, HAO Junhong, ZHANG Dajun, SHEN Chaochao, XU Guowei, HOU Jing, ZHANG Keshan
, ZHENG Haixue, LIU Xiangtao
CRISPR/Cas9技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas获得性免疫系统，后经人工改造逐渐发展起来[1-2]。细菌在CRISPR和Cas9的帮助下，可以经由小RNA分子的引导，靶标和沉默入侵者遗传信息的关键部分。CRISPR/Cas9基因组编辑技术是通过一段gRNA特异性识别靶基因序列，并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA，随后，细胞的非同源末端连接修复机制(NhEJ)重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变[3-4]。与锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZNFs)、转录激活物样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALENs)基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用于各物种中，是目前使用最广泛的基因编辑技术[5]。
天然免疫系统是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线[6]，机体通过自身的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)感知病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)识别入侵的病原体[7-8]，迅速激活下游一系列信号转导，诱导干扰素等诸多抗病毒细胞因子产生，在保护宿主免受病原体入侵方面发挥着重要作用[9]。肿瘤进展位点2(tumor progression locus 2，TPL2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也被称为MAP3K8或COT[10]，由氨基末端(N-terminus，简称N-末端)、激酶结构域和羧基末端(C-terminus，简称C-末端)三部分组成[11]。研究表明TLR、TNFR和IL1R等多种受体受到刺激后，能够通过TPL2介导的信号转导调控下游ERK、JNK、p38和NF-κB等多种信号蛋白的激活[11-14]。活化的TPL2能够刺激巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞等多种先天性免疫细胞产生Ⅰ型干扰素、肿瘤坏死因子等大量细胞因子[14-16]。除此之外，TPL2在调节CD4+T细胞分化产生不同Th细胞谱系的过程中也是必不可少的[17-18]。由此可见TPL2是炎症、肿瘤等过程的重要参与者，在天然免疫和获得性免疫过程中都发挥着重要的作用。过去TPL2的研究主要集中在抵抗细菌或寄生虫方面，缺乏病毒病原体方面的研究。近几年研究发现，TPL2在抗病毒天然免疫方面也发挥着重要作用。在流感病毒感染期间，TPL2通过促进抗病毒Ⅰ型干扰素产生和诱导抗原特异性CD8+T细胞应答来限制流感病毒复制[16]；在TPL2缺陷小鼠的胚胎成纤维细胞中水泡性口炎病毒(VSV)的病毒滴度和糖蛋白水平都显著增加[19]。
口蹄疫病毒(FMDV)是一种小RNA病毒，在牛、猪和各种偶蹄动物中引起口蹄疫(FMD)[20-21]。目前有7种已知的口蹄疫血清型(A、O、ASIA1、C、SAT1、SAT2和SAT3)存在，并且存在多种亚型[22-23]。塞内卡病毒(SVA)与FMDV同属于小RNA家族中的成员，其特点是传播快、流行广、死亡率高[24]。FMDV和SVA具有相似的临床症状，二者均可感染多种家畜及野生动物，其中猪是主要的感染源。仔猪感染后在猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡，对我国的养猪业造成了巨大的经济损失[25-26]。目前疫苗免疫是防控这两种疾病的关键技术手段。
通过前期TPL2的过表达和干扰试验发现，在PK-15细胞中TPL2在感染期间能够显著抑制FMDV的复制。为了进一步研究TPL2在病毒感染的PK-15细胞中的作用及发挥作用的方式，提高单位PK-15细胞中的病毒含量，本文利用CRISPR/Cas9技术构建TPL2慢病毒敲除载体并进行病毒包装，成功构建TPL2基因敲除的PK-15细胞系PK-15-TPL2－/－。通过IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50等试验验证敲除TPL2对FMDV和SVA复制的影响，并进一步探索产生这种影响的原因，以期为疫苗生产过程中提升FMDV和SVA产量指明方向，并为进一步研究TPL2在PK-15细胞中抑制FMDV和SVA的分子机制提供了良好的生物材料。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞与病毒PK-15细胞购自中国科学院昆明动物研究所。口蹄疫毒株A/GDMM/ChA/2013、猪塞内卡病毒(Seneca Valley virus，SVA)毒株由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队保存。
