2. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025
2. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
产羔数是山羊产业发展的一个重要经济指标[1]，母羊的多产性是具有明显遗传特征的性状。从解剖学分析，母羊是双角子宫，适合怀双胎[2]。在生产实践中，不少母羊不仅可以产双羔，甚至可以产3~4羔[3]。提高母羊的产羔率可以大幅度提高生产经济效益。黔北麻羊是贵州地方三大优良山羊品种之一，具有遗传性能稳定、耐粗饲、抗病力强、合群性好、性情温顺、适应性强等特点[4]，研究其多羔遗传分子机制对培育多胎黔北麻羊新品系和提高黔北麻羊养殖效益具有重要意义。
研究繁殖候选相关基因表达的情况是探究山羊繁殖机理的有效途径之一。类固醇5α还原酶2(the steroid 5 leborenase 2，SRD5A2)是微粒体蛋白，催化各种类固醇底物的Δ4、5双键还原，能催化睾酮转化为生物活性不尽相同的二氢睾酮[5]。90年代初Andersson等[6]首先克隆了SRD5A两种异构体的全长cDNA，分别命名为1型微粒体蛋白与2型微粒体蛋白。SRD5A2基因作为细胞信号通路中的一员，决定着哺乳类(包括人类)胚胎生殖道原始细胞的分化和发育性别[7]，二氢睾酮结合雄激素受体后启动外生殖器发育，使其分化为男性型并促进前列腺的发育，若该酶缺陷会引起男性性分化障碍。研究显示，SRD5A2基因主要表达在生殖系统及前列腺组织[8]，与生殖系统及前列腺组织发育有关。Hochberg[9]研究发现，SRD5A2基因缺失会造成女性生殖力低下。Zi等[10]比较了在排卵期的多羔金堂黑山羊和单羔藏羊卵巢基因转录的表达情况，结果显示，SRD5A2基因在这两个不同品种间山羊卵巢组织表达差异最大，推测其可能与金堂黑山羊高繁殖性能有关。Miao等[11]通过对济宁青山羊和莱芜黑山羊卵巢的RNA-Seq测序发现，miR-187和miR-874可以通过调节BMPR-1B和SRD5A2等基因的表达而调控山羊的繁殖力。Zou等[12]对单、多羔川中黑山羊卵巢进行RNA高通量测序，结果发现，SRD5A2基因在类固醇激素生物合成中显著富集，该基因及其所在通路与动物生殖有关。通过检测SRD5A2基因对山羊产羔性状相关基因表达的影响，有助于探究SRD5A2基因对黔北麻羊产羔性状的调控机制，而生长因子对动物的卵泡发育有着极其重要的作用，山羊繁殖相关基因包括转化生长因子超家族β(TGFβ)中的骨形态发生蛋白15(BMP15)[13]、生长分化因子9(GDF9)[14]和骨形态发生蛋白1B(BMPR-1B)[15]，他们是卵巢中启动卵泡发育以及调节排卵的必要生长因子[16]，是山羊多羔性状的候选基因。BMP15与GDF9基因共同作用于卵泡，影响优势卵泡的选择和闭锁卵泡的形成，调控颗粒细胞的增殖和分化[17-18]。促卵泡素(FSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素，它与性腺细胞受体结合，促使颗粒细胞增殖，刺激类固醇合成，从而调节配子细胞的发育和成熟，FSH由α和β 2个亚基组成，β亚基决定着FSH的生物活性[19]。FSHβ基因在山羊的繁殖过程中起着重要作用，是山羊高繁殖性状的主效基因[20]。
目前，关于山羊SRD5A2基因对产羔性状影响的研究较少，其对山羊产羔性状影响的作用机制尚不清楚。因此，本试验以黔北麻羊为研究对象，采集其卵巢并培养卵巢颗粒细胞，构建并筛选SRD5A2基因最佳干扰载体，通过实时荧光定量法(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测沉默SRD5A2基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞中高产候选基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ表达量的影响，以期为进一步研究SRD5A2基因对黔北麻羊产羔性状的分子作用机制提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 试验动物 本试验选择健康的(2~3岁)黔北麻羊经产母羊3只，体重约32 kg，由贵州省习水县富兴牧业有限公司提供。参照贵州省地方标准《羊屠宰操作规程》(DB22/T 2740-2017)进行屠宰。采集卵巢组织，用75%酒精冲洗3次，含双抗的PBS缓冲液清洗3次，置于含双抗的PBS溶液中保存带回实验室，4~5 h内分离培养卵巢颗粒细胞。
