2. 重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新研发实验室, 重庆 402460;
3. 西南大学医学院免疫研究中心, 重庆 402460
2. Chinese Veterinary Herbal Drugs Innovation Research Laboratory, University Veterinary Science Engineering Research Center in Chongqing, Chongqing 402460, China;
3. Center for Immune Research, School of Medicine, Southwest University, Chongqing 402460, China
肾肿是由于嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄障碍，导致尿酸盐结晶沉积在肾及周围组织所引起的特征性炎症[1-2]。鸡肾肿又称肾肿大综合征，是引发现代养鸡业中鸡死亡的主要疾病之一，不同日龄鸡群均可发生，死亡率10%~30%[3]。当其他疾病伴随着肾肿症发生时，其死亡率将会增加1倍以上[4]，严重危害养鸡业的发展。
肾调节机体水和电解质的动态平衡，维持机体内环境的稳定[5-6]。大量研究表明[7-9]，肾发生炎症后炎性细胞增殖分化，相关炎性细胞因子(IL-1、IL- 6、TNF-6、MCP-1、TGF-β1等)分泌随之增加，作用于全身和局部参与炎症反应，介导炎症过程，影响组织代谢等生物效应[10]。鸡肾肿发生后，机体内环境稳态严重失衡，引发器官或系统水平的功能紊乱，肾细胞信号通路的失调，导致正常细胞异常增殖、分化和凋亡[11]；信号转导机制紊乱还与肾组织内炎症介质、细胞因子异常表达有关[12]，尤其是IL-1R、IκBα、NF-κBp65等通过IL-1R/NF-κB信号通路调控相应靶基因的转录或表达，使病变部位产生相应的生物学效应[13]。信号通路的失调还与肾组织内炎症介质、细胞因子异常表达有关，这些因子通过调控核内相应靶基因的转录或表达，使病变部位产生相应的生物学效应[14]。
肾复康颗粒是根据中兽医基础理论和临床辨证原则，主要由土茯苓、白茅根、益母草等中药提取制成的中药复方制剂，具有清热利尿、益肾化浊、利湿健脾的功效。实验室前期研究结果表明，该复方颗粒对鸡肾肿病症具有较好的临床疗效，可明显改善病鸡模型血液生理指标以及生化指标，并且通过临床症状评分判断其疗效可知其治愈率可达到86.7%，有效率为100%，为进一步探究肾复康颗粒对鸡肾肿的抗炎作用机制，本研究通过人工复制鸡肾肿发病模型，检测其对肾肿鸡血清IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-β1究含量及其肾中IL-1R、IκBα、NF-κBp65 mRNA转录水平的影响，为其在临床推广应用提供可靠的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料健康18日龄三黄雏鸡100羽，分笼饲养，饲喂以雏鸡配合饲料，自由饮水，试验前适应性饲养1周。
肾复康颗粒，1 g颗粒剂相当于原生药0.95 g，购于青岛蔚蓝生物股份有限公司，批号：20150501；苍蓝口服液，1 mL口服液相当于原生药1.1 g，购自保定阳光本草药业有限公司，批号：201610038；IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-β1检测试剂盒，购自厦门惠嘉生物技术有限公司，批号：201709；DEPC、DNA marker、Trizol、GelView、PCR扩增试剂盒，购自上海生物工程有限公司；Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser、STBR Premix EX TaqTM II、Loading Buffer，购自上海宝生生物工程有限公司。
1.2 主要仪器设备HYQ漩涡混匀器(SilentShake公司)，ST16R离心机(THERMO公司)，MM-I型微量振荡器(上海亚荣生化仪器厂)，BIO-RAD酶标仪(日本)，高通道组织破碎机(Schwingmuhle Tissuelyser II，QIAGEN)，隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司，GNP-9080)，荧光定量PCR仪(LightCycler 96，Roche)，凝胶成像系统(Universal Hood II，BIO-RAD)。
