钴(Co)是动物必需微量矿物元素之一，是反刍动物维生素B12(VB12)合成的底物。VB12是多种酶的辅酶，它作为甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅酶，在糖异生中催化L-甲基丙二酰辅酶A转变为琥珀酸辅酶A[1]，由此进入三羧酸循环进行丙酸代谢生成葡萄糖为反刍动物提供能量。VB12参与DNA合成，促进红细胞的发育和成熟[2-3]。NRC标准推荐泌乳奶牛日粮钴添加水平为0.11 mg·kg-1 DM，我国农业部公告2625中规定，牛、羊全混合日粮中的钴添加量为0.10~0.30 mg·kg-1 DM，允许以硫酸钴、氯化钴、乙酸钴和碳酸钴形式添加。该添加剂量是在维持动物健康的前提下提出。根据肝组织钴含量比较不同形式钴的生物学利用率表明，碳酸钴＞硫酸钴＞葡萄糖酸钴＞氧化钴[4]。研究表明，以葡萄糖酸钴添加，Co含量在0.19~0.93 mg ·kg-1 DM时不会影响DMI、产奶量和乳成分[5]；每日添加1.20 mg·kg-1 DM的Co不会影响奶牛的产奶性能和血清VB12浓度[6]。我国允许添加的钴为无机钴，对无机形式的钴源在奶牛上的研究结果较少。动物摄入过高剂量的氯化钴会出现临床症状，如细胞缺氧凋亡以及心、肝和肾功能损伤的机率增加[7-9]，对碳酸钴的剂量效果未见详细报道。因此，本研究选用碳酸钴为研究对象，以我国允许的钴添加量为参照，设置不同的钴添加水平，评价钴添加量对奶牛泌乳性能、养分消化率和血液生化指标的影响。
1 材料与方法 1.1 试验设计和日粮配方试验选用30头泌乳中期的荷斯坦奶牛(平均产奶量(26.2±4.1) kg)，随机分为5组，每组6个重复，每个重复1头奶牛。对照组饲喂含Co 0.12 mg·kg-1 DM的基础日粮(NRC标准为0.11mg·kg-1 DM)，其他4个处理组在基础日粮中分别以CoCO3(上海阿拉丁生化技术有限公司)的形式添加Co 0.15、0.30、0.75和1.50 mg·kg-1 DM，。适应期14 d，正试期42 d。奶牛采用栓系饲养，每日饲喂3次(07：00、15：00和22:00)，日粮配方及营养成分见表 1，并保证每头牛每日约有2%的饲料残余量，自由饮水(Co含量低于0.30 μg·L-1)。
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表 1 基础日粮组成和营养成分(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
1.2.1 产奶量和乳成分分析 每天记录每头牛的产奶量。在预试期最后2 d，正试期第13、14、27、28、41、42天采集奶样，按每日早中晚4:3:3的比例混合一日的奶样，加入少量重铬酸钾防腐保存，送上海光明乳业(上海)的DHI牛奶检测实验室检测乳脂、乳蛋白、乳糖、乳尿素氮含量。
1.2.2 营养物质消化率分析 每日称重饲喂量和饲料残余量，每周收集每头牛的新鲜饲料和饲喂残渣样品，计算DMI。在正试期第40、41和42天，通过直肠取粪收集粪便样品，收集时间安排为：第一天04：00、09：00、14：00、19：00；第二天05：00、10：00、15：00、20：00；第三天06：00、11：00、17：00和22:00[10]，每个时间点采集300 g粪样。新鲜的粪样和饲料样品在65 ℃鼓风干燥箱中干燥48 h后，粉碎过1 mm筛，保存备测。将样品置于105 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h测定DM含量(AOAC，2000;方法934.01)；用Foss TecatorKjeltec 2300凯氏定氮仪测定粗蛋白(CP)含量(AOAC，2000；方法976.05)；用乙醚索氏提取法测定粗脂肪(EE)含量(AOAC，2000；方法920.39)；用Ankom纤维分析仪测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量[11]。营养物质的消化率选用酸不溶灰分(AIA)的内源指示剂法来测定，AIA的测定方法参照国家标准GB/T 23742—2009。
消化率(%)的计算公式为：
| $ A = 100 - \left( {\frac{{{B_1} \times {C_2}}}{{{B_2} \times {C_1}}}} \right) \times 100 $ |
其中B1(g·kg-1)和B2(g·kg-1)分别代表饲料和粪便中的AIA，C1(g·kg-1)和C2(g·kg-1)代表饲料和粪便中的营养物质。
1.2.3 血样的采集与分析 在预试期结束时和正试期第42天晨饲后2 h，采集尾静脉血放入含有肝素钠的真空采血管中，3 500 r·min-1离心15 min获得血浆，分装，保存在－80 ℃冰箱中。
采用全自动生化分析仪测定血样中的葡萄糖、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞压积(HCT)。采用酶标仪Elisa试剂盒(Cloud-Clone公司)分析维生素B12(VB12)的含量。
