, LIANG Yu, CHE Yutong, WANG Feng, LIU Xuying, ZHAO Bishi, WANG Qiang, AN Lixia, QIAO Liying, LIU Wenzhong
绵羊是一种重要的经济家畜，能生产肉、毛、皮、乳等多种产品。就肉用性能而言，脂肪组织的含量对肉质至关重要。脂肪组织主要由成熟脂肪细胞和基质血管组分构成，其中成熟脂肪细胞在体内条件下不能分裂，主要依赖于脂肪组织中存在的前体脂肪细胞库对其进行更替。前体脂肪细胞的增殖与分化是脂肪细胞发育的两个重要生物学过程，受许多遗传和非遗传因素调控[1]。其中，microRNA(miRNA)作为一种重要的调控因子，参与前体脂肪细胞的增殖与分化[2-6]。
Krüppel样因子(Krüppel-like factors, KLFs)是一类具有锌指结构的转录因子。迄今，已经发现17个成员，分别以KLF1~KLF17命名。这些因子广泛参与细胞增殖[7]、分化[8]、凋亡[9]等的调控。在脂肪细胞分化过程中，KLF4、KLF5、KLF6、KLF15发挥促进作用，KLF2、KLF3、KLF7发挥抑制作用[10-14]。近年来，不少研究报道，该家族成员在脂肪代谢中发挥作用时受miRNA调控。例如，过表达miR-204-5p会抑制3T3-L1脂肪细胞的增殖，同时靶向KLF3促进脂肪细胞分化[15]。miR-146b通过靶向KLF7抑制人体内脏前体脂肪细胞增殖并促进其分化[16]。在人类肝癌细胞中，转染miR-128-1-5p模拟物能够降低KLF4的表达，预测并验证了miR-128-1-5p与KLF4存在靶标关系[17]，而KFL4通过调节CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer binding proteins β, C/EBPβ)的表达可促进3T3-L1前体脂肪细胞分化[18]。由此说明，miR-128-1-5p靶向KFL4调控脂肪细胞分化。然而，利用生物信息学方法预测并未发现miR-128-1-5p与KLF4存在靶标关系，而是与同家族的KLF2存在靶标关系。
在小鼠中，KLF2仅在前体脂肪细胞中表达，在成熟脂肪细胞中几乎不表达[19]。KLF2对脂肪细胞分化的抑制作用体现在两个方面：一是通过与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)[19]和C/EBPα[20]启动子上的特定位点结合，抑制其表达，从而抑制脂肪细胞分化；二是通过促进前体脂肪细胞因子(preadipocyte factor 1, PREF1)的表达，维持前体脂肪细胞形态，抑制脂肪细胞分化[21]。可见，KLF2在脂肪代谢中发挥着重要作用，但miR-128-1-5p对KLF2的调节机制尚不清楚。
本研究旨在通过理论预测与试验验证，阐明绵羊miR-128-1-5p对KLF2的调节方式，进而探索其在绵羊前体脂肪细胞增殖和分化中的作用机制，为深入理解miRNA对绵羊脂肪代谢的调控机制提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集屠宰1月龄的杜泊羔羊，用无菌剪刀、镊子采集大小适中的皮下脂肪组织块。用75%的酒精消毒后，置于装有PBS(含有1%青霉素和链霉素)的无菌离心管中，于冰盒暂存，迅速带回实验室，处理后用于细胞培养。
1.2 生物试剂PCR引物、miRNA Mimic、miRNA NC(negative control)、miRNA Inhibitor购自上海生工有限公司；DMEM/Low Glucose、DMEM/High Glucose、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Biological Industries；氯仿和异丙醇购自天津市北辰方正试剂厂；75%的酒精购自河北瑞康医药科技有限公司；Trans5α感受态细胞、T4连接酶、限制性内切酶Xho Ⅰ和Xba Ⅰ、RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒和PrimeScript®RT reagent kit反转录试剂盒均购自TaKaRa公司；Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ(50)和Plasmid Mini Kit Ⅰ(100)购自OMEGA公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)粉末、Tween-20、Ⅱ型胶原酶、牛胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、油红O干粉购自索莱宝生物科技有限公司；pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector、Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒购自Promega公司；Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；双抗(青霉素和链霉素)和胰蛋白酶购自Gibco公司；蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、硝酸纤维素膜、脱脂奶粉和SDS-PAGE凝胶制备试剂盒均购自博士德公司；KLF2抗体购自BiorByt公司；CCK-8试剂盒购自东仁化学科技有限公司；EdU试剂盒购自凯基生物技术有限公司。
1.3 细胞分离培养与诱导分化用眼科剪刀将组织块剪成小块，用Ⅱ型胶原酶对脂肪组织进行消化(37 ℃ 200 r·min-1 30 min)，用完全培养基Ⅰ(含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/Low Glucose培养基)终止消化。消化液在室温下离心(1 000 r·min-1 10 min)，用新鲜完全培养基重悬沉淀。将悬浮液分别通过75和37.5 μm孔径的尼龙网过滤。所得滤液接种在完全培养基中，在含有5% CO2的培养箱中37 ℃培养。培养基每隔2 d换1次。