1.1.2 试剂和抗体0.25%EDTA-Trypsin、Opti-MEM、DMEM培养基及胎牛血清均购自Gibco公司；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、5×First buffer、0.1 mol·L-1 DTT和反转录酶M-MLV均购自Life Invitrogen公司；磷酸盐缓冲液(PBS溶液pH7.4，0.006 7 mol·L-1)购自hyclone公司；RAPI细胞裂解液和PMSF均购自碧云天公司；蛋白质Marker购自Thermo Scientific公司；RNA抽提试剂Trizol、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)、大肠杆菌Trans5α感受态、LA Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶BsmBⅠ、T4 DNA连接酶、RNA酶抑制剂(RRI)、Oligo(dT)引物、Random随机引物、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和核酸Marker均购自宝生物工程大连有限公司；慢病毒表达载体lentiGuide-EGFP载体由南方模式生物科技股份有限公司提供；用于检测CRISPR/Cas9基因敲除效率的RT-qPCR引物由奥科生物科技有限公司合成。本研究使用的商业抗体包括：HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(Proteintech)、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Proteintech)、鼠抗TPL2单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)、鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)。兔抗FMDV多克隆抗体和兔抗SVA多克隆抗体由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队提供，Western blot检测可显示出VP0、VP1和VP3三个蛋白条带。免疫荧光兔二抗购自Cell Signaling Technology(CST)公司。
1.2 方法 1.2.1 引物设计与质粒构建根据NCBI数据库中猪TPL2基因的Gene ID(100622217)，对蛋白质序列进行分析选择Exon2中保守区域进行靶点筛选，并在Ensembl基因组数据库(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Transcript/Summary?db=core;g=ENSSSCG00000020705;r=10:40709927-40746355;t=ENSSSCT00000033089)选取分值较高的2组序列作为靶位点。设计针对两个靶点的sg RNA，并在序列正义链与反义链的5′端添加BsmBⅠ酶切位点。设计获得上、下游sg RNA序列见表 1。将退火杂交的引物与酶切后的lentiGuide-EGFP载体混合，在T4 DNA连接酶的作用下16 ℃连接过夜。次日将连接反应产物转入Trans5α感受态细胞进行转化，涂布于氨苄抗性平板筛选，挑取单克隆送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序鉴定。
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表 1 猪TPL2-sg RNA核酸片段 Table 1 Pig TPL2-sg RNA oligo |
PK-15细胞用添加10%胎牛血清、0.2 mg·mL-1链霉素和200 IU·mL-1青霉素的DMEM培养基进行培养。在37 ℃、5%CO2气体的培养箱中静置培养。按照脂质体Lipofectamine 2000转染试剂说明书将lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA慢病毒表达质粒与病毒包装辅助质粒共转染至PK-15细胞，同时将lentiGuide-EGFP载体与病毒包装辅助质粒共转染PK-15细胞作为对照。收集包装病毒上清液，4 ℃超速离心浓缩纯化后置于-70 ℃冻存备用。
1.2.3 慢病毒滴度测定和感染病毒原液梯度稀释后依次加入提前种好PK-15细胞的96孔板中，72 h后更换含有puromycin的培养基继续培养，24 h后对所有组拍照计算病毒滴度。病毒滴度(TU·mL-1)= GFP阳性细胞数/稀释倍数。将对数期的PK-15细胞以每孔5×105的融合度种入6孔板中, 将纯化的病毒与无血清的DMEM培养基按感染复数MOI=20的比例混合后替换细胞培养基，并加入Polybrene至终质量浓度为6 μg·mL-1。12 h后更换细胞上清为新鲜DMEM培养基继续培养72 h。使用荧光倒置显微镜观察荧光情况并进行拍照和流式检测。
