, LI Guoli, ZHANG Dajun, XU Guowei, HOU Jing, LI Dan, DANG Wen, ZHANG Keshan
, ZHENG Haixue, LIU Xiangtao
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染引起的一种猪烈性传染病，病死率接近100%。该病于1921年首先在肯尼亚报道[1]，2018年8月3日，中国正式报道了该病的存在，随后非洲猪瘟在我国大面积暴发导致养猪业损失惨重，进而引起猪存栏数锐减、肉价飙升，对我国养猪业健康发展、猪肉稳定供应和经济稳定发展等带来严峻挑战[2-3]。ASFV是ASFV科的唯一成员[4-5]，主要感染家猪、野猪、疣猪以及钝缘软蜱[4-7]，并在受感染的宿主巨噬细胞(天然靶细胞群)中编码150种以上的蛋白质[8]。ASFV基因组结构为双链线性DNA，大小170~194 kb[9]，中间有125 kb左右的保守区，两端为可变区并含有末端反向重复序列，基因组总共含有151~167个ORFs，这些ORFs存在于两股DNA链上[10-11]。该病毒目前只有一个血清型，但含有二十多个基因型[12]，根据其结构蛋白p72和p54基因的保守区域进行基因型分型[13-14]。ASFV通过自身编码的结构蛋白和非结构蛋白以多种途径拮抗宿主天然免疫和获得性免疫应答感染宿主体内的单核巨噬细胞[15]。ASFV基因组含有多个独特的多基因家族(multigene families, MGF)，根据基因表达蛋白大小可以划分为MGF 360、MGF 110、MGF 300和MGF 505/530等[16]，MGF 360基因处于ASFV全基因组结构左末端或右末端高度可变区且基因产物具有相似的结构[17]，是ASFV的主要毒力基因的一部分，也是ASFV基因缺失疫苗优先敲除的基因之一[18-19]。MGF 360-9L是MGF 360成员之一[20]，本实验室前期通过基因合成的方法获得Ⅱ型ASFV Georgia 2007/1 (FR682468.1)株全部MGF 360家族成员基因，研究发现，其中MGF 360-9L具有显著抑制天然免疫应答的功能(数据未发表)。为了进一步明确ASFV MGF 360-9L基因结构和功能的关系，本研究比较分析了MGF 360-9L和MGF 360家族中其他成员的基因序列，对MGF 360-9L蛋白进行了二、三级结构预测，合成了MGF 360-9L基因，构建了MGF 360-9L真核表达质粒，研究了MGF 360-9L蛋白在PK-15细胞中的亚细胞定位。本研究结果为进一步明确MGF 360-9L结构和功能的关系提供了依据，为了解ASFV致病机制积累了资料。
1 材料与方法 1.1 材料含有ASFV MGF 360-9L基因的真核表达质粒由武汉金开瑞公司合成)；含有ASFV MGF 360-9L基因的融合绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒、空载pEGFP-C1(K+)、293T细胞、PK-15细胞由本实验室保存；鼠抗GFP单抗(66002-1-Ig)、HRP标记山羊抗鼠IgG二抗(SA00001-1)均购于Proteintech公司；鼠抗β-Actin单抗购于Thermo Scientific公司(MA1-140)。
大肠杆菌Trans5α感受态细胞购自全式金公司(CD201-02)；ClonExpress II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司(C112-02)；EcoRⅠ内切酶(1040s)、BamHⅠ内切酶(1010s)、PrimeSTAR® HS (Premix)(R040A)均购自TaKaRa公司；LipofectamineTM2000转染试剂均购自Invitrogen公司(11668019)；Opti-MEM(31985070)、0.25% EDTA胰酶(25200072)和DMEM培养基(C11965500BT)均购自Gibco公司；PBS溶液(pH7.4)购自Hyclone公司(SH30256.01)；胶回收试剂盒(D2500-2)、小提质粒试剂盒(D6943-02)均购自Omega公司；激光共聚焦培养皿购自NEST公司(801001)。
1.2 方法1.2.1 MGF 360-9L基因生物信息学分析 查询并下载NCBI数据库中54株ASFV毒株基因组数据，并提取其中所有MGF 360-9L基因序列，利用DNAstar7.1、SnapGene 4.1.2、Mega 7、RasMol2.7和在线工具Swiss-Model、GOR4、cNLS Mapper、Psort等分析软件对所有MGF 360-9L基因和氨基酸序列进行多序列比对、构建基因进化树、结构同源性分析、跨膜区、NLS序列和二、三级结构预测等。
1.2.2 MGF 360-9L真核表达质粒构建 根据GenBank公布的Georgia 2007/1(FR682468.1)基因组数据，以该毒株中MGF 360-9L基因序列为参考，合成该基因并构建重组真核表达质粒pEGFP-C1(K+)-MGF 360-9L，经序列测定该基因正确插入到表达质粒中。
