糖基化修饰是指在酶的催化下,蛋白质肽链上附加聚糖糖链的过程。蛋白质经过糖基化作用,形成糖蛋白。糖基化修饰是蛋白质的重要修饰过程,有调节蛋白质功能的作用[1]。研究表明,人约70%的蛋白具有糖链结构,编辑糖链的合成与修饰的基因占到人基因组的百分之一[2],糖基化的异常必然引起机体多种生化过程发生异常。常见的糖基修饰包括O-糖基修饰和N-糖基修饰,其中,N-糖基修饰更为广泛。N-糖基化过程需要酶促反应,其主要合成酶包括两种:糖苷酶与糖基转移酶。作为限速酶,其活性限制着N-聚糖合成的速度与精确程度[3],这些关键酶一旦异常将导致N-聚糖糖链改变,折叠错误,最终引起糖蛋白功能异常[4]。
SW可靶向性抑制α-甘露糖苷酶的活性,从而使大量低聚糖在溶酶体内聚集,导致组织细胞发生广泛性的空泡变性,严重影响生理功能[5]。课题组前期研究发现SW中毒引起的家畜繁殖性能下降,主要由于生殖激素分泌紊乱所致[6]。生殖激素中促黄体素(LH)和促卵泡素(FSH)是由垂体分泌的糖蛋白激素,这些激素均是异质二聚体,由2个糖基化亚基α和β构成,2个亚基间以非共价键相连[7-9]。同一物种激素的α亚基完全相同,而β亚基则是特异的,α亚基具有负责信号转录的作用,而β亚基是功能亚基,参与受体结合,激素生理作用的特异性是由β亚基所决定[10-12]。然而,SW如何影响糖蛋白促性腺激素分泌的作用?N-聚糖糖基化修饰对糖蛋白促性腺激素活性有怎样的影响?这些问题的解答对探究SW中毒导致家畜繁殖障碍起到至关重要的作用。据此,本研究通过建立苦马豆素染毒妊娠小鼠模型,检测小鼠垂体前叶糖蛋白N-聚糖糖链结构和N-聚糖加工过程糖基酶的活性,分析4种生殖激素分泌水平及其受体蛋白质表达量,以期为揭示SW通过改变促性腺激素的分泌活性对妊娠周期生殖激素分泌的影响机制,为家畜SW中毒所引起的生殖功能紊乱性疾病的治疗和防控提供理论基础和试验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物分组及样品采取80只SPF级6~8周雌性昆明小鼠以及40只性成熟雄性昆明小鼠,均购自成都达硕实验动物中心,购进后雌雄分笼饲养,适应7~10 d后进行正式试验。小鼠采食、饮水等均不受限,饲养于(26±1)℃室内、相对湿度保持在50%左右。将以上小鼠随机分成两组:染毒组(n=40,SW剂量0.04 mg·kg-1)与对照组(n=40,相同剂量的生理盐水),采用隔天腹腔注射处理。试验所需的SW提取自甘肃棘豆,利用本实验室所具有的专利方法提取(专利号:ZL. 2008 1 0018178. 3),所选剂量参考前期大量试验和已发表文章[13]。SW染毒21 d后,观察雌性小鼠外阴以判断是否发情,将发情雌鼠与雄鼠按2:1的比例进行合笼,第2天清晨检栓,以观察到阴道栓记为妊娠0 d。分别于妊娠6、11、16 d脱颈处死雌鼠,每次处死10只;产后组在幼鼠出生0、7、14 d记录体重。于每个试验时间点收集垂体前叶组织检测糖蛋白N-聚糖糖链结构和糖基酶的活性;收集血液应用ELISA检测小鼠生殖激素的水平;收集卵巢组织应用Western blot检测生殖激素受体(促性腺激素受体、促黄体素受体、雌二醇受体和孕酮受体)的蛋白表达量。
1.2 主要试剂和仪器1.2.1 主要试剂 β-actin抗体购自CST公司;促卵泡激素受体(FSHR)抗体、促黄体激素受体(LHR)抗体、雌二醇激素受体(ER)抗体购自Proteintech公司;孕酮激素受体(PR)抗体购自Abcam公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(山羊抗兔)购自上海闪晶分子生物科技有限公司;脱脂奶粉购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司;化学发光液购自ZETA公司;全蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自赛诺利康生物技术有限公司;小鼠生殖激素水平(促卵泡素、促黄体素、雌二醇和孕酮)和糖基酶(ɑ-甘露糖苷酶-Ⅰ、Ⅱ和N-乙酰葡糖胺转移酶-Ⅰ、Ⅱ)活性检测ELISA试剂盒购自泉州市九邦生物科技有限公司。