1.1.2 主要试剂及仪器 Gibco胎牛血清、LipofectamineTM3000CD Reagent脂质体转染试剂盒购自Thermo Fisher Scientific；PBS溶液、DMEM/F12(1:1)培养基购自广州飞扬生物工程有限公司；青链霉素购于上海鼎国生物有限公司(上海)；Hi Fi Script cDNA第一链合成试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。PCR扩增仪(型号为C1000 TouchTM)、实时荧光定量PCR仪(型号为CFX96 Real-Time System)、凝胶成像系统(型号为Universal Hood Ⅱ)均购自美国BIO-RAD有限公司。
1.2 方法1.2.1 卵巢颗粒细胞的培养及鉴定 卵巢颗粒细胞的培养及鉴定参考刘晓鹏和王华岩[21]的方法，将采集的新鲜健康黔北麻羊卵巢用75%酒精冲洗后，用灭菌的PBS冲洗3~5次，完全去除残留的酒精后，在DMEM/F-12新鲜培养液中，用医用无菌注射器针头刺入卵巢的卵泡腔，吸取卵泡液，使卵泡液完全释放，吸取DMEM/F-12培养液吹打使得卵泡液和培养液混合均匀，将混合液吸入至10 mL无菌离心管，静置10 min后，将上清液吸入到新的10 mL无菌离心管中，1 000 r·min-1离心10 min；弃去上清液，加入3 mL DMEM/F-12培养液，轻吹混和均匀，1 000 r·min-1离心10 min，此步重复1次；弃去上清液，加入新配制的DMEM/F-12培养液(含10%胎牛血清和1%双抗(100 IU·mL-1青霉素+50 mg·mL-1链霉素))，轻轻吹打混匀，转移至培养瓶中，放置在培养箱中，在37 ℃，5% CO2下培养24 h，使用灭菌的PBS冲洗2次后，更换培养液继续培养。
采用免疫荧光染色法鉴定分离培养的卵巢颗粒细胞的纯度，操作步骤参考高可心[22]的方法。取培养24 h的细胞，PBS洗涤3次，每次2 min；4%多聚甲醛4 ℃固定90 min，PBS洗涤3次，每次2 min；5% BSA溶液封闭30 min，不洗；1:100稀释的FSHR抗体，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次2 min，1:100稀释的生物素标记二抗，室温避光孵育30 min，PBS洗涤3次，每次2 min；1:200稀释的SABC-Cy3室温避光孵育30 min，PBS洗干净；在避光的条件下加入浓度为1 μg·μL-1的DAPI，37 ℃避光孵育15 min，PBS洗涤3次，每次2 min，拍照保存。
1.2.2 shRNA引物设计与合成 依据NCBI上发布的山羊SRD5A2基因编码区序列，利用Clontech公司提供的免费shRNA设计软件(siRNA Hairpin Oligonucleotide Sequence Designer)，依据shRNA设计原则找出SRD5A2基因效率较高的4个干扰靶序列与1个空白对照序列；SRD5A2基因干扰靶序列与空白对照序列为：GCCTCTTCTGCGCACATTACT、GGGAATGGGAATCAACA-TTCA、GGCCGTTTCCAGTTGTATTCC、GGCT-TGTTCACGTACGTTTCT、TTCTCCGAACGTGTCACGT；在干扰序列与空白对照序列两端添加Bbs I与BamH I酶切位点，中间插入序列为TCAAGAG的Loop结构，并在序列最后加上6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。设计4对shRNA引物并分别命名为shRNA-SRD5A2-1、shRNA-SRD5A2-2、shRNA-SRD5A2-3、shRNA-SRD5A2-4和1对阴性对照引物命名为shRNA-NC，引物交由上海吉玛制药技术有限公司合成，引物信息见表 1。
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表 1 shRNA引物信息 Table 1 shRNA primer information |
1.2.3 pGPH1/GFP/Neo载体的酶切与回收 将冻存的pGPH1/GFP/Neo空载体复苏，放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养，待液体培养基浑浊后，取10 μL pGPH1/GFP/Neo空载体、1 μL Bbs I、1 μL BamH I、5 μL 10×Cut Buffer、ddH2O补充至50 μL，于0.2 mL PCR管中进行酶切反应，反应时间为1 h，反应条件为37 ℃，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并对目的条带切胶回收，胶回收方法参照北京康为世纪公司胶回收试剂盒说明书进行。胶回收产物于－20 ℃冰箱保存，连接备用。