1.3 统计分析所有数据均使用Proc Mixed SAS 9.2程序进行分析，采用最小显著差异(Tukey’s)法对处理进行多重比较。该模型包括钴添加量的线性和二次曲线对比，以P＜0.05为差异显著性标准。
2 结果 2.1 日粮钴水平对奶牛泌乳性能和营养物质消化率的影响产奶量和乳成分结果见表 2，能量校正乳随日粮钴添加量的升高呈二次曲线变化，回归公式为ECM= －7.352×剂量2+10.801×剂量+25.780(R2=0.269)。其中，钴添加量为0.30和0.75 mg·kg-1 DM时ECM最高(P＜0.01)，使用拟合回归公式推导最适宜的Co添加剂量为0.73 mg·kg-1 DM；DMI和乳成分含量在各组间无显著差异(P＞0.05)。营养物质的表观消化率结果见表 3，由表可知，营养物质表观消化率随日粮钴添加量呈线性变化规律，其中0.75 mg·kg-1 DM组的ADF和CP的消化率最高，显著高于对照组(P＜0.05)，1.50 mg·kg-1 DM组的ADF消化率显著低于0.75 mg·kg-1 DM组(P＜0.05)；NDF和EE的消化率在各组间无显著差异。
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表 2 日粮碳酸钴添加量对奶牛泌乳性能的影响 Table 2 Effects of dietary Co supplementation on lactation performance in dairy cows |
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表 3 日粮碳酸钴添加量对奶牛营养物质表观消化率的影响 Table 3 Effects of dietary Co supplementation on nutrient apparent digestibility in dairy cows |
血浆TP、ALB、GLO、A/G、CREA、BUN和UA含量在各组间无显著差异(表 4)。血浆葡萄糖浓度随日粮钴含量的增加呈二次曲线变化(GLU=－0.492×剂量2+0.394×剂量+3.362，R2=0.264)其中0.15~0.75 mg·kg-1 DM组的葡萄糖含量逐渐上升(P＜0.05)；TG含量随日粮钴含量的增加而线性增加，并在1.50 mg·kg-1 DM组达到最高值(P＜0.05)；CHO、HDL、LDL含量在各组间无显著差异。
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表 4 日粮碳酸钴添加量对奶牛血液生化指标的影响 Table 4 Effects of dietary Co supplementation on plasma biochemical parameters in dairy cows |
与对照组相比，0.15~0.75 mg·kg-1 DM组的血浆ALT活性较低(表 5，P＜0.05)；1.50 mg·kg-1 DM组的血浆AST活性较低(P＜0.05)；0.75 mg·kg-1 DM组ALP活性较低(P＜0.05)；血浆GGT和LDH活性在各组间无显着差异。日粮钴水平的增加显著提高了RBC和HGB含量以及HCT(表 6，P＜0.05)，回归公式为RBC=-0.716×剂量2+1.446×剂量+ 5.514，R2=0.403；
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表 5 日粮碳酸钴添加量对奶牛血液酶的影响 Table 5 Effects of dietary Co supplementation on plasma enzyme in dairy cows |
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表 6 日粮碳酸钴添加量对奶牛造血功能的影响 Table 6 Effects of dietary Co supplementation on hematopoietic function in dairy cows |
HGB=-16.991×剂量2+32.355×剂量+84.906，R2=0.463；HCT=-5.335×剂量2+10.532×剂量+22.705，R2=0.557。血浆VB12浓度在各组间无显著差异。