1.2.2 主要仪器 电泳仪(Bio-Rad公司)、凝胶成像仪(培清公司)、微量移液器(Eppendorf公司)、ZHWY-100B摇床(志诚集团)、湿转转膜仪(Bio-Rad公司)、微型垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)、多功能酶标仪(Berthold公司)、高速冷冻离心机(Sigma公司)、涡旋混合器(杭州瑞诚仪器有限公司)。
1.3 生殖指数及剖检变化详细观察染毒后动物反应情况,每天上、下午各观察1次动物,检查有无中毒反应,并记录染毒后合笼小鼠排阴道栓情况、交配数及成功妊娠数等。如出现死亡动物及时进行剖检,其余动物于妊娠6、11、16 d颈椎脱臼处死,进行剖检,剖检时记录妊娠的胚胎质量。分娩后,于幼鼠出生0、7、14 d记录存活数及幼鼠体重。
交配指数(%)=交配大鼠数/对数×100;
受孕指数(%)=妊娠雌鼠数/成功交配的对数×100;
妊娠指数(%)=怀活仔雌鼠数/怀孕雌鼠数×100。
1.4 垂体糖基转移酶活性与血液生殖激素水平检测收集垂体前叶和血液组织按照相关试剂盒说明书处理,用ELISA试剂盒检测垂体前叶组织糖基转移酶、糖苷酶的活性和血液生殖激素水平。取出试剂盒并恢复至室温,所需板条备用;分别加入标准品,制作标准曲线;依次加入样品(设置空白孔)→标记HRP的抗体孵育→洗涤→加反应液→终止液,最终在给定波长处测OD值。
1.5 卵巢生殖激素受体蛋白表达量的检测1.5.1 组织总蛋白的提取 采集小鼠卵巢,备用;试验前按照组织总蛋白的提取说明书操作:取出待抽提组织,预冷研钵,将组织倒入后,迅速加入液氮将组织研碎,并将其转移至1.5 mL离心管中;按照10 mL·g-1量加入1×工作液,摇床温和低温振荡20 min;4 ℃ 14 000 r·min-1离心20 min,组织较多时可多次进行离心,分离上清即为垂体的总蛋白提取物。
1.5.2 细胞总蛋白浓度的测定 获得全蛋白提取液后,按照检测试剂盒使用说明进行蛋白浓度的测定,在562 nm下比色测定,1 h内完成,以蛋白含量(μg)与吸光值分别为横、纵坐标作图,得到标准曲线。
1.5.3 Western blot技术检测相关糖基转移酶蛋白的表达 清洗薄厚玻璃板,装入制胶架中,根据需要选择并配制分离胶,凝固后加5%浓缩胶并插入梳子(十孔梳)。凝固后,置入电泳槽中加入新配制的1×电泳液,加入样液和蛋白marker,进行电泳。电泳完后进行转膜(膜需提前用甲醇浸泡1 min左右激活)。转膜结束后把膜放在5%脱脂牛奶封闭液中室温封闭,封闭时间根据蛋白特点选择,然后放到配制好的一抗(LHR/PR/FSHR/ER/β-actin抗体)中4 ℃过夜,第2天将膜用TBST清洗。进行二抗(HRP标记)室温孵育,并在结束后用TBST清洗。涂上新配发光液,放在仪器内曝光,观察蛋白条带。
1.6 垂体前叶组织N-聚糖糖链结构的检测1.6.1 滤膜辅助的糖蛋白糖链释放法 取垂体全蛋白提取液200 μg, 加入UA缓冲液(8 mol·L-1尿素,0.1 mol·L-1 Tris-HCl,pH=8.0), 4 μL DTT,补齐至300 μL,混合涡旋。将稀释后的样品溶液300 μL加入到30 ku超滤管中,高速离心(14 000×g 10 min),直到将所有的样品液都过滤完全。向超滤管中加入200 μL UA缓冲液,高速离心(14 000×g 15 min);向超滤管中加入180 μL UA缓冲液,4 μL DTT(终浓度20 mmol·L-1)溶液,混合涡旋,封口膜封口,放入37 ℃烘箱孵育4 h,孵育完成后取出,高速离心(14 000×g 15 min);加入180 μL UA缓冲液,10 μL IAA(终浓度50 mmol·L-1)溶液,混合涡旋,暗处反应30 min,高速离心(14 000×g 15 min);接下来,加入200 μL UA缓冲液,高速离心(14 000×g 15 min),并重复此步骤1次;继续加入200 μL去唾液酸反应Buffer, 高速离心(14 000×g 15 min),并重复2次;弃掉流出液后,并在超滤管中加入180 μL去唾液酸反应Buffer,加入去唾液酸酶,酶切过夜。