使用完全培养基Ⅱ(含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/High Glucose培养基)培养HEK-293T细胞(5% CO2、37 ℃)，培养基每隔2 d换1次。
绵羊前体脂肪细胞融合度达80%~90%时，更换为分化培养基(89%DMEM、10%胎牛血清、1%双抗、250 μmol·L-1 IBMX、500 μmol·L-1 DEX、8 μmol·L-1胰岛素)继续培养。
1.4 靶标关系的预测与验证1.4.1 靶标关系的预测 序列相似性分析表明，miR-128-1-5p成熟体序列在人、小鼠、牛、绵羊等物种中高度保守。因此，使用TargetScan 7.2软件(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测与miR-128-1-5p具有靶标关系的基因，查阅文献选择在脂肪分化过程中发挥作用的KLF2作为靶基因。
1.4.2 引物设计与合成 根据NCBI核酸数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)公布的绵羊KLF2序列(登录号：XM_015095770.2)，利用Primer 6.0设计KLF2 3′-UTR-wt(野生型)、KLF2 3′-UTR-mut(突变型)PCR引物。引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列见表 1。
|
表 1 野生型和突变型载体PCR引物序列 Table 1 The primer sequences of wild- and mutant-type vectors for PCR |
1.4.3 KLF2 3′-UTR野生型载体和突变型载体构建 根据表 1引物序列，利用PCR分别扩增KLF2 3′-UTR野生型(3′-UTR-wt)和突变型(3′-UTR-mut)片段。体系为：10 μL的2×Taq master mix，6 μL的ddH2O，上、下游引物各1 μL，2 μL的cDNA。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)30个循环，72 ℃ 3 min。PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯照射找出目的片段，割胶回收并纯化目的片段。
将纯化后的两种PCR产物和pmirGLO载体通过限制性内切酶Xho Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切并进行连接。体系为：3 μL的pmirGLO，5 μL的DNA目的片段，1 μL的T4连接酶，1 μL的T4连接酶Buffer。过夜连接后，将产物转化至感受态细胞中，均匀涂抹于添加有Ampicillin的LB固体培养基上，37 ℃恒温培养箱过夜。挑取单个菌落于LB液体培养基中摇菌，菌液送公司测序。将测序鉴定成功的两种载体分别命名为pmir-KLF2-3′-UTR-wt和pmir-KLF2-3′- UTR-mut。
1.4.4 双荧光报告系统检测 将HEK-293T细胞接种于24孔培养板中。待细胞融合度达到70%时，利用Lipofectamine 3000对细胞进行转染。试验分为3组，每组设置3个重复。分别共转染pmir-KLF2-3′-UTR-wt和miR-128-1-5p mimic(野生型组)、pmir-KLF2-3′-UTR-mut和miR-128-1-5p mimic(突变型组)以及pmir-KLF2-3′-UTR-wt和miR-128-1-5p mimic NC(阴性对照组)。转染48 h后利用Dual-Luciferase Reporter Assay System分别检测荧光活性。
1.5 miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖影响的检测1.5.1 增殖标志基因表达的检测 转染miR-128-1-5p mimic和NC并收集培养48 h的细胞。根据RNAiso Plus试剂说明书，提取细胞总RNA，用NanoDrop核酸蛋白测定仪检测其浓度和纯度。用反转录试剂盒获得cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒和CFX96荧光定量仪检测增殖标志基因的表达量。18S rRNA作为内参基因。PCR反应体系：10 μL SBYR Premix Ex Taq，上、下游引物各1 μL，2 μL cDNA，6 μL ddH2O。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min) 39个循环，72 ℃ 3 min。增殖标志基因和18S rRNA的引物序列见表 2。
|
|
表 2 增殖标志基因qPCR引物序列 Table 2 The primer sequences of proliferation marker genes for qPCR |
1.5.2 绵羊前体脂肪细胞增殖情况的检测 将处于对数生长期的绵羊前体脂肪细胞均匀接种到96孔板中。当培养细胞融合度为70%时，分别用miR-128-1-5p mimic和NC转染。每组6个重复。转染后0、12、24、36、48、72 h分别取出一个96孔板。每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后使用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光度值(OD)，并绘制细胞增殖曲线。吸光度反映细胞活力(OD值越高，活细胞数越多)。剩余细胞转染后继续培养24 h，使用50 μmol·L-1的EdU培养基孵育细胞2 h。4%多聚甲醛固定后，按照EdU检测试剂盒操作，检测被标记的新生细胞，用荧光倒置显微镜观察并采集图片。