1.2.4 SRD5A2基因干扰载体的构建及鉴定 将单链的shRNA上下游片段进行退火，形成双链的DNA片段，随后与载体pGPH1/GFP/Neo进行连接。将合成好的shRNA-SRD5A2引物用灭菌水进行稀释至100 μmol·L-1，shRNA退火体系为10 μL：shRNA- SRD5A2上、下游引物(100 μmol·L-1)各4 μL，5×退火缓冲液2 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；80 ℃ 4 min，70 ℃ 4 min，65 ℃ 2 min，60 ℃ 2 min，55 ℃ 2 min，50 ℃ 2 min，45 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，37 ℃ 2 min，4 ℃保存，并将退火得到的shRNA片段用DEPC水稀释10倍用于后续的连接反应。连接反应体系10 μL：10× T4 Ligation Buffer 1 μL，T4 DNA连接酶0.1 μL，shRNA退火模板1 μL，酶切后pGPH1/GFP/Neo空载体3 μL，ddH2O补充至10 μL。连接反应条件为16 ℃过夜。取10 μL连接产物加入到解冻的DH5α感受态细胞中，然后通过涂板进行筛选，在LB平板中挑取白色菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃，200 r·min-1摇16 h后将菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。
1.2.5 SRD5A2基因干扰载体转染与检测 将生长状况良好的山羊卵巢颗粒细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞生长至90%的融合度时，按照Lipofectamine3000说明书进行转染，分别将pGPH1/GFP/Neo-SRD5A2-1、pGPH1/GFP/Neo-SRD5A2-2、pGPH1/GFP/Neo-SRD5A2-3、pGPH1/GFP/Neo- SRD5A2-4、pGPH1/GFP/Neo-NC转染至山羊卵巢颗粒细胞，每孔转染质粒2 500 ng，以未转染重组载体的细胞为空白对照。加完样后按十字方向轻轻摇匀，每个转染组3个重复。置于37 ℃、5% CO2培养细胞箱中培养，24 h后于荧光倒置显微镜下观察转染效率，并提取细胞RNA，qRT-PCR检测并计算各试验组的干扰效率。
1.2.6 qRT-PCR引物设计 根据NCBI上传的山羊SRD5A2、BMP15、BMPR-1B、GDF9、FSHβ基因mRNA序列，以β-actin为内参基因，利用Primer 5.0软件进行引物设计，引物详情见表 2。
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表 2 引物信息 Table 2 Primer information |
1.2.7 qRT-PCR检测 Trizol法提取转染24 h卵巢颗粒细胞的RNA，按照反转录试剂盒说明书反转录获得cDNA，以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR检测SRD5A2、BMP15、BMPR-1B、GDF9、FSHβ基因在最佳干扰试验组和NC组中的表达水平。反应体系为10 μL：2×T5 Fast qPCR Mix 5 μL，上、下游引物各0.75 μL(10 μmol·μL-1)，cDNA 1.5 μL(1 500 ng·μL-1)，ddH2O 2 μL。程序如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，68 ℃延伸28 s，40个循环；最后从60 ℃按0.5 ℃增加到95 ℃进行熔解曲线分析，荧光采集时间为5 s，每个样品进行3个平行试验。
1.2.8 数据分析 本次试验基因的Ct值数据采用2-△△Ct法计算，用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 黔北麻羊卵巢颗粒细胞培养及鉴定由于卵泡刺激素受体(FSHR)仅在卵巢颗粒细胞中表达，因此，利用FSHR免疫荧光法鉴定分离培养的卵巢颗粒细胞。免疫荧光结果显示，卵巢颗粒细胞加入FSHR抗体的阳性细胞发红光，表明细胞分泌的FSHR蛋白与其抗体结合(图 1A)，细胞核经DAPI染色呈现蓝色(图 1B)，细胞质染色和细胞核染色完全重合(图 1C)，说明山羊卵巢颗粒细胞培养鉴定成功，经鉴定细胞纯度高于90%，可以用于后续试验。