高速离心(14 000×g 15 min),弃掉流出液后,继续加入200 μL 50 mmol·L-1 NH4HCO3,高速离心(14 000×g 15 min),并重复2次;弃掉流出液后,更换新接收套管,并在超滤管中加入180 μL 50 mmol·L-1 NH4HCO3,并按蛋白:PNG-F酶(100:1,质量比)加入PNG-F酶和1% Rapigest,37 ℃酶切反应16 h。糖链的洗脱与收集:将酶解反应16 h后的超滤管置于高速离心机中高速离心(14 000×g 10 min)。再用50 mmol·L-1 NH4HCO3(现用现配)洗脱两次,每次150 μL,每次高速离心(14 000×g 10 min),另用双蒸水150 μL洗脱1次,高速离心(14 000×g 10 min)。回收以上溶液,并进行合并,加0.1%TFA酸化,冻干备用。
1.6.2 样本的富集与检测 采用100 μL塑料枪头,尖端填充3M公司C8膜作为支撑筛板;称取5 mg HILIC填料,加入100 μL 0.1% TFA,放置15 min;平衡:取下Ep管,在掌上离心机离心30 s,用移液器吸除上层液体,加入80 μL BBH(80:20:0.2=乙腈:双蒸水:TFA),置DNA混悬仪上慢摇15 min,重复以上步骤3次;上样:将悬浮有HILIC填料的混合液利用移液枪加入到载有C8筛板的枪头中,静置待填料自然沉积后,利用注射器将上层溶液打下,从而使糖肽保留在HILIC小柱上;清洗:采用80 μL 80% ACN,1% FA的溶液冲洗HILIC上非特异性吸附的非极性肽段,重复2次;洗脱:采用80 μL 0.1%TFA,加入到枪头中,利用注射器将其缓慢打下,重复3次,合并洗脱后的糖,冻干备用。选用DHB作为基质,V基质:V样品=1:1,点靶上样。进行MALDI-TOF质谱检测。
1.7 结果统计及分析使用GraphPad Prism 7进行计算并检验(t检验)组间数据的显著性,数据以x±s表示。灰度分析使用Image J软件进行;组织学观察使用显微镜观察并拍照。*P < 0.05:代表相同时间点染毒组与对照组比较有显著差异;**P < 0.01:代表相同时间点染毒组与对照组比较存在极显著差异。
2 结果 2.1 苦马豆素对小鼠繁殖性能的影响2.1.1 苦马豆素对小鼠生殖指数的影响 小鼠经苦马豆素染毒21 d后,对所有试验雌性小鼠与正常雄性小鼠以2:1比例进行合笼,记录每只小鼠配种的次数。其结果发现苦马豆素对小鼠染毒后,试验组小鼠的交配指数显著低于对照组小鼠(P<0.05);染毒组小鼠受孕指数显著低于对照组(P<0.05);染毒组小鼠的妊娠指数低于对照组,但两组之间无显著性差异(P>0.05)(图 1)。
2.1.2 苦马豆素对胎鼠质量的影响 分别于雌性小鼠妊娠6、11和16 d进行解剖,记录胎鼠的平均体重。与对照组相比,经苦马豆素染毒11 d,染毒组胎鼠体重显著下降(P<0.05);经苦马豆素染毒16 d,染毒组胎鼠体重显著降低(P<0.05);苦马豆素染毒6 d,染毒组与对照组胎鼠体重无显著性差异(P>0.05)(图 2)。
2.1.3 苦马豆素对幼鼠成活率及体重的影响 正常分娩后,雌鼠继续应用苦马豆素染毒处理,分析苦马豆素是否能通过乳汁进入仔鼠体内,影响仔鼠的存活率,因此,记录仔鼠出生0、7和14 d的存活率。其结果发现进行苦马豆素染毒后,与对照组相比染毒组仔鼠的出生7 d存活率显著下降(P<0.05);染毒组仔鼠出生14 d的成活率显著下降(P<0.05);染毒组与对照组仔鼠出生0 d的存活率无显著性差异(P>0.05)。染毒组幼鼠体重在出生后0、7、14 d时显著低于对照组(P<0.05)(图 3)。