1.6 miR-128-1-5p和KLF2在脂肪细胞分化过程中的表达检测分别收集绵羊前体脂肪细胞分化0、2、4、6、8、10、12 d的细胞，提取总RNA和总蛋白。qPCR检测miR-128-1-5p和KLF2 mRNA的表达，Western blotting检测KLF2蛋白的表达。根据miRNABase(http://www.mirbase.org/)公布的绵羊miR-128-1-5p成熟序列，设计反转录及荧光定量PCR引物。18S rRNA和U6分别作为检测KLF2和miR-128-1-5p表达的内参基因。引物序列见表 3(其中18S rRNA引物序列见表 2)
|
|
表 3 KLF2和miR-128-1-5p的qPCR引物序列 Table 3 The primer sequences of KLF2 and miR-128-1-5p for qPCR |
1.7.1 miR-128-1-5p转染绵羊前体脂肪细胞 用Lipofectamine 3000对绵羊前体脂肪细胞进行转染。试验分为4组，每组设置3个重复。分别转染miR-128-1-5p mimic(过表达组)、miR-128-1-5p NC(过表达阴性对照组)、miR-128-1-5p inhibitor(抑制表达组)和miR-128-1-5p inhibitor NC(抑制表达阴性对照组)。
1.7.2 绵羊miR-128-1-5p和成脂分化标志基因的表达检测 收集转染并诱导分化12 d后的绵羊脂肪细胞，提取细胞总RNA。反转录获得mRNA和miRNA的cDNA。对miR-128-1-5p和成脂分化标志基因进行qPCR检测。以18S rRNA和U6分别作为检测基因和miRNA的表达的内参基因。成脂分化标志基因引物序列见表 4(其中18S rRNA引物序列见表 2，U6引物序列见表 3)。
|
|
表 4 成脂分化标志基因qPCR引物序列 Table 4 The primer sequences of marker genes for adipogenic differentiation for qPCR |
1.7.3 绵羊脂肪细胞中总蛋白的提取与KLF2蛋白表达检测 收集转染并诱导分化12 d后的绵羊脂肪细胞。将提取的蛋白与蛋白上样缓冲液(变性)以4:1的比例混合，100 ℃变性10 min。然后，以80 V 30 min，120 V 90 min进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，150 V冰浴中转膜90 min。脱脂奶粉封闭1 h，一抗稀释液稀释1 000倍的KLF2一抗(兔源)过夜孵育。PBST冲洗3次，每次5 min。二抗稀释液稀释10 000倍的荧光二抗(兔源)避光孵育1 h，PBST冲洗3次，每次5 min。
1.7.4 油红O染色 将0.5 g油红O干粉溶于异丙醇中，过滤后与ddH2O以3:2的比例配置成油红O工作液。在分化后的细胞中加入4%多聚甲醛过夜固定。PBS清洗残留多聚甲醛后，加入60%的异丙醇浸洗5 min。加入油红O工作液染色60 min，弃去油红O工作液，PBS清洗3次后，使用60%的异丙醇漂洗5 s。显微镜下观察并采集图片。
1.8 数据处理与分析qPCR数据使用2-△△Ct方法计算相对表达量。双荧光报告试验中，以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值作为相对荧光活性。用Image-Pro Plus软件处理免疫印迹条带图，分析灰度值。以上数据均使用t-检验进行显著性分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著，用GraphPad Prism 7.0绘制柱状图。
2 结果 2.1 绵羊miR-128-1-5p与KLF2的靶标关系预测得到KLF2-3′-UTR第59~65个碱基(CGGCCCC)处与miR-128-1-5p种子区(GGGGCCG)完全互补(图 1)。推测miR-128-1-5p与KLF2-3′-UTR具有靶标关系。
|
图 1 miR-128-1-5p与KLF2的结合位点 Fig. 1 Binding site of miR-128-1-5p and KLF2 |
双荧光报告系统检测结果表明(图 2)，野生型组(0.47)较阴性对照组(1.23)荧光活性显著降低(P < 0.05)，说明miR-128-1-5p与KLF2-3′-UTR结合降低荧光活性，二者具有靶标关系。而突变型组(1.12)与阴性对照组(1.23)的荧光活性差异不显著(P>0.05)，表明该结合位点突变后，二者靶标关系消失。综上，KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。
|
Mimic+wt.野生型组; Mimic+mut.突变型组; Mimic NC+ wt.阴性对照组。*.差异显著(P < 0.05); **.差异极显著(P < 0.01)；下同 Mimic+wt. Wild-type group; Mimic+mut. Mutant-type group; Mimic NC+wt. Negative control group. *. Significant difference(P < 0.05); **. Extremely significant difference(P < 0.01); The same as below 图 2 双荧光素酶报告检测结果 Fig. 2 Results of dual luciferase reporter assay |