3 讨论Kincard等[12]报道，日粮钴水平为0.37、0.68和1.26 mg·kg-1 DM对奶牛DMI、产奶量和乳成分含量没有显著影响。在本研究中，钴水平为0.15~ 1.50 mg·kg-1 DM日粮没有显著改变DMI和乳成分，这与前人的研究一致。不同的是，本研究中的产奶量随着钴添加量的增加而呈二次曲线变化，0.30和0.75 mg·kg-1 DM组的产奶量最高，1.50 mg·kg-1 DM组降低了产奶量，因此推测，日粮钴含量高于1.50 mg·kg-1 DM对泌乳性能有负面影响。Akins等[6]发现，在奶牛日粮中每日添加钴1.20 mg·kg-1 DM没有显著改变血浆葡萄糖浓度。相反，羔羊日粮添加钴0.25、0.50、1.00 mg·kg-1 DM时，血浆葡萄糖浓度升高[13]；Dezfoulian和Aliarabi[14]报道，日粮添加钴0.25和0.50 mg·kg-1 DM至35 d，显著提高了山羊血糖浓度，这与本试验结果相似。本研究中，血糖浓度在0.30和0.75 mg·kg-1 DM组最高，但1.50 mg·kg-1 DM组降低，说明高剂量的日粮钴可能对葡萄糖代谢和糖异生代谢有负面影响。总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白是反映体内脂类物质代谢的重要指标。总胆固醇是重要的能量存储，是所有类固醇的前体，类固醇的含量反映了动物体内脂质的水平。在胆固醇的运输过程中，低密度脂蛋白会将其带入血管并促进其沉积，从而导致体内动脉粥样硬化，而高密度脂蛋白会将其由血管中带入肝，从而降低血液脂质含量。本研究添加不同水平的碳酸钴对脂类代谢相关指标没有明显影响，说明1.50 mg·kg-1 DM以内的钴添加量不影响奶牛的脂类代谢，这与Kincard等[5, 12]的报道相似。血糖含量的变化规律与产奶量的变化规律一致，表明日粮钴可能通过调控机体葡萄糖代谢来影响动物的产奶量。此外，Scholljegerdes等[15]报道，每日钴饲喂量为7.1 mg的羔羊，CP、NDF和ADF的表观消化率不受影响。同样，体外发酵底物含钴2、4和8 mg·kg-1 DM不影响体外DM、NDF和ADF的消化率[16]。但是，日粮添加钴0.25~1.00 mg·kg-1 DM提高了羔羊的饲料干物质、有机物、CP和NDF的消化率[17]。本研究结果表明，日粮添加钴0.75 mg·kg-1 DM可以显著提高CP和ADF的表观消化率，这与Dezfoulian和Aliarabi[14]的结果相似。本研究表明，日粮Co含量为0.30~0.75 mg·kg-1 DM有利于营养物质的消化。
谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反刍动物中两个重要的氨基转移酶，它们在合成非必需氨基酸以及蛋白质降解中起着重要的中介作用。碱性磷酸酶是反刍动物消化和代谢中的关键酶，可参与蛋白质和脂肪代谢。Liu等[17]在小鼠腹膜内注射0、0.82、1.62和3.28 mg·(kg·d)-1的Co，发现各组之间的ALT和AST浓度均无显著差异。本试验0.75 mg·kg-1 DM组的ALT显著低于对照组，AST活性在1.50 mg·kg-1 DM组中最低，这与在断奶山羊上的研究相似[18]。血浆白蛋白(ALB)可以维持血液渗透压，输送营养并为动物提供蛋白质。血浆球蛋白(GLO)主要由补体蛋白和免疫球蛋白组成，可以激活补体，结合抗原并调节免疫力。血浆肌酐、尿素氮和尿酸是蛋白质代谢和氨基酸平衡的重要指标[19]。Keady等[20]在羔羊日粮中添加钴2.1 mg·mL-1，发现白蛋白的含量升高，但球蛋白和尿酸氮含量不受影响。Ghoreishi等[21]在羔羊日粮中添加了10 mg ·kg-1 BW的钴，发现血浆尿素氮含量升高。本研究中，添加不同水平的钴对乳和血浆氮素营养相关指标均无显著影响，表明钴的添加量为0.15~1.50 mg·kg-1 DM时，可能不影响血液免疫系统和蛋白质代谢。
有研究表明，日粮钴可缓解肉牛的VB12不足[22]。血浆中VB12的含量在一定程度上可以反映动物体内钴的代谢，日粮钴含量过低导致血中VB12含量下降[23]。Vellema等[24]发现，在羔羊日粮中添加钴后，血浆VB12含量显着增加；Ghoreishi等[21]报道，给羔羊口服10 mg·kg-1 BW的钴可增加血浆VB12水平, 这些结果与Bishehsari等[13]的结果一致。然而，Stemme等[25]的研究表明，日粮中添加0.27 mg·kg-1 DM的钴对VB12含量没有显著影响。有报道称，日粮添加Co不会改变血液中VB12的浓度，但通过注射VB12会显著增加其血液中的浓度[26-27]。在本研究中，尽管血浆VB12不受日粮Co添加量的影响，但与VB12相关的功能性指标发生了变化。VB12在造血功能上起着重要的作用。本试验中添加钴显著升高了血液红细胞、血红蛋白含量和红细胞压积，这与王润莲等[3]在羊的研究结果一致。在山羊皮下注射2 mg VB12，与对照组相比，红细胞、红细胞压积和血红蛋白含量显著提高[28]。说明添加0.15~0.75 mg·kg-1 DM钴可以显著提高动物的造血功能。
4 结论日粮添加0.15~1.50 mg·kg-1 DM的钴对泌乳中期奶牛的DMI和乳成分含量没有影响，添加0.30和0.75 mg·kg-1 DM的钴提高了产奶量、ADF和CP表观消化率，但添加钴1.50 mg·kg-1 DM降低了产奶量、ADF消化率、血浆葡萄糖浓度和AST活性；日粮添加钴显著提高了红细胞和血红蛋白的含量。根据泌乳性能推导泌乳中期奶牛的日粮Co(CoCO3形式)最适宜添加水平为0.73 mg·kg-1 DM。
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