于雌性小鼠妊娠6、11、16 d时,收集垂体前叶组织应用ELISA方法检测N-聚糖加工过程中糖基转移酶含量。结果表明,妊娠6、11、16 d,染毒组小鼠垂体前叶α-甘露糖苷酶-Ⅰ和α-甘露糖苷酶-Ⅱ的活性显著低于对照组(P<0.05);妊娠11、16 d染毒组小鼠垂体前叶组织N-乙酰葡糖胺转移酶-Ⅰ的活性显著低于对照组(P<0.05),妊娠6 d染毒组小鼠垂体前叶组织N-乙酰葡糖胺转移酶-Ⅰ与对照组无明显差异(P>0.05),妊娠6、11、16 d染毒组小鼠垂体前叶组织N-乙酰葡糖胺转移酶-Ⅱ活性显著低于对照组(P<0.05)(图 4)。
于小鼠妊娠6、11、16 d收集垂体前叶组织应用MALDI-TOF-MS质谱技术检测2组小鼠垂体前叶总蛋白N-聚糖糖链结构。结果发现,苦马豆素染毒6 d小鼠垂体前叶糖蛋白N-聚糖两种复合型糖链[四天线2540(HexNAc6Hex7Fuc),三天线2337(HexNAc5 Hex7Fuc)]开始消失;染毒组小鼠苦马豆素处理16 d后与对照组比较,继续消失5种N-聚糖复合型糖链[四天线2540(HexNAc6 Hex7Fuc),三天线2337(HexNAc5 Hex7Fuc),三天线2174(HexNAc5Hex6Fuc),两天线1809(HexNAc4 Hex5Fuc),两天线1663(HexNAc4Hex5)]。然而,苦马豆素染毒16 d后,与对照组相比,染毒组小鼠增加糖蛋白N-聚糖新的杂合型糖链结构3种[四天线2133(HexNAc4Hex7Fuc),三天线1768(HexNAc3Hex6Fuc),三天线1622(HexNAc3Hex6)](图 5)。
苦马豆素染毒后于妊娠6、11、16 d检测血液生殖激素含量,结果表明:妊娠6、11、16 d染毒组小鼠血液FSH与LH含量显著低于对照组(P<0.05);妊娠11、16 d血液E2含量显著低于对照组(P<0.05);妊娠6 d染毒组小鼠血液E2与对照组相比无明显差异(P>0.05);妊娠11、16 d染毒组小鼠血液P4含量显著低于对照组(P<0.05);妊娠6 d,染毒组小鼠P4与对照组相比无明显变化(P>0.05)(图 6)。
在雌性小鼠妊娠6、11、16 d,收集卵巢组织进行生殖激素受体蛋白表达量的检测。结果发现,与对照组比,妊娠16 d,苦马豆素染毒组小鼠卵巢FSHR的蛋白表达量极显著的低于正常对照组(P<0.01);妊娠6、11 d,染毒组与对照组小鼠卵巢FSHR蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。妊娠11、16 d,染毒组小鼠卵巢LHR蛋白表达量极显著低于对照组(P<0.01);妊娠6 d,染毒组和对照组两组小鼠卵巢LHR蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。在妊娠11 d,染毒组小鼠卵巢PR蛋白表达量显著低于正常对照组(P<0.05);妊娠16 d,染毒组小鼠卵巢PR蛋白表达量极显著的低于对照组(P<0.01);妊娠6 d,染毒组和对照组小鼠卵巢PR蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。妊娠11、16 d,染毒组小鼠卵巢ER蛋白表达量极显著的低于对照组(P<0.01);妊娠6 d,染毒组和对照组小鼠卵巢ER蛋白表达量无明显变化(P>0.05)(图 7)。
糖基化修饰是生命体最广泛的蛋白质翻译后的修饰之一,而作为N-聚糖合成的抑制剂——苦马豆素因抑制糖基化修饰影响了多种生命过程。N-糖基化加工是一个非常敏感的过程,它取决于许多因素,其中,N-聚糖糖基转移酶和糖苷酶的活性起主要作用[13-14]。N-聚糖加工过程的关键酶主要有α-甘露糖苷酶-Ⅰ、α-甘露糖苷酶-Ⅱ、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-Ⅰ和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-Ⅱ四种糖基酶[15]。