1.2.4 单克隆细胞的培养及测序鉴定分选的单克隆细胞接种至96孔板中，2~3 d换一次液，长满后传代至48孔板并依次扩大培养至24孔板、12孔板、6孔板和T25培养瓶中。单克隆扩大培养后提取细胞基因组，用猪源TPL2引物(Forward：5′-GGACAGCAGGTGAAACGCATCT-3′；Reverse: 5′-CCACAGCCATAGCCACAACC-3′)进行PCR扩增。扩增产物送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序，检测碱基插入或者缺失情况，挑取有效编辑的单克隆细胞系用于后续功能评价。
1.2.5 间接免疫荧光(IFA)PK-15-TPL2-/-和PK-15细胞以每孔2×105个细胞量分别接种于20 mm的玻璃小皿，当细胞长至70%~90%融合度时，进行感染处理。细胞计数后按照MOI=2病毒量的FMDV和SVA感染两组细胞，37 ℃、5%CO2培养箱吸附1 h后，弃去毒液换成2%DMEM维持液，继续培养8、16 h。收取不同时间点的细胞用PBS清洗3次以除去附着的病毒，加入1 mL 4%多聚甲醛室温避光固定1 h，弃上清，PBS清洗3次，每孔加入500 μL 0.2%TritonX-100室温通透1 h，弃上清，PBS清洗3次；用5%BSA 37 ℃封闭1 h后吸取封闭液，加入用5%BSA稀释的FMDV和SVA一抗，4 ℃过夜孵育；用PBST清洗三次后加入用PBST稀释的荧光素标记二抗(免疫荧光兔二抗)，37 ℃避光孵育1 h，弃上清，PBST清洗三次，每孔加入100 μL封片剂封片(含DAPI)。使用激光共聚焦仪器观察荧光，并保存图片。通过Image Pro-Plus软件对FMDV和SVA的荧光表达量进行量化分析。
1.2.6 Real-time Quantitative PCR (RT-qPCR)PK-15-TPL2－/－和PK-15细胞以每孔5×105个细胞量分别接种于6孔板，按“1.2.5”方法感染MOI=2的FMDV和SVA后分时间点收取RNA。Trizol裂解法提取细胞总RNA，利用扩增FMDV和SVA 3D蛋白保守区域的绝对定量引物FMDV-3D-F/R、SVA-3D-F/R，以及FMDV和SVA的3D蛋白的探针对提取的RNA进行绝对定量检测，测定FMDV和SVA的拷贝数，引物序列详见表 2。将部分RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)进行RT-qPCR检测。以GAPDH mRNA表达水平为内参值，2-△△Ct法计算FMDV、SVA、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA表达水平，引物序列详见表 3。
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表 2 本试验用到的绝对定量引物序列 Table 2 Absolute quantitative primer sequences used in this experiment |
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表 3 本试验用到的RT-qPCR引物序列 Table 3 RT-qPCR primer sequences used in this experiment |
PK-15-TPL2－/－和PK-15细胞以每孔5×105个细胞量分别接种于6孔板，按“1.2.5”方法感染MOI=2的FMDV和SVA后分时间点收取蛋白。用PBS洗涤后加入含PMSF的RAPI细胞裂解液以及5×蛋白上样缓冲液裂解细胞。按20 μL蛋白上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，100 V恒压转膜1.5 h，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h; 分别加入TPL2抗体(1:1 000稀释)，FMDV抗体(1:1 000稀释)，SVA抗体(1:1 000稀释)和β-actin抗体(1:5 000稀释)4 ℃摇床孵育过夜，用1×TBST洗膜4次后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1:5 000稀释)和HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:5 000稀释)室温孵育1 h；用1×TBST洗膜4次后使用ECL全自动化学发光成像分析系统对电泳结果进行拍照及分析。
1.2.8 FMDV和SVA病毒感染力测定(TCID50)PK-15-TPL2－/－和PK-15细胞以每孔5×105个细胞量分别接种于6孔板，当细胞长至70%~90%融合度时，进行感染处理。细胞计数后按照MOI=1病毒量的FMDV和SVA感染两组细胞。待细胞病变量达到50%~60%收取病毒毒液，-80 ℃冰箱中反复冻融三次后，吸出培养基加入15 mL离心管，5 000 r·min-1离心5 min后吸取上清液用野生型PK-15细胞进行病毒感染力测定。将FMDV和SVA进行10-2~10-9倍梯度稀释，分别接种96孔板中长满单层的PK-15细胞，每个稀释度接种8个孔，每个孔0.1 mL。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养并观察4 d，每隔半日观察记录细胞病变(CPE)情况。根据各孔的细胞病变情况按照Reed-Muench两氏法计算TCID50。