1.2.3 重组质粒表达验证 以1×106 293T细胞量接种到6孔板，待细胞长至80%~90%时，采用LipofectamineTM2000脂质体进行细胞转染(按说明书方法)，转染量为1 μg·孔-1(DNA:LipofectamineTM2000试剂=1 μg:2 μL)。制备细胞蛋白样品：转染24 h后，收集转染重组质粒pEGFP-C1-MGF 360-9L的细胞以及转染空载的对照细胞，加入适量的RAPI裂解液(1 mmol·L-1 PMSF)，充分裂解后，12 000 r·min-1离心10 min，收集上清，加入5×SDS Loading Buffer(β-巯基乙醇)，100 ℃煮样10 min。配制6%的浓缩胶和10%的分离胶，以鼠抗GFP单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗，进行常规的Western blot验证融合蛋白的表达。
1.2.4 亚细胞定位观察 接种PK-15细胞于激光共聚焦培养皿，采用LipofectamineTM2000脂质体转染重组质粒pEGFP-C1-MGF 360-9L 0.5μg(按说明书方法)，转染后12 h，弃上清，PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次10 min，再用预冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS(pH 7.4)洗涤3次，加入4, 6-3′-二脒基-2-苯基吲哚(4, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对细胞核染色10 min，再用PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次2 min，激光共聚焦显微镜63×油镜下观察荧光蛋白的定位情况。
2 结果 2.1 MGF 360多基因家族序列比较和分析根据NCBI在线数据库，检索ASFV病毒基因组，获得54株不同毒株，各个毒株详情见表 1。在54株ASFV毒株中MGF 360多基因家族的共有22个基因，表达22种不同蛋白。其中全部MGF 360基因包括14个左向表达(L)和8个右向表达(R)的开放阅读框，均分布在整个基因组两端的可变区内，即左侧约50 000 bp和右侧15 000 bp。
|
表 1 不同ASFV毒株MGF 360-9L基因相似性比较 Table 1 Gene homology comparison of MGF 360-9L in different ASFV strains |
目前，NCBI数据库内中国所提交的毒株有6株，均属于Ⅱ型，通过DNAstar7.1序列比对，MGF 360-9L基因在各同型毒株中高度保守，且在Ⅰ型和Ⅱ型ASFV毒株中具有约98%的相似性，这与Ⅰ型和Ⅱ型ASFV遗传进化上比较接近(图 1)相一致。
|
图 1 ASFV毒株MGF 360-9L基因系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of MGF 360-9L gene in different ASFV strains |
在Ⅱ型ASFV毒株中，MGF 360基因家族包括MGF 360-1L、2L、3L、4L、6L、8L、9L、10L、11L、12L、13L、14L、15R、16R、18R、21R，共16个成员，其中MGF 360-9L存在两种形式，一种与Georgia 2007/1毒株(FR682468.1)相同，长度为1 053 bp，另一种与Odintsovo_02/14(KP843857.1)或Poland毒株相同，长度为1 104 bp，即5′末端增加51 bp。通过比对54株ASFV中MGF 360-9L基因的序列，在3′末端的378 bp中存在较大保守性(图 2)。
|
红色区域代表同源部分，白色区域代表差异部分 The red area represent the homologous part and the white area represent the heterologous part 图 2 ASFV毒株MGF 360-9L基因序列比对 Fig. 2 Sequence Alignment of MGF 360-9L gene in different ASFV strains |
MGF 360-9L基因一级结构表明该基因全长1 053 bp，G+C含量为38.56%，A+T含量为61.44%；表达的蛋白长度为350 aa，GOR4网络对蛋白二级结构预测结果表明α螺旋占34.29%，扩展链占30.57%，无规卷曲为35.14%(图 3)。
|
图 3 GOR4软件分析并预测MGF 360-9L蛋白二级结构 Fig. 3 Analysis and prediction of secondary structure of MGF 360-9L protein |
将MGF 360-9L蛋白氨基酸序列提交在线工具Swiss-Model，使用RasMol2.7软件显示工具得到其三维结构模型，结果表明，MGF 360-9L蛋白预测的三级结构与Ankyrin-1、Ankyrin-2结构的QMQE为0.36，覆盖率71%；与Tankyrase-1结构的QMQE为0.25，覆盖率66%，且预测均具有以α螺旋为主的高级结构(图 4)。