qPCR结果表明(图 3)，过表达miR-128-1-5p后，增殖标志基因Cyclin D、Cyclin E和PCNA的mRNA表达量较阴性对照组显著降低(P < 0.05)，Cyclin B mRNA的表达量极显著降低(P < 0.01)。说明miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞增殖。
|
Mimic.过表达miR-128-1-5p组; NC.阴性对照组。下同 Mimic. Overexpressing miR-128-1-5p group; NC.Negative control group. The same as below 图 3 miR-128-1-5p过表达对绵羊前体脂肪细胞增殖标志基因mRNA表达的影响 Fig. 3 Effect of miR-128-1-5p overexpression on the mRNA expression of proliferation marker genes in ovine preadipocytes |
吸光度检测结果如图 4所示。与阴性对照组相比，过表达miR-128-1-5p组的细胞在培养12 h后吸光度开始降低，在3个时间点降低程度达显著(P < 0.05，36和72 h)和极显著(P < 0.01，48 h)水平。说明，miR-128-1-5p的调节作用能够降低绵羊前体脂肪细胞活力。
|
图 4 过表达miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞活力的影响 Fig. 4 Effect of miR-128-1-5p overexpression on the vitality of ovine preadipocytes |
图 5A给出的是用DAPI和EdU两种染料分别对总细胞和新生细胞进行染色的结果，其中Merge为包含新生细胞的总细胞。图 5B从定量角度反映染色细胞数目。可见，经DAPI染色的过表达组和阴性对照组细胞总数大致相同，而经EdU染色的过表达组新生细胞数较阴性对照组显著降低(P < 0.05)。表明，miR-128-1-5p能够抑制新生细胞的形成。
|
A.过表达miR-128-1-5p后细胞染色结果; B.过表达miR-128-1-5p后细胞数目统计结果。DAPI.细胞核染色; EdU.标记的新生细胞; Merge.合并结果 A. Cell staining results after overexpressing miR-128-1-5p; B. Statistical results of cell number after overexpressing miR-128-1-5p. DAPI. Nuclear staining; EdU. Labeled newborn cells; Merge. Combined staining result 图 5 过表达miR-128-1-5p后标记的新生细胞 Fig. 5 Labeled newborn cells after overexpressing miR-128-1-5p |
结合图 3~图 5对增殖标志基因表达、细胞活力和新生细胞数的检测结果，表明miR-128-1-5p在绵羊前体脂肪细胞增殖过程中发挥抑制作用。
2.3 绵羊前体脂肪细胞分化过程中miR-128-1-5p和KLF2的表达趋势图 6给出的是前体脂肪细胞分化过程中miR-128-1-5p以及KLF2 mRNA和蛋白的表达趋势。可见，随着分化进展，miR-128-1-5p的表达总体呈上升趋势，在12 d时达到最高值。KLF2 mRNA的表达呈下降趋势，在12 d时达到最低值。KLF2蛋白表达趋势与其mRNA一致，第4 ~12天其蛋白表达量显著低于(P < 0.05)第0天。说明miR-128-1-5p与KLF2的表达存在负相关关系。
|
图 6 miR-128-1-5p和KLF2在绵羊前体脂肪细胞分化过程中的表达趋势 Fig. 6 Expression trends of miR-128-1-5p and KLF2 during the differentiation of ovine preadipocytes |
通过转染miR-128-1-5p mimic和inhibitor，实现miR-128-1-5p在绵羊前体脂肪细胞中的过表达和抑制。过表达组miR-128-1-5p的表达量(7.97)极显著高于阴性对照组(1.02，P < 0.01)，而抑制表达组的表达量(0.48)则显著低于阴性对照组(1.02，P < 0.05)。表明过表达或抑制miR-128-1-5p成功。过表达miR-128-1-5p后，KLF2 mRNA的表达量(0.28)极显著低于阴性对照组(1.13，P < 0.01)；抑制miR-128-1-5p后，KLF2 mRNA的表达量(1.50)显著高于阴性对照组(1.13，P < 0.05，图 7A)。
|
A.过表达或抑制miR-128-1-5p后miR-128-1-5p和KLF2 mRNA的相对表达; B.过表达或抑制miR-128-1-5p后KLF2蛋白的表达。Inhibitor.抑制表达miR-128-1-5p；Mimic NC. Mimic阴性对照组；Inhibitor NC.Inhibitor阴性对照组。下同 A. Relative expression of miR-128-1-5p and KLF2 mRNA after overexpressing or interfering miR-128-1-5p; B. Expression of KLF2 protein after overexpressing or interfering miR-128-1-5p. Inhibitor. Interfering miR-128-1-5p expression group; Mimic NC. Mimic negative control group; Inhibitor NC. Inhibitor negative control group. The same as below 图 7 过表达或抑制miR-128-1-5p后miR-128-1-5p和KLF2的表达 Fig. 7 Expression of miR-128-1-5p and KLF2 after overexpressing or interfering miR-128-1-5p |