1.3 统计学分析所有试验至少重复3次，结果相同。应用GraphPad Prism软件进行统计学分析并作图，采用独立样本T检验进行显著性分析，*.P＜0.05说明数据具有统计学意义，* *.P＜0.01说明数据间有显著性差异，* * *.P＜0.001说明数据间有极其显著性差异。
2 结果 2.1 TPL2基因敲除PK-15细胞系的构建为构建TPL2基因敲除PK-15细胞系，设计了两个特异性的CRISPR-Cas9 sgRNA，目标是猪源TPL2的第二外显子。利用BsmBⅠ末端序列将sgRNA克隆到lentiGuide-EGFP载体上。构建的lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA慢病毒表达质粒结构如图 1A所示。将lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA慢病毒表达质粒与病毒包装辅助质粒共转染PK-15细胞对TPL2基因进行打靶敲除，同时将lentiGuide-EGFP载体与病毒包装辅助质粒共转染PK-15细胞作为对照。转染48 h后在荧光显微镜下观察，可以观察到大量荧光蛋白的表达，表明质粒成功转染PK-15细胞(图 1B)。随后我们对病毒进行浓缩后感染细胞，通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的细胞克隆。
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A.lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA慢病毒表达载体结构图(左图为lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA1，右图为lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA2)；B.荧光显微镜检测lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA1和lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA2质粒转染PK-15细胞(透射光和荧光检测, 200×) A.Structural map of lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA lentiviral expression vector (Left image is lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA1, right image is lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA2); B.Fluorescence microscopy detection of lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA1 and lentiGuide-EGFP-TPL2-sg RNA2 plasmid transfection PK-15 cells (transmitted light and fluorescence detection, 200×) 图 1 敲除TPL2基因的PK-15细胞系的建立 Fig. 1 Establishment of a PK-15 cell line knocked out of the TPL2 gene |
从分选出带有绿色荧光的细胞克隆中选取23株阳性克隆进行序列分析。提取单克隆细胞系总RNA，并反转录为cDNA模板进行PCR扩增，对PCR产物测序后与转染lentiGuide-EGFP空载体细胞株中TPL2序列进行序列比对分析，以检查插入或缺失突变。测序结果显示，DNA序列存在一定程度的插入和缺失，说明我们所构建的携带Cas9和TPL2 sg RNA1+sg RNA2的慢病毒已对PK-15细胞TPL2基因进行有效的定点切割，进而造成了细胞基因组的错配修复。在挑选的23个单克隆中#1、#19和#20号阳性克隆为单克隆细胞株。敲除TPL2的单克隆细胞株#1存在2个单碱基的插入和2个碱基的缺失；敲除TPL2的单克隆细胞株#19存在3个碱基的缺失；敲除TPL2的单克隆细胞株#20存在2个碱基的缺失(图 2A)。为了进一步确认所筛选出细胞株中TPL2的敲除效果，采用Western blot法检测#1、#19、#20三个细胞株和PK-15对照细胞株中TPL2蛋白质表达水平。结果显示PK-15细胞中TPL2表达正常，而TPL2敲除的单克隆细胞株#1、#19和#20中并未检测到TPL2的表达，内参β-actin表达量正常且基本一致(图 2B)，说明本研究成功建立TPL2敲除细胞株。在3种敲除细胞株中随机选取1号细胞株进行后续功能评价。
