极显著高于对照组，在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组，提示这些器官是致病性FAdV-4的主要靶器官。致病性FAdV-4感染发病鸡的心、肝、脾和法氏囊组织中NLRP3的转录水平显著高于其他组织，这也与笔者前期研究结果显示的致病性FAdV-4感染鸡的心、肝、脾和法氏囊组织中IL-1β的高水平表达，以及这些组织的严重炎症损伤病变相一致。鉴于NLRP3炎症小体在IL-1β成熟和分泌过程中扮演重要角色，而IL-1β又是炎症反应的重要介质，笔者推测致病性FAdV-4的致病过程是通过激活NLRP3炎症小体，进而导致炎症因子IL-1β的过量表达和分泌，最终导致机体组织的组织炎症损伤。
4 结论本研究建立了一种检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR方法，该方法能检测鸡不同组织中NLRP3基因的转录，检测结果表明各组织中NLRP3的转录水平有所差异。致病性FAdV-4感染发病鸡肝、脾、盲肠扁桃体和法氏囊中NLRP3的转录水平显著高于未感染对照组(P < 0.01)；NLRP3分子在致病性FAdV-4感染鸡的心、肝、脾和法氏囊组织中的转录水平极显著高于其他组织(P < 0.001)。本研究可为进一步研究鸡NLRP3分子在FAdV-4致病机制中的作用提供方法和技术支持。
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