2. 黑龙江省农业科学院, 哈尔滨 150086
2. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNPs)是一个保守的核蛋白超家族，在动植物中广泛分布，目前为止，已发现该家族成员有20多种，命名分别从A1至U[1]。大量的研究表明，hnRNPs家族成员在哺乳动物发育中起着至关重要的作用[2]，可参与pre-RNA剪接、mRNA运输、定位及翻译等过程[3-5]。hnRNPUL1是hnRNPs家族新成员。hnRNPUL1可与mRNA结合影响RNA的转运和加工[6-7]，也可以通过激活多种信号通路促进DNA损伤修复[8-11]，还有研究表明，hnRNPUL1与疾病(如早发型心肌梗死)发生相关[12]。
目前已在多物种中对hnRNPUL1基因进行了研究，人hnRNPUL1基因位于19号染色体上，由18个外显子组成，预计编码856个氨基酸残基；牛hnRNPUL1基因位于18号染色体上，由16个外显子组成，预计编码858个氨基酸残基；小鼠hnRNPUL1基因位于7号染色体上，由17个外显子组成，预计编码859个氨基酸残基；这些物种hnRNPUL1均具有保守结构域SAP、SPRY和AAA。但目前尚未见到有关猪hnRNPUL1基因的报道。为进一步揭示猪hnRNPUL1基因功能，本研究以民猪为试验材料，通过RT-PCR方法克隆了猪hnRNPUL1的全长编码区(complete coding sequence, CDS)，利用生物信息学方法分析其序列和结构，确定其组织表达谱和亚细胞定位情况，并对其存在的变异剪接体进行鉴定。
1 材料与方法 1.1 试验动物3头3月龄民猪(体重约15 kg，母猪)由黑龙江省农业科学院畜牧研究所科研基地提供，屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、背肌、腿肌等10个组织样，于液氮中速冻后，-80 ℃冰箱长期保存。
1.2 引物设计与合成通过分析GenBank数据库提供的猪EST、电子预测序列及人、鼠等动物的相应序列，设计H引物，用于扩增猪hnRNPUL1基因的全长编码区。根据克隆测序结果设计引物M1~4、M5、V1~4，分别用于分析变异剪接体、组织表达谱及亚细胞定位情况(详细信息见表 1)。所有引物均利用Premier 5.0软件自行设计，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
利用Trizol(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)提取各组织总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的质量和浓度，稀释成1 μg·μL-1备用。按照Prime Script RT reagent Kit(TaKaRa, Dalian, China)说明书进行反转录。将合成的cDNA置于-20 ℃中保存备用。
1.4 hnRNPUL1基因克隆及序列分析以多种组织混合cDNA为模板，利用引物H(表 1)通过PCR方法扩增猪hnRNPUL1基因编码区。反应体系：2×Taq Master Mix 5 μL(Vazyme, Nanjing, China)，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 3.2 μL，总计10 μL；反应程序：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 20 s)×30循环，72 ℃ 7 min，16 ℃ 30 s。目的片段胶回收后，插入pMD-18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α菌，对平板上的阳性菌落进行菌液PCR和质粒双酶切鉴定后，送到北京六合华大基因科技股份有限公司测序鉴定。
利用SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)对猪hnRNPUL1编码的氨基酸序列和蛋白结构域进行分析；利用ProtCompv 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=proloc&topic=protcompan)、NLS_Mapper (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi#opennewwindow)和NetNES (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/)软件分析猪hnRNPUL1蛋白亚细胞定位情况。
为了更好地分析猪hnRNPUL1基因的可变剪接现象，利用彼此重叠的4对引物(M1~M4，表 1)通过RT-PCR方法进行可变剪接分析，具体方法同上。
1.5 猪hnRNPUL1基因组织表达谱构建将3头猪的同一种组织cDNA进行等量混合后，作为模板，通过Real-time PCR方法构建组织表达谱。利用2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂(Bimake, Houston, TX, USA)在ABI QuantStudio3仪器上进行反应。反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，总体系为20 μL；反应程序：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s)×40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每个样品设置3个重复。以β-actin基因为内参，利用2-ΔΔCt方法进行相对表达量计算。