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A.PK-15-TPL2－/－细胞株#1、#19、#20号克隆TPL2基因插入、缺失突变型分析(Query为实际测序结果，Subject对照基因组序列); B. Western blot测定细胞系中TPL2蛋白的表达 A. PK-15-TPL2-/- cell line #1, #19, #20 clone TPL2 gene insertion, deletion mutation analysis (Query is the actual sequencing result, Subject control genomic sequence); B. Determine the expression of TPL2 protein in cell line by Western blot 图 2 TPL2敲除细胞克隆株的鉴定 Fig. 2 Identification of TPL2 knockout cell clones |
FMDV对养猪业造成了巨大的经济损失，但是关于FMDV致病机制的许多方面仍然未知。为进一步探讨TPL2在PK-15细胞中的潜在作用，我们评估了FMDV在PK-15和PK-15-TPL2－/－细胞中的复制状态。用MOI=2的等量FMDV分别感染PK-15和PK-15-TPL2－/－细胞。IFA检测病毒蛋白的表达，发现感染后不同时间点FMDV蛋白在PK-15-TPL2－/－细胞中的表达要显著高于PK-15细胞中的表达(图 3A)。采用RT-qPCR进一步测定和比较了FMDV感染后不同时间细胞中FMDV基因拷贝数和mRNA水平发现，在PK-15-TPL2－/－细胞中FMDV的拷贝数和mRNA表达水平均高于PK-15细胞(图 3B和C)。Western blot检测结果也显示，与PK-15细胞相比PK-15-TPL2－/－细胞中FMDV的蛋白丰度明显增加(图 3D)。由此可见在FMDV感染过程中，TPL2确实发挥着抗病毒作用，PK-15-TPL2－/－由于不能正确表达TPL2蛋白，故而有利于FMDV病毒在机体内大量复制。
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A.A′.IFA检测感染FMDV不同时间病毒荧光表达量(63×)和FMDV光密度分析结果(A′)；B.绝对定量检测感染FMDV不同时间病毒拷贝数；C.相对定量检测感染FMDV不同时间病毒mRNA水平；D.Western blot检测感染FMDV不同时间病毒蛋白丰度；*.P＜0.05;* *.P＜0.01;* * *.P＜0.001 A, A′ IFA detection of FMDV infection at different time, virus fluorescence expression(A, 63×) and FMDV optical density analysis results (A′); B. Absolute quantitative detection of viral copy number of infected FMDV at different time; C. Relative quantitative detection of viral mRNA levels at different time of FMDV infection; D. Western blot detection of viral protein abundance at different time of FMDV infection; *.P < 0.05; * *.P < 0.01; * * *.P < 0.001 图 3 TPL2基因敲除促进FMDV在PK-15细胞中的复制 Fig. 3 TPL2 knockout promotes replication of FMDV in PK-15 cells |
由于FMDV和SVA具有高度相似性，为了研究在PK-15细胞中敲除TPL2对SVA复制是否也有影响，用MOI=2的等量SVA分别感染PK-15和PK-15-TPL2－/－细胞。IFA检测病毒蛋白的表达，发现感染后不同时间点SVA蛋白在PK-15-TPL2－/－细胞中的表达要显著高于PK-15细胞中的表达(图 4A)。采用RT-qPCR进一步测定和比较了SVA感染后不同时间细胞中SVA基因拷贝数和mRNA水平发现，在PK-15-TPL2－/－细胞中SVA的拷贝数和mRNA表达水平均高于PK-15细胞(图 4B和C)。Western blot检测结果也显示，与PK-15细胞相比PK-15-TPL2－/－细胞中SVA的蛋白丰度明显增加(图 4D)。由此可见在SVA感染过程中，TPL2确实也发挥着抗病毒作用，PK-15-TPL2－/－由于不能正确表达TPL2蛋白，故而有利于SVA病毒在机体内大量复制。