图 7B给出的是过表达或抑制miR-128-1-5p后，KLF2蛋白的表达情况。上图是KLF2蛋白免疫印迹条带，下方是灰度值分析。可见，过表达组KLF2蛋白表达量(47.84)显著低于阴性对照组(108.69，P < 0.05)；抑制表达组结果则与之相反。
由此说明，过表达miR-128-1-5p下调KLF2 mRNA表达量的同时，也降低了KLF2蛋白的表达。表明miR-128-1-5p负调控KLF2的表达。
2.5 miR-128-1-5p调节绵羊前体脂肪细胞分化的效果分化12 d后，成脂分化标志基因的表达结果见图 8。过表达miR-128-1-5p，显著提高了C/EBPα和FABP4的mRNA表达量(P < 0.05)，极显著提高了PPARγ和Adiponectin的mRNA表达量(P < 0.01)。抑制miR-128-1-5p的表达，则结果与之相反。miR-128-1-5p促进成脂分化标志基因的表达，说明miR-128-1-5p促进绵羊前体脂肪细胞分化。
|
图 8 过表达或抑制miR-128-1-5p后成脂标志基因的相对表达 Fig. 8 Relative expression of adipogenic differentiation marker genes after overexpressing or interfering miR-128-1-5p |
分化12 d后，用油红O染色发现，过表达miR-128-1-5p的细胞较其对照组产生更多的脂滴；而抑制miR-128-1-5p则脂滴较少(图 9)。表明miR-128-1-5p促进脂滴沉积。
|
图 9 过表达或抑制miR-128-1-5p后脂肪细胞油红O染色结果 Fig. 9 The Oil Red O staining results of adipocytes after overexpressing or interfering miR-128-1-5p |
目前，miRNAs对靶基因调控作用的研究多采用生物信息学理论预测与双荧光报告检测相结合的方式[22]。Yao等[17]通过两个生物信息学软件预测出miR-128-1-5p与KLF4存在理论结合位点，并利用构建的KLF4-3′-UTR双荧光报告载体验证了二者的靶标关系。本研究利用相同的生物信息学方法在绵羊中预测与miR-128-1-5p具有靶标关系的基因，以及反向预测调控KLF4的miRNAs，并未发现miR-128-1-5p与KLF4存在靶标关系。这可能是由于基因在不同物种和不同组织中的差异表达导致的。此外，本研究预测发现，miR-128-1-5p与KLF2和KLF15均存在结合位点，并通过双荧光检测验证了miR-128-1-5p与KLF2的靶标关系。miR-128-1-5p是否靶向KLF15调节绵羊脂肪代谢，有待进一步研究。
关于miRNAs对细胞增殖过程的调控研究，多采用增殖标志基因PCNA、Cyclin B、Cyclin D和Cyclin E的表达量反映细胞增殖情况[23-26]。成脂分化标志基因PPARγ、C/EBPα、Adiponectin和FABP4的表达差异则反映细胞分化的程度[27-30]。本研究通过在绵羊前体脂肪细胞中转染miR-128-1-5p，发现miR-128-1-5p下调增殖标志基因mRNA的表达，上调成脂分化标志基因mRNA的表达。由此说明，miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖，但促进其分化。CCK-8和EdU检测以及油红O染色结果进一步映证了上述结论。关于miRNA抑制前体脂肪细胞增殖、促进分化的研究已有报道。如miR-26a-5p[31]、miR-186-5p[32]和miR-196a-5p[33]显著降低3T3-L1前体脂肪细胞的活力，抑制前体脂肪细胞增殖，促进成脂分化。也有研究表明，miRNA促进细胞的增殖而抑制其分化，如miR-127靶向丝裂原活化蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4, MAPK4)和同源框蛋白C6(homeobox C6, HOXC6)激活前体脂肪细胞增殖；但在分化过程中，miR-127靶向HOXC6抑制脂肪形成[34]。这些研究结果说明，miRNAs在前体脂肪细胞增殖和分化过程中是一个重要的调控因子，在两个生物学过程中的作用往往是相反的。
多数研究表明，miRNA通过与其靶基因结合，在转录和翻译两个水平上发挥抑制作用[35-36]。本研究结果表明，miR-128-1-5p也在两个水平上调节KLF2的表达。但是，也有文献报道miRNAs只在转录或翻译水平发挥调节作用。如在巨噬细胞的研究中发现，miR-let-7e增强了Toll样受体4(Toll-like receptors 4, TLR4)mRNA的表达，而在蛋白水平无明显影响[37]。在肾小管上皮细胞中过表达miR-384-5p，不影响骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7, BMP7)mRNA的表达，但能明显降低肾组织BMP7蛋白的表达[38]。miR-489-3p能够降低脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白的表达，而对BDNF的mRNA表达无明显影响[39]。
