2. 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室, 农业部动物免疫学重点实验室, 河南省动物免疫学重点实验室, 郑州 450002;
3. 河南省农业科学院, 中英禽病国际研究中心, 郑州 450002;
4. 河南农业大学牧医工程学院, 郑州 450002
, TENG Man2,3, LIU Jinling2,3, ZHOU Ziyu1,2,3, ZHENG Luping2,3, CHU Yushu2,3,4, DING Ke1, YU Zuhua1
, LUO Jun2,3
2. Key Laboratory of Animal Immunology, Ministry of Agriculture & Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China;
3. UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China;
4. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
马立克病(Marek’s disease，MD)是由鸡马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)感染鸡引发的一种重要的免疫抑制病及肿瘤病[1]。MD是最早使用疫苗成功预防肿瘤发生的一种肿瘤病，近年来随着疫苗免疫压力增强，MDV的毒力不断增强，在疫苗免疫鸡群中仍时有MD病例发生，特超强毒株可能已突破CVI988/Rispens疫苗的免疫保护，给全球养禽业造成严重经济损失[2]。
CRISPR/Cas9基因编辑技术自2013年首次成功应用于人类免疫缺陷病毒基因编辑以来[3]，短短数年间已被广泛应用于DNA病毒的基因编辑，如单纯疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病病毒、牛痘病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、豚鼠巨细胞病毒、鸭肠炎病毒、禽腺病毒4型以及非洲猪瘟病毒等[4-15]。已被编辑的病毒大多属于疱疹病毒。作为α-疱疹病毒的重要成员，MDV是目前已知致瘤性最强的一种，被认为是研究病毒致病及致瘤机制的理想模型[16]。
MDV基因组为线性双股DNA，全长约180 kb[17]。meq是公认的主要致瘤基因，在MD肿瘤发生中具有重要作用[18-19]，同时，它也是具有重要进化意义的毒力基因，在强毒株和疫苗毒株之间具有明显的序列差异性。因此，特异识别不同毒力毒株MEQ蛋白的单克隆抗体，可用于MDV感染与免疫的鉴别诊断。本文以CVI988/Rispens的meq基因为靶点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建meq基因编辑的缺失毒株，以期为后续差异筛选和鉴定抗MD疫苗株MEQ蛋白的单抗及鉴别诊断研究奠定重要基础。
1 材料与方法 1.1 细胞、毒株、质粒与抗体鸡胚成纤维细胞(CEF)用9~10日龄SPF鸡胚制备；CVI988/Rispens液氮苗购自梅里亚公司；pX459 v2.0质粒和兔抗MDV-MEQ多抗由英国Pirbright研究所Venugopal Nair教授馈赠；MDV-gB单抗由山东农业大学崔治中教授馈赠。
1.2 主要试剂与设备M199培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；0.25%胰酶、双抗、TPB、1 mol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0)、0.5 mol·L-1 EDTA(pH 8.0)和蛋白酶K溶液(10 mg·mL-1)购自Solarbio公司；Ex Taq DNA聚合酶、DH5α感受态、DNA胶回收试剂盒和PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司；BbsⅠ-HF限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；转染试剂Trans IT-X2TM Dynamic Delivery System购自Mirusbio公司；质粒提取试剂盒QIA prep® Spin Miniprep kit购自Qiagen公司；FastStart Universal SYBR Green MasterBak购自ROCHE公司；DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG和DyLight 488 Goat Anti-Rabbit IgG均购自Abbkine公司。
美国Nano Drop 2000紫外分光光度计；德国耶拿梯度PCR仪；美国ABI公司7500 FAST荧光定量PCR仪；德国Leica公司DMI-6000全自动倒置荧光显微镜。