|
A.骨架结构；B.带状结构；C.球形结构 A. Backbone structure; B. Ribbon structure; C. Spherical structure 图 4 MGF 360-9L蛋白三级结构预测(Ankyrase-1/Ankyrase-2模型) Fig. 4 Prediction of the tertiary structure of MGF 360-9L protein (Ankyrase-1/Ankyrase-2 model) |
将MGF 360-9L蛋白序列输入在线工具NLS-Mapper中，预测得到MGF 360-9L蛋白可能包括3段双分型NLS序列(无单分型NLS)，其Cut-off分数均大于3.0，详见表 2。基于PSI-BLAST数据的预测方法HSLpred和基于SVM算法的预测方法LOCSVMPSI均显示MGF 360-9L蛋白可能定位于真核细胞核内，概率分别为约53%和58.44%。
|
|
表 2 MGF 360-9L蛋白序列的双分型NLS预测 Table 2 Prediction of the bimorphic NLS of MGF 360-9L protein sequence |
以Georgia 2007/1毒株(FR682468.1)中MGF 360-9L序列信息为参照，由武汉金开瑞公司合成重组质粒。通过LipofectamineTM2000脂质体转染体系将构建的重组质粒pEGFP-C-MGF 360-9L(C端EGFP标签)真核表达质粒1 μg转染至6孔板中的293T细胞中，并设置转染空载为对照，各质粒重复2个孔。转染后24 h后，收取细胞样品，Western blot验证MGF 360-9L真核质粒的表达，以β-actin蛋白(42 ku)为内参。根据EGFP与MGF 360-9L构建蛋白融合后的目的条带大小预测为65 ku左右，与Western blot检测条带位置一致。结果表明，构建的pEGFP-C-MGF 360-9L真核质粒可以在293T细胞中正常表达(图 5)。
|
图 5 293T细胞Western blot验证MGF 360 9L-EGFP重组质粒的表达 Fig. 5 Expression verification of MGF 360-9L-EGFP recombinant plasmid by Western blot in 293T cells |
细胞转染24 h后，按方法“1.2.5”处理细胞样品，通过激光共聚焦显微镜观察可见PK-15细胞中MGF 360-9L蛋白的绿色荧光(EGFP)以定位在细胞核为主(图 6)。
|
图 6 MGF 360-9L蛋白亚细胞定位观察(PK-15细胞) Fig. 6 Observation of subcellular localization of MGF 360-9L protein (in PK-15 cells) |
ASFV基因组能够表达超过50种结构蛋白和100种非结构蛋白，在感染过程中ASFV能够快速突破天然免疫系统、逃逸获得性免疫系统，尽管能诱导淋巴细胞致敏、产生高水平的抗体，然而这些应答并不能清除血液中的病毒[21-23]，且可能存在抗体依赖增强作用，但背后机制仍不清楚。目前，无论国内还是国外的研究成果，在ASFV的致病性和商品化疫苗方面还未取得重大突破。现已知ASFV的毒力基因包括UK、DP69R、23-NL、TK和9GL等[24-27]，但之后在细胞水平的研究表明，MGF 360家族成员与MGF 505/530家族成员同样可以抑制干扰素表达，对其信号转导途径也具有抑制作用[21]。通过比较和分析NCBI数据库种54株不同ASFV中MGF 360-9L的分布情况以及MGF 360家族其他成员的基因序列，首先发现MGF 360-9L存在于所有54株ASFV中，并在同基因型中高度保守，在不同基因型中的系统进化关系与ASFV基因分型分布相一致，进一步发现MGF 360-9L基因在5′端在不同基因型ASFV中存在较大的差异，即使在Ⅱ型中也存在差异，例如POL/2015/Podlaskie毒株的5′端末端比Georgia 2007/1多51 bp，说明ASFV在进化过程中可变区的基因片段的插入和缺失导致5′端末端ATG起始密码子位置的变化，从而导致MGF 360-9L基因保守区段分布在3′端末端378 bp，可能这是ASFV在进化过程中的特点，p72和p54基因也存在相似现象。预测MGF 360-9L蛋白二、三级结构，说明该蛋白与存在于细胞核内的Ankyrin-1、Ankyrin-2蛋白具有序列的部分相似性，再通过NLS预测其入核基序，说明其主要分布在细胞核内，最后通过激光共聚焦试验，验证了上述推测。本结果为深入研究MGF 360-9L蛋白在致病中的作用以及和宿主细胞结合部位的空间构型提供了分析工具和研究机制基础，MGF 360-9L蛋白抑制宿主免疫应答的机制将是下一步研究的重点。