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图 1 卵巢颗粒细胞免疫荧光检测 Fig. 1 Immunofluorescence detection of ovarian granulosa cells |
将酶切回收的pGPH1/GFP/Neo载体与稀释退火后的shRNA 16 ℃连接过夜，连接液涂布于含卡那抗性的LB平板上进行培养过夜，挑取平板上的单一菌落进行摇菌，将菌液送至上海生工生物工程股份有限公司测序鉴定，选取测序结果正确的菌液进行下一步的试验。测序结果与设计合成的序列完全一致，表明重组质粒构建成功(图 2)。
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图 2 重组质粒测序结果 Fig. 2 Sequencing results of recombinant plasmids |
将培养鉴定过的卵巢颗粒细胞接种于6孔细胞培养板上，培养至细胞融合度达90%时进行转染。将干扰组和阴性对照组转染到到卵巢颗粒细胞中，24 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果发现，转染重组质粒的细胞在荧光显微镜下可观察到干扰组与阴性对照组细胞明显可见绿色荧光，空白对照组细胞未见有绿色荧光(图 3)。
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A. shRNA-SRD5A2-1；B. shRNA-SRD5A2-2；C. shRNA-SRD5A2-3；D.shRNA-SRD5A2-4；E. shRNA-NC；F.空白对照 A. shRNA-SRD5A2-1; B. shRNA-SRD5A2-2; C. shRNA-SRD5A2-3; D.shRNA-SRD5A2-4; E. shRNA-NC; F. Blank control 图 3 RNA干扰载体转染至卵巢颗粒细胞 Fig. 3 Transfection of RNA interference vectors into ovarian granulosa cells |
各重组质粒转染至卵巢颗粒细胞48 h后，提取细胞总RNA，逆转录后利用qRT-PCR检测各组内参基因(β-actin)和目的基因(SRD5A2)mRNA的表达量。RNA干扰载体干扰SRD5A2基因mRNA的表达量(图 4)，干扰效率分别为86.41%、81.26%、69.90%、65.44%，其中shRNA-SRD5A2-1能极显著下调SRD5A2基因的表达(P<0.01)，shRNA-SRD5A2-2能显著降低SRD5A2基因mRNA的表达(P<0.05)，shRNA-SRD5A2-3、shRNA-SRD5A2-4载体相对于空白对照和阴性对照降低SRD5A2基因的表达效果不明显。
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**. P < 0.01；*. P < 0.05。下同 **. P < 0.01;*. P < 0.05. The same as below 图 4 黔北麻羊SRD5A2基因shRNA序列的筛选及干扰效率检测 Fig. 4 shRNA sequence screening and interference efficiency detection of SRD5A2 gene in Qianbei Ma goats |
提取最佳干扰组shRNA-SRD5A2-1和shRNA-NC组细胞总RNA，反转录为cDNA。采用qRT-PCR技术检测沉默SRD5A2基因表达后，黔北麻羊卵巢颗粒细胞中产羔性状相关基因的表达水平。qRT-PCR结果显示(图 5)，抑制SRD5A2基因表达后，产羔性状相关基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ表达量均显著降低，BMP15的表达量极显著低于shRNA-NC对照组(P<0.01)，BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量显著低于shRNA-NC对照组(P<0.05)。结果表明，体外沉默SRD5A2基因可以抑制产羔性状相关基因的表达，表明SRD5A2基因可能通过促进产羔性状相关基因表达影响黔北麻羊产羔性状。
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图 5 干扰SRD5A2基因对产羔性状相关基因表达量的影响 Fig. 5 Effect of SRD5A2 gene interference on the expression of genes related to lambing traits |