1.3 gRNA与引物设计根据GenBank数据库中Md5(登录号AF243438.1)和CVI988/Rispens(登录号ABF72323.1)的meq基因序列，使用GenScript’s gRNA在线软件(https://www.genscript.com)，分别设计靶向meq 5′端和3′端保守区的gRNA：meq-gRN和meq-gRC，并在5′端添加BbsⅠ酶切位点(表 1)。用Premier Primer 5.0软件设计引物Step2-F和Step2-R用于pX459-gRNA质粒鉴定；meq-F和meq-R用于扩增meq基因，上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 靶向meq基因的gRNA和用于突变体鉴定的引物序列 Table 1 Oligos and primers used for gRNA cloning and PCR identification of mutants |
将gRNA互补双链复性，连接至BbsⅠ-HF酶切回收的pX459质粒载体，转化DH5α感受态，挑单菌落用Step2-F/Step2-R引物对进行PCR，阳性菌送样测序。确认后提取质粒，测定浓度，-20 ℃保存备用。
1.5 质粒转染及病毒感染CEF以1.5×105个·孔-1接种24孔细胞板，置38.5 ℃、5% CO2培养过夜，按照Trans IT-X2转染试剂说明书操作，将pX459-gRNA质粒共转染CEF，继续培养24 h后接种CVI988/Rispens(5 000 PFU·孔-1)，置38.5 ℃、5% CO2培养，48 h后取样进行PCR鉴定。
1.6 基因编辑分析胰酶消化“1.5”中CEF转染/感染细胞，取一半样品离心收集细胞，用1×DNA提取缓冲液(10 mmol·L-1 Tris-HCl，1 mmol·L-1 EDTA，25 mmol·L-1 NaCl和200 μg·mL-1蛋白酶K)混悬，65 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min，制备总DNA。用meq-F/meq-R引物对进行PCR，反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min；30个循环后，72 ℃ 5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段，16 ℃连接至pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落用meq-F/meq-R引物对进行PCR鉴定，阳性菌送样测序。
1.7 病毒克隆与纯化取“1.6”中基因编辑阳性的另一半病毒感染细胞，有限稀释后转接6孔板CEF单层，置38.5 ℃、5% CO2培养3~4 d，显微镜下挑取单噬斑，再次转接24孔CEF中，48 h后按“1.6”所述再次PCR，阳性孔同上进行第二轮单噬斑纯化。经过2轮纯化、PCR鉴定均为阳性编辑的病毒噬斑，再次进行测序分析，同时扩大培养，保种冻存。同时，将编辑毒株连续传代，分别收集第5、10、15代病毒样品进行PCR分析。
1.8 IFA鉴定将CVI988/Rispens和meq基因编辑毒株分别接种48孔细胞培养板上的CEF单层，38.5 ℃、5% CO2培养3 d，用预冷的甲醇/丙酮(1:1)溶液固定，200 μL·孔-1，10 min；PBST(含0.05% Tween-20的PBS)洗3遍，加入含5%脱脂奶的PBST封闭，500 μL·孔-1；PBST洗3遍，加入1:2 000稀释的MDV-gB单抗孵育, 50 μL·孔-1, 37 ℃ 30 min；PBST洗3遍，DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG(1:1 000)稀释液孵育, 50 μL·孔-1, 37 ℃ 30 min；PBST洗3遍，再按上述方法加入MDV-MEQ多抗(1:5 000)和DyLight 488 Goat Anti-Rabbit IgG(1:1 000)稀释液；PBST洗3遍后，荧光显微镜下观察，并拍照。
2 结果 2.1 pX459-gRNA质粒构建及鉴定序列比对分析显示：Md5 meq基因全长1 020 bp，CVI988/Rispens meq基因全长1 196 bp。后者在Md5 meq基因575位有1个176 bp的片段插入(图 1)，其余序列完全相同。设计2个gRNA meq-gRN和meq-gRC，分别靶向meq基因5′和3′末端保守区域，克隆至pX459质粒并转化DH5α感受态，挑取单菌落用Step-2 F/R引物对进行PCR，结果表明成功构建Cas9/gRNA表达质粒pX459-meq-gRN和pX459-meq-gRC。
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图 1 Meq基因座位及gRNA靶点示意图 Fig. 1 Schematics demonstrating the targeting sites of gRNAs used for meq gene editing |