ASFV的两种细胞系适应株(适应Vero细胞的BA71V和适应MS细胞的MS16)均不能在猪巨噬细胞内增殖。这两种适应株上均出现左侧基因的缺失(包括MGF 110、MGF 300、MGF 360和MGF 505/530)，将MGF 360和MGF 505/530的序列补回后，重组毒株均可恢复对巨噬细胞的适应性[28]，表明MGF 360和MGF 505/530家族蛋白对ASFV的生长特性、宿主嗜性、致病性都可产生直接的影响。在细胞水平的研究表明，MGF 360家族成员A276R与MGF 505/530家族成员A528R可以抑制Ⅰ型干扰素表达，同时对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的JAK-STAT途径具有抑制作用[21]。然而，通过对基因缺失重组毒株的研究表明，单独删除一个或几个MGF 360和MGF 505/530家族基因并不能改变ASFV在巨噬细胞中的增殖，必须同时删除多个基因才能引起ASFV在巨噬细胞中增殖速度的降低甚至完全不能增殖[28]。Golding等[29]发现，缺失MGF 360和MGF 505/530中的任一基因都不影响Pr4株对干扰素的敏感性，只有缺失多个基因才会增加Pr4株对干扰素的敏感性。MGF 360-9L是MGF 360家族成员之一，前期试验结果表明，MGF 360-9L能显著抑制宿主细胞天然免疫应答，所以对该基因结构和功能的研究显得十分必要。这些研究表明这两个家族中的基因在功能上部分冗余且存在协同作用。因此，探索这两个家族蛋白的功能，揭示其如何发挥协同作用的机制都意义重大。
天然免疫是宿主抵御病原体感染和入侵的第一道防线，在宿主抗病毒反应中发挥着重要作用。而ASFV进化出多种免疫逃逸机制拮抗天然免疫以保障自身增殖[30]。ASFV主要感染髓系细胞，尤其是单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞[31-33]，导致感染后出现非常严重的免疫损伤和免疫抑制，引起家猪强烈的炎症反应[31-33]和接近100%的高死亡率[34-36]。ASFV还可感染单核细胞/巨噬细胞，限制APCs的递呈进而抑制获得性免疫应答，促进病毒的增殖[34]。在此情况下，研究和阐明ASFV编码的能够利用不同机制抑制宿主的天然免疫反应的蛋白至关重要[21]。MGF 360是ASFV多基因家族成员之一，也是ASFV致病的主要毒力基因之一，其本身含有约20个成员，缺失MGF 360后ASFV致病性大幅度降低，因此该基因家族是研究ASFV基因缺失弱毒疫苗优先敲除的基因之一[15, 37]。目前，ASFV疫苗研究的方向主要集中在重组减毒活疫苗，而筛选毒力基因是关键步骤。虽经各国科学家努力攻关，但目前仍无有效的ASF商品化疫苗，因此，急需阐明ASFV“逃逸宿主天然与获得免疫机制”的关键科学问题，明确其感染、致病和免疫机制，通过理论创新驱动安全有效的疫苗实现突破，并为国家非洲猪瘟的防控提供理论依据和技术支撑，为研制安全、有效且质量可控的ASF疫苗提供理论依据。
4 结论MGF 360能够抑制Ⅰ型干扰素表达，同时抑制干扰素的抗病毒效应，在ASFV逃避宿主免疫过程中发挥重要作用。前期试验结果表明，MGF 360-9L能显著抑制宿主细胞天然免疫应答，通过比对54株ASFV基因组，发现该基因存在于所有ASFV毒株中，在同基因型ASFV毒株中高度保守。模拟并分析MGF 360-9L蛋白二级和三级结构，获得其与核蛋白Ankyrin-1、Ankyrin-2结构相似并具有入核基序。构建并表达MGF 360-9L重组质粒，验证了该蛋白主要定位在核内，说明其抑制天然免疫信号转导的功能可能发生在核内，本论文可为深入阐明MGF 360-9L蛋白在逃逸宿主天然免疫中的机制研究提供方向。
| [1] | MONTGOMERY R E. On a form of swine fever occurring in British East Africa (Kenya colony)[J]. J Comp Pathol, 1921, 34(3): 159–191. |
| [2] | ZHOU X T, LI N, LUO Y Z, et al. Emergence of African swine fever in China, 2018[J]. Transbound Emerg Dis, 2018, 65(6): 1482–1484. DOI: 10.1111/tbed.12989 |
| [3] | GE S Q, LI J M, FAN X X, et al. Molecular characterization of African swine fever virus, China, 2018[J]. Emerg Infect Dis, 2018, 24(11): 2131–2133. DOI: 10.3201/eid2411.181274 |
| [4] | ARIAS M, JURADO C, GALLARDO C, et al. Gaps in African swine fever:analysis and priorities[J]. Transbound Emerg Dis, 2018, 65(S1): 235–247. |
| [5] | GALINDO I, ALONSO C. African swine fever virus:a review[J]. Viruses, 2017, 9(5): 103. DOI: 10.3390/v9050103 |