类固醇5α还原酶(SRD5A)是一种位于细胞内质网膜上的蛋白质，能催化睾酮转化为另一种雄激素-二氢睾酮(DHT)，在性分化及雄激素生理中发挥重要作用[5]。目前已知，在人类和大鼠体内至少存在2种5α-还原酶，即5α-还原酶1型和2型[23]。研究显示，SRD5A2基因参与调控哺乳类(包括人类)胚胎生殖道原始细胞的分化和发育[7]，与动物繁殖密切相关。为了阐明SRD5A2基因在黔北麻羊产羔性能中具体的调控机制，本研究利用RNA干扰技术在线设计并合成靶向该基因的RNA干扰表达载体[24]，并成功将载体转染至黔北麻羊卵巢颗粒细胞中，通过qRT-PCR检测SRD5A2基因的mRNA表达量，筛选干扰效果最佳的载体shRNA-SRD5A2-1，干扰效率达到86.41%，为后续研究该基因在卵巢颗粒细胞中的功能提供理想的试验材料。
产羔数是山羊重要的繁殖性状之一，受到多基因的调控[25]。多羔候选基因骨形态发生蛋白受体1B(BMPR-1B)、骨形态发生蛋白15(BMP15)和生长分化因子9(GDF9)、卵泡刺激素β亚基(FSHβ)等与羊产羔数存在一定的关联[26-29]。本试验进一步研究了沉默SRD5A2基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞中繁殖相关基因表达的影响。Goyal等[30]的研究结果表明，BMPR-1B、BMP15和GDF9在绵羊黄体期卵巢中均高表达，在其他组织中也存在不同程度表达，表明这3个基因具有广泛的生物学功能并在卵巢中发挥重要作用。BMPR-1B基因在绵羊卵巢颗粒细胞和卵母细胞中特异性表达，影响颗粒细胞分化和卵泡发育，具有促进排卵的作用[31]。本试验发现，沉默SRD5A2基因后，BMPR-1B基因在卵巢颗粒细胞中的表达显著降低，结合BMPR-1B基因的功能分析发现，SRD5A2基因可能通过促进BMPR-1B基因在卵巢颗粒细胞中的表达来影响黔北麻羊产羔性状。骨形态发生蛋白15(BMP15)是猪[32]、牛[33]、羊[34]的多胎候选基因。刘霜等[35]研究发现，BMP15基因在多羔金堂黑山羊卵巢中的mRNA表达量高于单羔藏山羊(P<0.05)，说明卵巢中BMP15基因的表达量与金堂黑山羊多羔性状相关。相同的，Cui等[36]在单羔云岭黑山羊与多羔波尔山羊的比较研究中也发现，波尔山羊卵巢BMP15基因的表达量显著高于云岭黑山羊。本研究发现，沉默SRD5A2基因后，BMP15的表达量极显著低于shRNA-NC对照组，推测SRD5A2基因可能通过促进BMP15基因的表达来提高产羔数量，进一步证明SRD5A2基因与黔北麻羊产羔性状密切相关。GDF9基因是另一个影响绵羊多胎性的基因[37]，它主要由卵母细胞分泌，对卵泡的生长分化和胚胎的发育起重要的调节作用。研究发现，高产湖羊卵泡中GDF9基因表达量显著高于低产湖羊群体[38]。促卵泡激素(FSH)和促黄体素(LH)都是糖蛋白类促性腺激素[39]，是控制哺乳动物生殖的核心激素，由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌。刘建斌等[40]研究发现，FSHβ基因可能是影响小尾寒羊高繁殖性能的一个主效基因。同样，Zi等[41]研究报道，发情期高繁殖力乐至黑山羊脑垂体中FSHβ基因的mRNA表达量显著高于低繁殖力藏山羊。本研究中，qRT-PCR结果显示，抑制SRD5A2基因表达后，GDF9和FSHβ的表达量显著低于shRNA -NC对照组，提示SRD5A2基因的低表达会导致GDF9和FSHβ表达下降，因此进一步推测，SRD5A2基因的表达与繁殖相关基因密切相关，可能是影响黔北麻羊多羔性状的候选基因。SRD5A2基因属于类固醇信号通路的重要一员，其如何调节黔北麻羊卵巢颗粒细胞类固醇激素的分泌尚不清楚。本研究结果说明，SRD5A2基因可能通过促进多羔候选基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达间接促进黔北麻羊产羔性状，为研究SRD5A2基因作为黔北麻羊产羔候选基因提供了基础数据。
4 结论本试验在培养黔北麻羊卵巢颗粒细胞的基础上，成功构建了黔北麻羊SRD5A2基因的干扰载体，并筛选出干扰效果最佳的shRNA-SRD5A2-1，干扰效率达86.41%。干扰抑制SRD5A2基因的表达后，多羔候选基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量均显著降低，推测抑制SRD5A2基因对多羔候选基因表达具有抑制作用，为进一步研究SRD5A2基因对黔北麻羊产羔性状的调控机理奠定了数据基础。
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