将pX459-meq-gRN和pX459-meq-gRC共转染CEF单层，然后接种CVI988/Rispens，PCR分析结果显示：质粒未转染/病毒感染细胞中仅扩增出1 196 bp的meq特异性条带，而质粒转染/病毒感染细胞中除扩增出1 196 bp meq条带外，还扩增出约100 bp的预期编辑产物条带(图 2A)。小条带产物的测序结果显示，gRN/gRC组合对meq基因进行了有效编辑，双链裂口(DSB)精确发生于2个gRNA PAM序列内侧2~3个碱基处(图 2B、C)，产生的基因突变与预期相符。
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A. meq基因编辑的PCR鉴定；B.野生型和突变型meq基因序列比对；C.突变型meq基因序列图谱； A. PCR analysis of the edited meq genes in CVI988/Rispens viruses; B. Alignment of the wild and mutated types of meq genes; C. Sequence scheme of mutated meq genes; A′. PCR analysis of the stability of meq-deletion in passaged CVI988Δmeq viruses. M.DL2000 DNA marker 图 2 meq基因编辑的PCR鉴定及测序分析 Fig. 2 PCR analysis and DNA sequencing of the gene editing of meq genes |
将上述发生meq基因编辑的感染细胞样品，以有限稀释法转接CEF单层，进行单噬斑纯化和PCR鉴定。结果显示，72个随机挑选的病毒噬斑中，克隆号为C7的病毒噬斑PCR产物仅有100 bp编辑条带，其测序结果和“2.2”测序分析结果完全相同，表明C7为meq基因缺失毒株。对其进行两轮单噬斑纯化，命名为CVI988△meq-C7。连续传代15次，分别收集其第1、5、10、15代次的病毒样品进行PCR分析，结果显示，不同代次病毒样品中均只能扩增出100 bp突变型meq基因产物(图 2A′)，表明meq基因缺失非常稳定，连续传代过程中未发生回复突变。
2.4 meq基因缺失的IFA鉴定将CVI988/Rispens或CVI988△meq-C7感染的CEF固定，分别孵育MDV-gB单抗或MDV-MEQ多抗进行IFA染色。结果显示(图 3)，用gB单抗孵育的两种病毒感染CEF均呈现红色荧光染色、形态相似的病毒噬斑，表明gB蛋白在两株病毒中均正常表达。用MEQ多抗孵育染色时，绿色荧光病毒噬斑仅出现在CVI988/Rispens感染细胞中，而在CVI988△meq-C7感染细胞中未观察到荧光染色。上述结果证实CVI988△meq-C7的meq基因被编辑缺失，不再表达MEQ蛋白。
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图 3 病毒感染CEF中gB和MEQ蛋白的IFA分析(比例尺=100 μm) Fig. 3 Expressions of gB and MEQ proteins in virus-infected CEFs detected by IFA (Scale bar=100 μm) |
20世纪90年代，全球广泛使用CVI988/Rispens防控MD，起到了较好的免疫保护效果[20-21]，近年来，MDV毒力进一步增强，CVI988/Rispens免疫鸡群中仍能分离到致病性更强的毒株[22]。CVI988/Rispens是MDV自然减毒株，与强毒株相比具有98%的基因组相似性[23]，但与毒力密切相关的原癌基因meq却存在较大的序列差异，如在meq基因编码的反式激活结构域有1个176 bp核苷酸的插入，因此也被称为L-meq[24-25]。这种插入造成反式激活区富含脯氨酸重复序列(proline-rich repeats, PRR)的数量增加，导致L-meq基因产物的反式激活区活性不同，可能是CVI988/Rispens疫苗株丧失致癌性的原因[26]。因此，meq和L-meq及其表达的MEQ蛋白，可作为强、弱毒株的鉴别诊断标识。此前利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，已实现了HVT基因编辑[27-28]。利用该技术，作者所在课题组也对MD肿瘤细胞整合的病毒pp38和miRNA基因进行了编辑和缺失[29-30]。本研究中，通过设计合成靶向meq基因两端的gRNA组合，利用双gRNA质粒转染和病毒感染的模式对CVI988/Rispens的meq基因进行了编辑，经PCR筛选、测序分析、病毒纯化、IFA鉴定等一系列试验，最终构建了meq基因缺失的CVI988△meq-C7毒株，该毒株可连续传代，稳定性良好。在后续研究中，将其与此前已构建的Md5△meq基因缺失毒株一起，采取交叉筛选的方式可供鉴定不同毒力MDV MEQ蛋白的抗体，为MD感染与免疫的鉴别诊断研究奠定了重要的基础。
4 结论利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过双gRNA转染/MDV病毒感染的模式，成功构建了meq基因缺失的CVI988△meq-C7毒株，为后续筛选和鉴定MD疫苗株MEQ蛋白的特异性抗体奠定了基础。
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