| [6] | TULMAN E R, DELHON G A, KU B K, et al. African swine fever virus[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2009, 328: 43–87. |
| [7] | SÁNCHEZ-CORDÓN P J, MONTOYA M, REIS A L, et al. African swine fever:a re-emerging viral disease threatening the global pig industry[J]. Vet J, 2018, 233: 41–48. DOI: 10.1016/j.tvjl.2017.12.025 |
| [8] | RODRÍGUEZ J M, SALAS M L. African swine fever virus transcription[J]. Virus Res, 2013, 173(1): 15–28. DOI: 10.1016/j.virusres.2012.09.014 |
| [9] | DIXON L K, CHAPMAN D A G, NETHERTON C L, et al. African swine fever virus replication and genomics[J]. Virus Res, 2013, 173(1): 3–14. |
| [10] | FORTH J H, TIGNON M, CAY A B, et al. Comparative analysis of whole-genome sequence of African swine fever virus Belgium 2018/1[J]. Emerg Infect Dis, 2019, 25(6): 1249–1252. DOI: 10.3201/eid2506.190286 |
| [11] | ZHANG H X, WANG Z H, ZHANG Q X, et al. Ti3C2 MXenes nanosheets catalyzed highly efficient electrogenerated chemiluminescence biosensor for the detection of exosomes[J]. Biosens Bioelectron, 2019, 124-125: 184–190. DOI: 10.1016/j.bios.2018.10.016 |
| [12] | BOSHOFF C I, BASTOS A D S, GERBER L J, et al. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973-1999)[J]. Vet Microbiol, 2007, 121(1-2): 45–55. DOI: 10.1016/j.vetmic.2006.11.007 |
| [13] | MALOGOLOVKIN A, BURMAKINA G, TITOV I, et al. Comparative analysis of African swine fever virus genotypes and serogroups[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(2): 312–315. DOI: 10.3201/eid2102.140649 |
| [14] | GALLARDO C, SOLER A, NIETO R, et al. Comparative evaluation of novel African swine fever virus (ASF) antibody detection techniques derived from specific ASF viral genotypes with the OIE internationally prescribed serological tests[J]. Vet Microbiol, 2013, 162(1): 32–43. DOI: 10.1016/j.vetmic.2012.08.011 |
| [15] | TEKLUE T, SUN Y, ABID M, et al. Current status and evolving approaches to African swine fever vaccine development[J]. Transbound Emerg Dis, 2020, 67(2): 529–542. DOI: 10.1111/tbed.13364 |
| [16] | ZSAK L, SUR J H, BURRAGE T G, et al. African swine fever virus (ASFV) multigene families 360 and 530 genes promote infected macrophage survival[J]. Sci World, 2001, 1(S3): 97S. DOI: 10.1100/tsw.2001.23.212 |