糖苷酶的功能主要是剪接连接于寡糖末端的以不同化学键结合的甘露糖残基,最终完成包括高甘露糖型、复杂型、杂合型在内的多种类型N-寡糖模式[16],糖链是在糖基转移酶的催化下,由单糖连接而形成的N-聚糖[17]。苦马豆素因其结构类似于甘露糖,对于甘露糖苷酶具有比甘露糖更高的亲和力,可以特异性地对溶酶体α-甘露糖苷酶以及高尔基α-甘露糖苷酶Ⅱ产生抑制作用,同时,能够破坏细胞内膜系统[18-19]。Gregg等[3]研究发现SW处理细胞会导致高尔基α-甘露糖苷酶Ⅱ的抑制,引起杂合型结构的积累,该结构具有Man5GlcNAc2核心和a1, 3核心甘露糖上的复杂分支。苏忠超等[20]研究显示,利用不同方法对小花棘豆中的苦马豆素进行降解处理,对染毒小鼠血液甘露糖苷酶活性与苦马豆素降解水平呈现负相关性,说明其活性受苦马豆素(SW)的抑制。本试验中发现SW不仅可抑制ɑ-甘露糖苷酶Ⅰ、Ⅱ的活性,同时也抑制N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅰ和Ⅱ的活性[21],这说明在N-聚糖加工过程中,SW自始至终都对N-聚糖的糖链结构起到破坏的作用。由于SW对N-聚糖糖基酶的活性有显著的抑制性,因此,笔者检测N-聚糖糖链结构,结果发现随着苦马豆素染毒时间的延长,染毒组小鼠垂体前叶糖蛋白肽链上丢失了5种二天线、三天线和四天线复合型N-聚糖的糖链结构,而在肽链上新添加了3种三天线和四天线的杂合型N-聚糖的糖链结构,说明苦马豆素作用于妊娠期间小鼠,使其垂体前叶的糖蛋白N-聚糖糖链结构发生了显著性的改变,导致N-聚糖糖基化修饰受到了影响,严重地损害了糖蛋白的功能,使其无法行使自身的功能。
垂体前叶分泌的促性腺激素促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)均是糖蛋白,α与β亚基上均存在N-聚糖糖基化修饰[22]。FSH和LH表达后需经相应的糖基化修饰才有生物学活性,重组FSH和LH得不到糖基化修饰,因而不具有生物学活性[6-7, 23-24]。糖基化位点突变减少FSH和LH糖基化侧链数时,FSH和LH体内外的生物活性明显降低,而通过位点突变增加FSH和LH糖基化侧链时,两种激素在体内的半衰期和生物活性明显提高[25-26]。说明N-聚糖糖基化修饰对糖蛋白激素的活性具有重要的调控功能[9, 27]。苦马豆素通过抑制N-聚糖加工过程中糖基酶的活性,影响N-聚糖糖链结构,改变其糖基化修饰[28]。那么SW是否也会影响垂体前叶分泌的糖蛋白激素的活性与功能呢?基于此,笔者检测了血液中4种生殖激素[FSH、LH、雌二醇(E2)和孕酮(P4)]的水平,结果发现在整个妊娠周期,染毒组小鼠血液4种生殖激素的水平显著下调,从而表明苦马豆素因改变糖蛋白肽链上的N-聚糖糖链结构,导致促性腺激素分泌水平下降。促性腺激素的生理功能是通过分布于卵巢特异性受体-FSH受体和LH受体所介导的[29],进一步分析卵巢上两种激素受体蛋白表达量,结果发现小鼠妊娠期间苦马豆素可显著性抑制两种激素受体蛋白的表达,使促性腺激素与受体结合率降低,无法行使正常的生理功能。在下丘脑-垂体-性腺轴中促性腺激素可通过正反馈促进卵巢分泌雌二醇和孕酮,当促性腺激素水平较高时可负反馈地作用于下丘脑-垂体-性腺轴,抑制雌二醇和孕酮的分泌[22, 30]。本试验中促性腺激素分泌水平较低,不能正反馈或负反馈地作用于下丘脑-垂体-性腺轴,使卵巢分泌的雌二醇和孕酮水平较低,同时,发现苦马豆素也可降低雌二醇和孕酮受体的蛋白表达量,导致雌激素和孕激素与其受体结合下降,类固醇激素分泌水平进一步降低,最终引起妊娠周期生殖激素分泌紊乱,严重影响动物的繁殖性能。
4 结论苦马豆素中毒可抑制N-聚糖糖基酶的活性引起促性腺激素糖蛋白肽链上N-聚糖糖链结构改变,使杂合型N-聚糖数增多,复合型N-聚糖数减少。影响雌鼠的交配、受孕及产仔情况;使其下游调控的性腺类固醇激素及其受体减少,最终导致雌性小鼠妊娠期生殖激素分泌紊乱。
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