对猪去分化脂肪细胞(DFAT)再分化过程的研究发现，KLF2 mRNA的表达随分化时间逐渐降低[40]。此外，对3T3-L1脂肪细胞分化过程的研究发现，KLF2在前体脂肪细胞中表达，在成熟脂肪细胞中几乎不表达，其表达具有严格的时间特异性[19]。本研究发现，KLF2 mRNA和蛋白在绵羊脂肪细胞中具有相同的表达趋势，这一趋势也反映出KLF2在脂肪分化过程中的时间特异性。并通过具体的调节机制揭示，这种表达差异是由于miRNA调控导致的。
KLF2是脂肪细胞分化的一个负调控因子，通过调节脂肪细胞分化过程中的一些关键基因发挥作用。如在鸡脂肪组织的研究中发现，KLF2抑制PPARγ和C/EBPα的启动子活性，从而抑制脂肪细胞分化[20]。在3T3-L1脂肪细胞中瞬时转染KLF2发现，其表达产物通过与PPARγ启动子上的特定位点结合，下调PPARγ表达，抑制脂肪细胞分化[19]。此外，KLF2除了抑制分化标志基因的表达，还可以通过维持前体脂肪细胞形态来抑制前体脂肪细胞分化[21]。本研究预测并验证KLF2为miR-128-1-5p的靶基因。miR-128-1-5p靶向抑制KLF2的表达，上调成脂分化标志基因PPARγ和C/EBPα的表达，促进脂肪细胞分化。
4 结论经预测和验证，miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞增殖。在分化过程中miR-128-1-5p与 KLF2的表达呈负相关，miR-128-1-5p靶向KLF2促进绵羊前体脂肪细胞的分化和脂滴沉积。
| [1] | HEPLER C, VISHVANATH L, GUPTA R K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease[J]. Genes Dev, 2017, 31(2): 127–140. DOI: 10.1101/gad.293704.116 |
| [2] | HUANG K L, SHI X E, WANG J, et al. Upregulated microrna-106a promotes porcine preadipocyte proliferation and differentiation by targeting different genes[J]. Genes (Basel), 2019, 10(10): 805. DOI: 10.3390/genes10100805 |
| [3] | FAN Y, GAN M L, TAN Y, et al. Mir-152 regulates 3T3-L1 preadipocyte proliferation and differentiation[J]. Molecules, 2019, 24(18): 3379. DOI: 10.3390/molecules24183379 |
| [4] | ACHARYA A, BERRY D C, ZHANG H, et al. miR-26 suppresses adipocyte progenitor differentiation and fat production by targeting Fbxl19[J]. Genes Dev, 2019, 33(19-20): 1367–1380. DOI: 10.1101/gad.328955.119 |
| [5] | LI X Z, BALLANTYNE L L, YU Y, et al. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling[J]. FASEB J, 2019, 33(11): 12704–12722. DOI: 10.1096/fj.201901548R |
| [6] | CHEN T B, ZHANG Y, LIU Y L, et al. MiR-27a promotes insulin resistance and mediates glucose metabolism by targeting PPAR-γ-mediated PI3K/AKT signaling[J]. Aging (Albany NY), 2019, 11(18): 7510–7524. |
| [7] | DENIS J F, DIAGBOUGA M R, MOLICA F, et al. KLF4-induced connexin40 expression contributes to arterial endothelial quiescence[J]. Front Physiol, 2019, 10: 80. DOI: 10.3389/fphys.2019.00080 |
| [8] | LIU Y, PENG W Q, GUO Y Y, et al. Krüppel-like factor 10 (KLF10) is transactivated by the transcription factor C/EBPβ and involved in early 3T3-L1 preadipocyte differentiation[J]. J Biol Chem, 2018, 293(36): 14012–14021. DOI: 10.1074/jbc.RA118.004401 |
| [9] | JI Q, LI Y, ZHAO Q, et al. KLF11 promotes gastric cancer invasion and migration by increasing Twist1 expression[J]. Neoplasma, 2019, 66(1): 92–100. DOI: 10.4149/neo_2018_180325N201 |
| [10] |
张志威, 李辉, 王宁. KLF转录因子家族与脂肪细胞分化[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2009, 25(11): 983–990.