| [17] | PORTUGAL R, COELHO J, HÖPER D, et al. Related strains of African swine fever virus with different virulence:genome comparison and analysis[J]. J Gen Virol, 2015, 96(2): 408–419. DOI: 10.1099/vir.0.070508-0 |
| [18] | O'DONNELL V, HOLINKA L G, GLADUE D P, et al. African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of MGF360 and MGF505 genes is attenuated in swine and confers protection against challenge with virulent parental virus[J]. J Virol, 2015, 89(11): 6048–6056. DOI: 10.1128/JVI.00554-15 |
| [19] | O'DONNELL V, HOLINKA L G, SANFORD B, et al. African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of 9GL and MGF360/505 genes is highly attenuated in swine but does not confer protection against parental virus challenge[J]. Virus Res, 2016, 221: 8–14. DOI: 10.1016/j.virusres.2016.05.014 |
| [20] | GONZÁLEZ A, CALVO V, ALMAZÁN F, et al. Multigene families in African swine fever virus:family 360[J]. J Virol, 1990, 64(5): 2073–2081. DOI: 10.1128/JVI.64.5.2073-2081.1990 |
| [21] | CORREIA S, VENTURA S, PARKHOUSE R M. Identification and utility of innate immune system evasion mechanisms of ASFV[J]. Virus Res, 2013, 173(1): 87–100. |
| [22] | GALINDO I, ALONSO C. African swine fever virus:a review[J]. Viruses, 2017, 9(5): 103. DOI: 10.3390/v9050103 |
| [23] | CANALS A, ALONSO F, TOMILLO J, et al. Analysis of T lymphocyte subsets proliferating in response to infective and UV-inactivated African swine fever viruses[J]. Vet Microbiol, 1992, 33(1-4): 117–127. DOI: 10.1016/0378-1135(92)90040-Z |
| [24] | MOORE D M, ZSAK L, NEILAN J G, et al. The African swine fever virus thymidine kinase gene is required for efficient replication in swine macrophages and for virulence in swine[J]. J Virol, 1998, 72(12): 10310–10315. DOI: 10.1128/JVI.72.12.10310-10315.1998 |
| [25] | LEWIS T, ZSAK L, BURRAGE T G, et al. An African swine fever virus ERV1-ALR homologue, 9GL, affects virion maturation and viral growth in macrophages and viral virulence in swine[J]. J Virol, 2000, 74(3): 1275–1285. DOI: 10.1128/JVI.74.3.1275-1285.2000 |
| [26] | ZSAK L, LU Z, KUTISH G F, et al. An African swine fever virus virulence-associated gene NL-S with similarity to the herpes simplex virus ICP34. 5 gene[J]. J Virol, 1996, 70(12): 8865–8871. DOI: 10.1128/JVI.70.12.8865-8871.1996 |