1.6 猪hnRNPUL1亚细胞定位分析以全长编码区的克隆质粒为模板，利用引物V1、V2、V3、V4(表 1)进行PCR扩增后，扩增产物克隆入pMD18-T载体，再通过BamH I和EcoR I酶切位点转接入pEGFP-N1(TaKaRa, Dalian, China)质粒，测序鉴定。
用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养PK15细胞，过夜培养待其细胞密度达到70%~80%时，使用脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)将重组质粒转染至PK15细胞。设置空载体转染组作为阴性对照。转染24 h后使用DAPI(Vazyme, Nanjing, China)染细胞核，在倒置荧光显微镜下观察融合蛋白在PK15细胞中的定位情况。
2 结果 2.1 猪hnRNPUL1基因克隆及序列分析通过RT-PCR和克隆、测序获得了猪hnRNPUL1的全长编码区序列，长度为2 580 bp(图 1、图 2)，预期编码859个氨基酸残基的多肽链，分子量为98.06 ku，等电点为8.26，平均亲水性为-0.986(亲水性)。其与人(NP_008971.2)、鼠(NP_659171.1)、牛(NP_001076935.1)hnRNPUL1蛋白的同源性分别为96.97%、89.56%、95.47%。利用SMART程序预测，发现其存在着SAP、SPRY和AAA结构域，分别位于多肽链的3~37、257~390和426~571 aa处。通过BLAT程序(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)分析，确定其含有15个外显子。利用核定位序列预测软件发现，在多肽链的2~30和498~507 aa处存在2个核定位序列(nuclear location sequence, NLS)。将该序列已经提交到GenBank数据库得到序列登录号：MN399154。
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M. DNA相对分子质量标准，条带长度分别为5 000、3 000、2 000、1 500、1 000、750、500、250、100 bp；1.扩增产物 M. DL5000 marker, composed of 5 000, 3 000, 2 000, 1 500, 1 000, 750, 500, 250 and 100 bp DNA fragments; 1. Amplified products 图 1 RT-PCR电泳检测结果 Fig. 1 Electrophoresis pattern of RT-PCR |
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E表示外显子，小写字母为引物序列，斜体加粗表示预测的核定位序列，单下划线表示可变剪接体H-1和H-2共有序列，双下划线表示H-2特有序列，边框表示起始密码子和终止密码子，其中TAG为全长扩增产物H的终止密码子，TAA为可变剪接体H-1和H-2的终止密码子 The E represent the exons, the lowercase letters are the primer sequences, the bold italic are putative NLS, the common sequences of transcript variant H-1 and H-2 are underlined, the sequence unique to H-2 is double underlined. The start and stop codons are boxed, of which TAG is the stop codon of H, while TAA is the stop codon of alternative splicing variant H-1 and H-2 图 2 猪hnRNPUL1核苷酸序列 Fig. 2 Nucleotide sequence of porcine hnRNPUL1 |
实时荧光定量PCR分析表明，hnRNPUL1基因在所检测的所有组织中均表达，在脾脏中表达量最高，心、肝和肾中的表达量较高，但在肺、胃、大肠、小肠、背肌中表达量较低，在腿肌中表达量最低(图 3)。
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腿肌组织中的相对表达量作为1，数据为“平均数±标准误” The relative expression level in the leg muscle tissue is used as 1, data is "mean ± standard error" 图 3 猪hnRNPUL1组织表达谱 Fig. 3 Tissue expression profile of porcine hnRNPUL1 gene |
根据亚细胞定位预测结果，首先构建了V1(1~155 aa)和V3(417~738 aa)2个片段的真核表达质粒，转染后发现V1在核质中都有表达，V3仅表达于细胞质中，说明二者不含有NLS。在此基础上，又构建了V2(133~430 aa)和V4(717~859 aa)2个片段的真核表达质粒，发现V2仅表达于细胞核，V4仅表达于细胞质(图 4)，说明V2片段存在着NLS。
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图 4 猪hnRNPUL1基因亚细胞定位 Fig. 4 Subcellular localization of porcine hnRNPUL1 gene |