ZHANG Z W, LI H, WANG N. Kruppel-like factors (KLFs) and adipocyte differentiation[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 25(11): 983–990. (in Chinese) |
| [11] | SHAO M, GE G Z, LIU W J, et al. Characterization and phylogenetic analysis of Krüppel-like transcription factor (KLF) gene family in tree shrews (Tupaia belangeri chinensis)[J]. Oncotarget, 2017, 8(10): 16325–16339. DOI: 10.18632/oncotarget.13883 |
| [12] | JANG M K, LEE S, JUNG M H. RNA-seq analysis reveals a negative role of KLF16 in adipogenesis[J]. PLoS One, 2016, 11(9): e0162238. DOI: 10.1371/journal.pone.0162238 |
| [13] | ENOMOTO T, OHASHI K, SHIBATA R, et al. Transcriptional regulation of an insulin-sensitizing adipokine adipolin/CTRP12 in adipocytes by Krüppel-like factor 15[J]. PLoS One, 2013, 8(12): e83183. DOI: 10.1371/journal.pone.0083183 |
| [14] | MATSUBARA Y, AOKI M, ENDO T, et al. Characterization of the expression profiles of adipogenesis-related factors, ZNF423, KLFs and FGF10, during preadipocyte differentiation and abdominal adipose tissue development in chickens[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2013, 165(3): 189–195. DOI: 10.1016/j.cbpb.2013.04.002 |
| [15] | DU J J, ZHANG P W, GAN M L, et al. MicroRNA-204-5p regulates 3T3-L1 preadipocyte proliferation, apoptosis and differentiation[J]. Gene, 2018, 668: 1–7. DOI: 10.1016/j.gene.2018.05.036 |
| [16] | CHEN L, DAI Y M, JI C B, et al. MiR-146b is a regulator of human visceral preadipocyte proliferation and differentiation and its expression is altered in human obesity[J]. Mol Cell Endocrinol, 2014, 393(1-2): 65–74. DOI: 10.1016/j.mce.2014.05.022 |
| [17] | YAO S S, TIAN C, DING Y C, et al. Down-regulation of Krüppel-like factor-4 by microRNA-135a-5p promotes proliferation and metastasis in hepatocellular carcinoma by transforming growth factor-β1[J]. Oncotarget, 2016, 7(27): 42566–42578. |
| [18] | PARK Y K, WANG L M, GIAMPIETRO A, et al. Distinct roles of transcription factors KLF4, Krox20, and peroxisome proliferator-activated receptor γ in adipogenesis[J]. Mol Cell Biol, 2017, 37(2). DOI: 10.1128/MCB.00554-16 |
| [19] | BANERJEE S S, FEINBERG M W, WATANABE M, et al. The Krüppel-like factor KLF2 inhibits peroxisome proliferator-activated receptor-γ expression and adipogenesis[J]. J Biol Chem, 2003, 278(4): 2581–2584. DOI: 10.1074/jbc.M210859200 |
| [20] | ZHANG Z W, RONG E G, SHI M X, et al. Expression and functional analysis of Krüppel-like factor 2 in chicken adipose tissue[J]. J Anim Sci, 2014, 92(11): 4797–4805. DOI: 10.2527/jas.2014-7997 |
| [21] | WU J H, SRINIVASAN S V, NEUMANN J C, et al. The KLF2 transcription factor does not affect the formation of preadipocytes but inhibits their differentiation into adipocytes[J]. Biochemistry, 2005, 44(33): 11098–11105. DOI: 10.1021/bi050166i |
| [22] | PAN Y, JING J, QIAO L, et al. MiRNA-seq reveals that miR-124-3p inhibits adipogenic differentiation of the stromal vascular fraction in sheep via targeting C/EBPα[J]. Domest Anim Endocrinol, 2018, 65: 17–23. DOI: 10.1016/j.domaniend.2018.05.002 |
| [23] | MOLDOVAN G L, PFANDER B, JENTSCH S. PCNA, the maestro of the replication fork[J]. Cell, 2007, 129(4): 665–679. DOI: 10.1016/j.cell.2007.05.003 |
| [24] | XIE B W, WANG S Y, JIANG N, et al. Cyclin B1/CDK1-regulated mitochondrial bioenergetics in cell cycle progression and tumor resistance[J]. Cancer Lett, 2019, 443: 56–66. DOI: 10.1016/j.canlet.2018.11.019 |
| [25] | STACEY D W. Cyclin D1 serves as a cell cycle regulatory switch in actively proliferating cells[J]. Curr Opin Cell Biol, 2003, 15(2): 158–163. DOI: 10.1016/S0955-0674(03)00008-5 |
| [26] | KOZAR K, SICINSKI P. Cell cycle progression without cyclin D-CDK4 and cyclin D-CDK6 complexes[J]. Cell Cycle, 2005, 4(3): 388–391. DOI: 10.4161/cc.4.3.1551 |
| [27] | PU Y, VEIGA-LOPEZ A. PPARγ agonist through the terminal differentiation phase is essential for adipogenic differentiation of fetal ovine preadipocytes[J]. Cell Mol Biol Lett, 2017, 22: 6. DOI: 10.1186/s11658-017-0037-1 |
| [28] | CHOI S K, PARK S, JANG S B, et al. Cascade regulation of PPARγ(2) and C/EBPα signaling pathways by celastrol impairs adipocyte differentiation and stimulates lipolysis in 3T3-L1 adipocytes[J]. Metabolism, 2016, 65(5): 646–654. DOI: 10.1016/j.metabol.2016.01.009 |
| [29] | LARA-CASTRO C, FU Y C, CHUNG B H, et al. Adiponectin and the metabolic syndrome:mechanisms mediating risk for metabolic and cardiovascular disease[J]. Curr Opin Lipidol, 2007, 18(3): 263–270. DOI: 10.1097/MOL.0b013e32814a645f |
| [30] | SMATHERS R L, PETERSEN D R. The human fatty acid-binding protein family:evolutionary divergences and functions[J]. Hum Genomics, 2011, 5(3): 170–191. DOI: 10.1186/1479-7364-5-3-170 |
| [31] |
耿红瑞, 何卉, 谭晓彤, 等. miR-26a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响[J]. 中国兽医学报, 2018, 38(10): 1962–1967, 1981.