| [27] | ZSAK L, CALER E, LU Z, et al. A nonessential African swine fever virus gene UK is a significant virulence determinant in domestic swine[J]. J Virol, 1998, 72(2): 1028–1035. DOI: 10.1128/JVI.72.2.1028-1035.1998 |
| [28] | ZSAK L, LU Z, BURRAGE T G, et al. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes are novel macrophage host range determinants[J]. J Virol, 2001, 75(7): 3066–3076. DOI: 10.1128/JVI.75.7.3066-3076.2001 |
| [29] | GOLDING J P, GOATLEY L, GOODBOURN S, et al. Sensitivity of African swine fever virus to type I interferon is linked to genes within multigene families 360 and 505[J]. Virology, 2016, 493: 154–161. DOI: 10.1016/j.virol.2016.03.019 |
| [30] | SALAS M L, ANDRÉS G. African swine fever virus morphogenesis[J]. Virus Res, 2013, 173(1): 29–41. |
| [31] | MALMQUIST W A, HAY D. Hemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures[J]. Am J Vet Res, 1960, 21: 104–108. |
| [32] | WARDLEY R C, WILKINSON P J. The growth of virulent African swine fever virus in pig monocytes and macrophages[J]. J Gen Virol, 1978, 38(1): 183–186. DOI: 10.1099/0022-1317-38-1-183 |
| [33] | CARRILLO C, BORCA M V, AFONSO C L, et al. Long-term persistent infection of swine monocytes/macrophages with African swine fever virus[J]. J Virol, 1994, 68(1): 580–583. DOI: 10.1128/JVI.68.1.580-583.1994 |
| [34] | TAKAMATSU H H, DENYER M S, LACASTA A, et al. Cellular immunity in ASFV responses[J]. Virus Res, 2013, 173(1): 110–121. DOI: 10.1016/j.virusres.2012.11.009 |
| [35] | MARTINS C L V, LEITĀO A C. Porcine immune responses to African swine fever virus (ASFV) infection[J]. Vet Immunol Immunopathol, 1994, 43(1-3): 99–106. DOI: 10.1016/0165-2427(94)90125-2 |
| [36] | DIXON L K, ISLAM M, NASH R, et al. African swine fever virus evasion of host defences[J]. Virus Res, 2019, 266: 25–33. DOI: 10.1016/j.virusres.2019.04.002 |
| [37] | RAMIREZ-MEDINA E, VUONO E, O'DONNELL V, et al. Differential effect of the deletion of African swine fever virus virulence-associated genes in the induction of attenuation of the highly virulent Georgia strain[J]. Viruses, 2019, 11(7): 599. DOI: 10.3390/v11070599 |