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A、A′.IFA检测感染SVA不同时间病毒荧光表达量(A，63×)和SVA光密度分析结果(A′)；B.绝对定量检测感染SVA不同时间病毒拷贝数；C.相对定量检测感染SVA不同时间病毒mRNA水平；D. Western blot检测感染SVA不同时间病毒蛋白丰度；*.P＜0.05;* *.P＜0.01;* * *.P＜0.001 A, A′. IFA detection of SVA infection at different time, virus fluorescence expression (A, 63×) and SVA optical density analysis results (A′); B. Absolute quantitative detection of viral copy number of infected SVA at different time; C. Relative quantitative detection of viral mRNA levels at different time of SVA infection; D. Western blot detection of viral protein abundance at different time of SVA infection; *.P < 0.05; * *.P < 0.01; * * *.P < 0.001 图 4 TPL2基因敲除促进SVA在PK-15细胞中的复制 Fig. 4 TPL2 knockout promotes replication of SVA in PK-15 cells |
为了研究使用PK-15-TPL2－/－和PK-15细胞扩增FMDV/SVA病毒产量的差别，用PK-15-TPL2－/－和PK-15细胞分别扩增FMDV和SVA。按Reed-Muench法测定FMDV和SVA的TCID50，结果显示FMDV在PK-15细胞复制后TCID50为103.6 TCID50·0.1 mL-1，而在PK-15-TPL2－/－细胞复制后TCID50测定结果为104.58 TCID50 ·0.1 mL-1(图 5A)。SVA在PK-15细胞复制后TCID50为106.8 TCID50 ·0.1 mL-1，而在PK-15-TPL2－/－细胞复制后TCID50测定结果为108.4 TCID50 ·0.1 mL-1(图 5B)。由此可见FMDV和SVA在PK-15-TPL2－/－细胞中的复制比在PK-15细胞中的复制速度更快。这些结果表明敲除TPL2能够促进FMDV和SVA感染后子代病毒的增殖，获得更高滴度的FMDV和SVA，使病毒产量增加。
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A.FMDV在PK-15和PK-15-TPL2－/－细胞扩增后的病毒滴度；B.SVA在PK-15和PK-15-TPL2－/－细胞扩增后的病毒滴度, *.P＜0.05;* *.P＜0.01;* * *.P＜0.001 A. Viral titer of FMDV after PK-15 and PK-15-TPL2-/-cell expansion; B. Viral titer of SVA after PK-15 and PK-15-TPL2-/-cell expansion, *.P < 0.05; * *.P < 0.01; * * *.P < 0.001 图 5 敲除TPL2基因增加PK-15细胞扩增的FMDV和SVA滴度 Fig. 5 Knockdown of TPL2 gene increases FMDV and SVA titers of PK-15 cell expansion |
敲除TPL2显著增加FMDV和SVA复制，为了研究TPL2敲除促进FMDV和SVA复制的可能原因，利用RT-qPCR检测感染FMDV和SVA后不同时间PK-15细胞及PK-15-TPL2－/－细胞内干扰素(IFN)和IFN刺激基因(ISG)的mRNA表达水平。如图 6所示，FMDV和SVA感染引起PK-15细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA表达上调，这提示FMDV和SVA感染能够激活IFN信号。然而在FMDV和SVA感染的PK-15-TPL2－/－细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA的表达明显降低，并且与时间不存在良好的相关性。这表明FMDV和SVA感染期间激活了干扰素信号通路，敲除TPL2能够抑制干扰素信号通路导致IFN-α、IFN-β和IFN-γ表达下调，同时抑制干扰素刺激基因ISG15、ISG54和ISG56的产生进而促进病毒的复制，在这个过程中是否还有其他因素参与，还有待进一步研究。
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A~F.RT-qPCR检测感染FMDV不同时间相关基因mRNA水平；G~L. RT-qPCR检测感染SVA不同时间相关基因mRNA水平, *.P＜0.05;* *.P＜0.01;* * *.P＜0.001 A-F. RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of relevant genes at different time points of FMDV infection; G-L. RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of relevant genes at different time points of SVA infection, *.P < 0.05; * *.P < 0.01; * * *.P < 0.001 图 6 敲除TPL2基因抑制FMDV和SVA诱导的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56基因的表达 Fig. 6 Knockdown of TPL2 gene inhibits expression of IFN-α, IFN-β, IFN-γ, ISG15, ISG54 and ISG56 genes induced by FMDV and SVA |