GENG H R, HE H, TAN X T, et al. Effects of miR-26a-5p on proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocyte[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2018, 38(10): 1962–1967, 1981. (in Chinese) |
| [32] |
辜浩, 郭鑫宇, 堵晶晶, 等.MiR-186-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响研究[J].中国生物工程杂志: 1-16[2019-11-17].
GU H, GUO X Y, DU J J, et al.The effect of miR-186-5p on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocyte[J].China Biotechnology: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.4816.Q.20190828.1450.002.html. (in Chinese) |
| [33] |
杨琼, 王灵慧, 辜浩, 等. miR-196a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响效应[J]. 中国生物工程杂志, 2018, 38(11): 9–17.
YANG Q, WANG L H, GU H, et al. The effect of miR-196a-5p on proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocyte[J]. China Biotechnology, 2018, 38(11): 9–17. (in Chinese) |
| [34] | GAO Y, WANG Y Q, CHEN X C, et al. MiR-127 attenuates adipogenesis by targeting MAPK4 and HOXC6 in porcine adipocytes[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(12): 21838–21850. DOI: 10.1002/jcp.28660 |
| [35] | PAN Y Y, JING J J, QIAO L Y, et al. miR-124-3p affects the formation of intramuscular fat through alterations in branched chain amino acid consumption in sheep[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 495(2): 1769–1774. DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.12.046 |
| [36] |
王书芳, 潘洋洋, 任端阳, 等. miR-200c和miR-429靶向调节绵羊皮下脂肪细胞中SCD1表达的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(7): 1347–1357.
WANG S F, PAN Y Y, REN D Y, et al. Regulation of SCD1 gene expression by miR-200c and miR-429 in ovine subcutaneous adipocytes[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(7): 1347–1357. (in Chinese) |
| [37] | ANDROULIDAKI A, ILIOPOULOS D, ARRANZ A, et al. The kinase Akt1 controls macrophage response to lipopolysaccharide by regulating microRNAs[J]. Immunity, 2009, 31(2): 220–231. DOI: 10.1016/j.immuni.2009.06.024 |
| [38] |
张文静, 孙吉平, 吕佳, 等. miR-384-5p通过阻断BMP7转录后调控促进肾纤维化[J]. 西安交通大学学报:医学版, 2019, 40(6): 900–905.
ZHANG W J, SUN J P, LV J, et al. miR-384-5p promotes renal fibrosis through blocking post-transcriptional regulation of BMP7[J]. Journal of Xi'an Jiaotong University:Medical Sciences, 2019, 40(6): 900–905. (in Chinese) |
| [39] |
刘得水, 吴雪, 李丽波, 等. miR-489-3p靶向负调控BDNF并抑制PC12细胞增殖[J]. 中国病理生理杂志, 2019, 35(7): 1213–1218.
LIU D S, WU X, LI L B, et al. miR-489-3p negatively regulates BDNF expression and inhibits PC12 cell proliferation[J]. Chinese Journal of Pathophysiology, 2019, 35(7): 1213–1218. DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2019.07.010 (in Chinese) |
| [40] |
高霞, 李方正, 郇延军, 等. 猪DFAT细胞成脂再分化过程中KLF2和PPARγ的表达[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(1): 68–74.
GAO X, LI F Z, HUAN Y J, et al. The expression patterns of KLF2 and PPARγ during the adipogenic redifferentiation of porcine DFAT cell[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(1): 68–74. (in Chinese) |