1.3 方法1.3.1 鸡肾肿模型的建立 18日龄健康的三黄肉鸡分为空白组和造模组。空白组饲喂基础日粮，自由采食和饮水；造模组饲喂自配高钙高蛋白饲料用于复制鸡肾肿模型，其中，饲料配比以肉鸡配合饲料为基础日粮占35%，加豆粕44%、钙粉8%、磷酸钙7%、鱼粉6%，限水50 mL·(羽·d)-1，自由釆食。
1.3.2 鸡肾肿判定标准 参考文献方法[15-16]，鸡临床表现呈现精神沉郁、采食量下降、水样甚或石灰样稀便；临床剖解肾明显肿胀、苍白，部分呈花斑肾样；具有上述临床表现及剖检变化者可判定为肾肿症。
1.3.3 试验动物分组与处理 随机选取肾肿模型试验鸡75只，分为模型组(按1.0 mL·L-1添加生理盐水)、肾复康颗粒高、中、低剂量组(分别按2.0、1.0、0.5 g·L-1添加肾复康颗粒，相当于原生药1.90、0.95、0.48 g)以及阳性药物组(按1.0 mL·L-1添加苍蓝口服液，相当于原生药1.10 g)，每组15只，饮水给药，2次·d-1。给药前禁水2 h，待药液全部饮完后，供给自由饮水，连续给药5 d，停药后，再观察2 d。
1.3.4 肾复康颗粒对鸡血清中IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-β1对含量的影响 分别于造模前、后及末次给药后2 d无菌操作采集翅下静脉血，并制备血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-β1中含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。以空白孔调零，在450 nm波长检测各孔的OD值，计算各样本的含量。
1.3.5 RT-PCR测定肾中IL-1R、IκBα、NF-κBp65 mRNA转录水平 分别在给药前及末次给药后2 d无菌操作摘取各试验组鸡肾(5只·组-1，操作前禁食12 h)，用预冷的PBS溶液漂洗2~3次，洗脱血迹，分装于无RNA酶的离心管中，-80 ℃保存备用。
按照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书提取鸡肾总RNA，普通琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计测定其OD260nm和OD280nm，计算OD260nm/OD280nm比值，检测RNA的纯度。使用Promega反转录试剂盒(GoScriptTM Reverse Transcription System)将提取的总RNA反转录成cDNA，-20 ℃保存备用。
参考GenBank登记的鸡IL-1R、IκBα、NF-κBp65和内参基因GAPDH的核苷酸序列，利用软件Primer Premier 5.0设计3对PCR引物，并送上海生工程有限公司合成，详见表 1。分别以IL-1R、IκBα、NF-κBp65上海生的cDNA为模板，以GAPDH为内参基因，应用Roche LightCycler® 96实时荧光定量PCR仪进行扩增，共40个循环，每个样品3个重复。
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表 1 IL-1R、IκBα、NF-κBp65及内参基因GAPDH实时荧光定量PCR引物 Table 1 IL-1R, IκBα, NF-κBp65 and GAPDH real-time fluorescence quantitative PCR primers |
1.3.6 统计方法 试验数据以“平均值±标准差(x±s)”表示，采用SPSS 20.0软件中单因素方差分析和多重比较进行数据分析，RT-PCR mRNA相对表达量分析数据处理，采用2-△△Ct法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 鸡肾肿症模型建立饲喂高钙高蛋白饲料后第4天，试验鸡采食量下降，饮水量增加，粪便中开始出现灰白色物质，喜打堆，触诊皮肤发热；第5、6天，肛周羽毛粘有黏性白色粪便，大部分鸡精神沉郁，食欲降低，喜打堆；在造模第10天，10%鸡开始出现死亡，部分鸡出现跛行伴有关节肿大，80%死亡鸡剖检肾呈现典型的“花斑肾”，输尿管有白色物质沉着，心包有积液，详见图 1。由以上症状分析可知，造模后，鸡群排带血稀便，粪便可见有大量的尿酸盐沉积，外观为白色，频努责，口色红，根据中兽医理论判断，为湿热蕴结肾，肾气化失常，湿热阻滞，下迫尿道，故尿急而排尿灼热、涩痛；湿热伤及阴络则尿血；热灼湿蕴，煎熬尿垢，日久可结成砂石，是以辨证为肾肿湿热证。
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图 1 病理模型解剖特征 Fig. 1 Anatomical characters of pathological model |