自19世纪80年代细菌限制性内切酶首次应用于DNA重组以来，基因编辑技术已有近40年历史[27-28]。但由于技术上的不成熟，在当时并没有被广泛应用。直到开发出操作方便、基因编辑功能精确并具有高性价比的工程核酸酶，该领域才取得重大进展[29]。目前ZNF、TALEN和CRISPR/Cas9三种基因编辑核酸内切酶已经应用于临床。其中，CRISPR/Cas9系统以其高效、快速、多功能、易用、低成本等优点，成为该领域应用最广泛的基因编辑技术，并已应用在各物种中[30]。本研究利用该技术成功构建了敲除TPL2基因的PK-15细胞系，Western blot分析表明，建立的细胞系中TPL2蛋白已完全敲除。随机选取1号细胞株进行功能评价，并将该细胞系命名为PK-15-TPL2－/－。
TPL2是天然免疫信号通路中的一种激酶蛋白，前期的研究已经证明了TPL2作为关键调节蛋白在抗病毒天然免疫过程中发挥着重要作用，能够抑制诸如流感病毒、高热血小板减少综合征静脉曲张病毒(SFTSV)和水泡性口炎病毒(VSV)的复制[16, 19, 31]，虽然TPL2已经被确定是Ⅰ型(IFN-α/β)和Ⅱ型(IFN-γ)干扰素的主要调节因子[16, 32]，但目前病毒通过干预TPL2功能进而抑制干扰素表达实现免疫逃逸方面的报道却很少。
近年来，猪FMDV和SVA感染暴发，在许多国家迅速蔓延，造成了严重的经济损失[33]。大量研究显示FMDV和SVA在进化过程中能够通过多种途径抑制干扰素表达实现免疫逃逸使其能够在宿主抗病毒防御机制下生存。据报道FMDV VP3可以通过降解JAK1来抑制IFN-γ信号转导通路[34]或通过抑制关键适配器分子VISA的表达在信号传导阶段逃避固有抗病毒免疫[35]；FMDV 2B诱导RIG-I减少和抵消RIG-I诱导的抗病毒作用[36]；FMDV L蛋白酶以LGP2为靶标，导致IFN-β水平降低，抗病毒活性降低[37]。SVA 3C抑制RIG-I和TBK 1诱导的Ⅰ型干扰素的产生[38]，或通过降解IRF3和IRF7消除IRF3和IRF7介导的天然免疫应答[39]。然而，目前还没有把FMDV和SVA抑制干扰素的表达同TPL2关联起来的相关研究。本试验通过IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50评估TPL2基因敲除后对病毒复制的影响，确定了TPL2对FMDV和SVA具有抗病毒作用，敲除TPL2基因可以显著增加病毒拷贝数、病毒mRNA的转录、病毒蛋白的翻译以及子代病毒的毒力，表明TPL2在宿主细胞抵抗FMDV和SVA增殖过程中发挥着重要作用。
机体通过抗病毒天然免疫系统限制病毒复制的主要方式是通过释放干扰素和促炎细胞因子来实现的[40-41]，这些抗病毒细胞因子能够直接参与抗病毒天然免疫反应或介导启动适应性免疫应答。本研究显示FMDV和SVA感染能显著上调IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA表达，激活宿主细胞内天然免疫应答，然而感染FMDV和SVA后与PK-15细胞相比IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA的表达在PK-15-TPL2－/－细胞内被显著下调了。这表明TPL2在FMDV和SVA诱导的干扰素表达过程中发挥着重要的调控作用，推测FMDV和SVA复制的增加是由于TPL2基因敲除后干扰素的产生受到抑制导致的。
敲除TPL2明显增加了FMDV和SVA的复制。在这里，笔者证明了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PK-15-TPL2－/－细胞系是FMDV和SVA疫苗研制过程中提高病毒产量的一种策略，而TPL2是一个潜在的靶点，该细胞系也可为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供有力工具。
4 结论TPL2在不同的病毒感染过程中扮演着重要角色。从猪PK-15细胞中敲除TPL2并通过IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50评估TPL2基因敲除后对病毒复制的影响，确定了TPL2对FMDV和SVA的抗病毒作用。进一步研究表明敲除TPL2对FMDV和SVA复制的促进作用是通过抑制干扰素信号通路来实现的。本研究有助于了解FMDV和SVA在被感染细胞中的感染过程，并提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可用作在FMDV和SVA疫苗开发过程中修饰细胞系以提高病毒产量的有效工具，为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向。同时构建的TPL2基因敲除PK-15细胞系也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。
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