在克隆测序时，通过菌液PCR对平板上的菌落进行初步鉴定，发现了两个较短的扩增产物，测序后证明是hnRNPUL1基因的可变剪接体，命名为H-1和H-2。与上述克隆的全长CDS相比，二者均缺失外显子2~12的完整序列以及外显子1、13的部分序列；此外，H-2在外显子13末端插入了111 bp(图 2)。H-1和H-2都存在着编码提前终止现象且终止密码子相同，预期编码多肽链长分别为128和166个氨基酸残基，其中前70 aa完全一致，在多肽链的3~37 aa处存在着经典结构域SAP。
为了更好地分析猪hnRNPUL1基因的可变剪接现象，利用彼此重叠的4对引物(M1~4)通过RT-PCR方法进行可变剪接分析。除M4引物外，M1~M3引物均成功扩增得到了可变剪接片段，3对引物分别获得了2、5和4个可变剪接片段(图 5)。与全长CDS的相应片段比对发现，新发现的可变剪接片段都存在着外显子缺失，剪接方式有外显子跳跃、可变5′剪接位点和可变3′剪接位点，其中外显子8和13存在着较多的可变3′剪接位点，外显子3存在着较多的可变5′剪接位点。M1引物得到的两个可变剪接片段还存在着内含子滞留现象。
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a. M1引物扩增结果；b. M2引物扩增结果；c. M3引物扩增结果。E表示外显子，折线表示外显子跳跃，灰色阴影方框表示内含子滞留 a. Amplification results of M1 primer; b. Amplification results of M2 primer; c. Amplification results of M3 primer. E indicate exons, the broken lines represent exon skipping, the closed boxes indicate intron retention 图 5 M1、M2、M3扩增区域变异剪接体结构 Fig. 5 Mutant splice variants structure of M1, M2 and M3 amplifying region |
最近的研究表明，hnRNPUL1与聚ADP核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase-1, PARP1)有关的DNA损伤修复密切相关，可通过与PARP1的相互作用进而调节PARP1表达的转录调控[13]，而PARP1是维持基因组稳定所必需的重要蛋白质之一[14-16]。DNA损伤后不能有效修复会导致损伤积聚和基因组稳定性下降，进而会引起相应遗传性疾病和散发性癌症的发展[17-19]。因此，hnRNPUL1在维持动物机体基因组完整性中发挥作用。
本研究成功克隆了猪hnRNPUL1基因全长CDS序列，发现其在组织中广泛表达，并通过生物信息学分析确定了其编码的多肽链含有hnRNPs家族的经典结构域——SAP、SPRY和AAA。SAP基序通常存在于多种参与转录、DNA修复、RNA处理或凋亡染色质降解的核蛋白中[20-21]；具有SPRY结构域的蛋白多参与RNA代谢、细胞内钙释放、调控和发育过程，可能还参与细胞因子信号调控[22-23]；AAA基序则分布广泛，参与各种细胞过程，包括膜融合、蛋白水解和DNA复制等[24]。因此，推测猪hnRNPUL1基因同样参与以上多种生理生化进程，对维持动物机体正常的理化反应及功能具有重要意义。
亚细胞定位是分子细胞生物学和蛋白组学一个重要的研究课题，目前多使用绿色荧光蛋白GFP构建融合载体来实现目标蛋白的定位观察[25-28]。通过网站预测发现，该基因具有两个核定位信号，分别位于2~30、498~507 aa处，对应编码区的6~90和1 494~1 521 bp。为鉴定核定位信号位置，首先构建了V1(1~155 aa)和V3(417~738 aa)2个片段的真核表达质粒。发现V1融合蛋白在细胞核与细胞质中均有表达，V3融合蛋白在细胞质中表达。表明这两个区域不存在核定位序列，软件预测结果存在着偏差。作为hnRNPs家族成员，细胞核内定位表达是其发挥功能的基础[29-32]。本研究又继续构建了V2(133~430 aa)和V4(717~859 aa)2个片段的真核表达质粒。结果发现，V2融合蛋白仅在细胞核中表达；V4融合蛋白的表达量比较弱，但能清晰地看到其表达于细胞质中，这可能是由于截短蛋白稳定性降低导致的。
可变剪接现象在真核生物中普遍存在，约有90%人类基因存在可变剪接，是机体在转录后水平调控基因表达的重要手段[33]。研究表明，几乎所有人类基因都存在选择性剪接[34-38]。选择性剪接在控制分化和发育中起着关键作用[39-41]，许多重大疾病都与选择性剪接失调有关[42-45]。本试验在鉴定猪hnRNPUL1基因的全长编码区时，获得了2个新的变异剪接体H-1和H-2。为了更好地分析猪hnRNPUL1基因的可变剪接现象，利用彼此重叠的4对引物(M1~M4)通过RT-PCR方法进行鉴定。本试验在其编码区发现了11种新的剪接现象，剪接方式有外显子跳跃、可变5′剪接位点、可变3′剪接位点和内含子滞留。本研究通过菌液PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测方法对RT-PCR产物进行筛选，选择长度不同的条带进行测序。由于琼脂糖凝胶电泳的灵敏性较低，无法鉴定长度相同但剪接方式不同的RT-PCR产物，所以不能全面反映猪hnRNPUL1基因的可变剪接情况，但说明了猪hnRNPUL1基因编码区存在着丰富的可变剪接现象。
4 结论通过RT-PCR方法克隆了猪hnRNPUL1基因的全长编码区，确定了其组织表达和亚细胞定位情况，并发现其存在着复杂的可变剪接现象，为研究猪hnRNPUL1基因的生物学功能提供了基础。
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