由图 2可知，与空白组相比，肾肿模型组鸡血清中IL-1含量显著升高(P < 0.05)；各治疗组在饮水给药干预治疗后血清IL-1含量降低，与病理模型组比较差异显著(P < 0.05)，但肾复康颗粒各剂量组与阳性药物组之间，统计学比较差异不显著(P>0.05)。
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模型组与空白组比较，*.差异显著(P < 0.05)，**.差异极显著(P < 0.01)；给药组与模型组比较，Δ.差异显著(P < 0.05), ΔΔ.差异极显著(P < 0.01)。下同 Difference between the model group and the blank group, *. Significantly different (P < 0.05), **. Extremely significant (P < 0.01); Difference between each treatment group and the model group, Δ. significantly different (P < 0.05), ΔΔ. Extremely significant (P < 0.01).The same as below 图 2 不同时间段鸡血清中IL-1含量的影响 Fig. 2 The effect of IL-1 content in chicken serum at different time periods |
与空白组相比，肾肿模型组鸡血清中TNF-α含量显著升高(P < 0.05)；治疗组在饮水给药干预治疗后各组血清TNF-α含量降低，且与病理模型组比较差异显著(P < 0.05)，但肾复康颗粒各剂量组与阳性药物组之间，统计学比较差异不显著(P>0.05)。详见图 3。
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图 3 不同时间段鸡血清中TNF-α含量的影响 Fig. 3 The effect of TNF-α content in serum of chickens at different time periods |
与空白组相比，肾肿模型组鸡血清中MCP-1含量显著升高(P < 0.05)；饮水给药干预治疗后血清MCP-1含量降低，与病理模型组比较差异显著(P < 0.05)，但肾复康颗粒各剂量组与阳性药物组之间，统计学比较差异不显著(P>0.05)。详见图 4。
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图 4 不同时间段鸡血清中MCP-1含量的影响 Fig. 4 The effect of MCP-1 in chicken serum at different time periods |
与空白组相比，肾肿模型组鸡血清中TGF-β1含量显著升高(P < 0.05)；饮水给药干预治疗后血清TGF-β1含量降低，与病理模型组比较差异显著(P < 0.05)，其中，肾复康颗粒高剂量组血清TGF-β1高含量显著低于阳性药物组(P < 0.05)。详见图 5。
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图 5 不同时间段鸡血清中TGF-β1含量的影响 Fig. 5 The effect of TGF-β1 in serum of chickens at different time periods |
由图 6可知，与空白组相比，模型组鸡肾中IL-1R和NF-κBp65 mRNA相对表达量极显著升高(P < 0.01)，而IκBα mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01)；饮水给药干预治疗后，IL-1R和NF-κBp65 mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01)，同时IκBα mRNA相对表达量极显著升高(P < 0.01)，其中，肾复康颗粒给药组IL-1R mRNA相对表达量极显著低于阳性药物组(P < 0.01)，IκBα mRNA相对表达量极显著高于阳性药物组(P < 0.01)。
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不同字母表示组间差异显著，大写字母，P < 0.01；小写字母，P < 0.05。相同字母表示组间差异不显著，P>0.05 The different letters indicate significant different between groups, capital letters mean P < 0.01, small letters mean P < 0.05. The same letter indicates no significant difference between groups 图 6 IL-1R、IκBα、NF-κBp65 mRNA转录水平 Fig. 6 The transcription levels of IL-1R, IκBα and NF-κBp65 |
家禽肾肿是机体尿酸代谢性疾病，世界各地均有报道[17-18]，引发肾肿综合征的因素众多，较为常见的肾型传支等传染因素、饲料营养、中毒、应激等非传染性因素[19-21]，是禽类生产中的常见病和多发病，死亡率和发病率都比较高[22-23]。当肾机能减退时，肾小管上皮通透性降低，产生的尿酸不能及时排出体外，导致血液中的尿酸水平异常升高，高尿酸血症可引起内皮功能损伤和诱发一系列炎症反应，从而引发多种疾病[24]。研究发现，肾疾病伴有的肾炎症反应是对激活物产生的免疫应答，巨噬细胞、T细胞等免疫细胞在黏附因子、趋化因子和细胞因子的作用下在肾募集，引发炎症反应，加重血管损伤和基质纤维化[25]，可通过药物干预血液中IL-1、TNF-α、TGF-β1、MCP-1等炎性细胞因子的分泌，控制其炎症效应，改善疾病状态[26]。现代研究表明，土茯苓可能通过抑制XOD活性，调节尿酸转运体的水平，通过NF-κB信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等靶点有效改善肾损伤[27-28]。
TNF-α、TGF-B1、IL-1等细胞因子作为NF-κB的上游分子，通过衔接蛋白最终激活IκB激酶复合物，激活NF-κB，在核内调控相应靶基因的转录或表达[29-31]。活化的NF-κB又可导致多种细胞因子的表达，如TNF-α、TGF-B1、MCP-1等[32]。本试验研究结果表明，造模后雏鸡血清中IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-β1的含量显著升高，说明本试验在造模过程中所采用的高钙、高蛋白日粮对肾产生损伤，激活炎症因子的表达，病理模型建立成功。造模以后按照模型标准筛选雏鸡，采用随机分组原则，药物组用肾复康颗粒高、中、低剂量组分别进行治疗。结果表明，治疗后雏鸡血清中IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-β1别的含量降低，与病理模型组相比较差异显著(P < 0.05)，说明经肾复康颗粒治疗后，损伤的肾组织得以修复，炎症反应有明显缓解，炎性因子表达趋于正常水平，该复方颗粒对鸡肾肿病症的治疗显示出一定疗效。
本试验中的阳性药物选用的是苍蓝口服液，是目前临床治疗禽类肾肿症疗效比较确切的药物。试验中肾复康颗粒高、中、低剂量药物治疗组血清中IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-β1含量与阳性药物组对比无明显差异，表明肾复康颗粒疗效确切，甚至优于苍蓝口服液。在本次试验中设置肾复康颗粒高、中、低剂量组，主要是为了探索在不同浓度条件下，对于鸡肾肿症的治疗效果。而试验结果显示中剂量组的治疗效果与苍蓝口服液相当，故在后期的扩大临床试验中选用中剂量组为药物治疗浓度。
本试验中，造模组鸡肾中IL-1R、NF-κBp65 mRNA转录量均极显著升高(P < 0.01)，IκBα mRNA转录量极显著降低(P < 0.01)，说明造模后，肾肿炎症因子激活了IL-1R受体，从而促使NF-κB的核内转移及基因转录、表达；经过治疗后，肾复康颗粒给药组鸡肾中IL-1R、NF-κBp65 mRNA转录量降低，IκBα mRNA转录量增加，说明经治疗以后IL-1R/NF-κB信号通路趋于活性较低下水平，而IκBα mRNA活性较高，使得炎症信号通路处于抑制水平，炎性因子的表达同时受到抑制。在IL-1R/NF-κB信号通路中，IκB是细胞内NF-κB信号通路的主要抑制因子，在细胞质中与NF-κB二聚体结合，调控NF-κB/IκB信号应答[33-34]。而IκBα是IκB家族最主要的成员，受到外界信号刺激后IκBα能否正常降解导致其表达降低，对于NF-κB活化起着关键作用[11, 35]。故在本试验中，经治疗后IL-1R、NF-κBp65及IκBα mRNA转录量与造模后相比都有明显的变化趋势。
4 结论肾复康颗粒可通过降低肾肿鸡血清中IL-1、TNF-α、MCP-1、TGF-1含量，抑制IL-1R/NF-κB信号通路，从而发挥抗炎作用，可以有效防止鸡肾肿临床症状。
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