, HE Honghong, PAN Yangyang, DUAN Hongwei, LIU Minqing, GAO Zechuan, ZHAO Ling, HAN Xiaohong, WANG Yaying, CUI Yan, YU Sijiu
牦牛是青藏高原上的一种特有牛种，与藏民的生产生活密切相关[1]。牦牛一般生活在海拔3 000 m以上空气稀薄、氧分压低的地区，被誉为“高原之舟”，它以极强的生命力和适应性丰富着青藏高原地区的物质和文化生活[2-3]。在哺乳动物中，输卵管在繁殖方面起着举足轻重的作用，为卵母细胞的生长和成熟、精子储存和获能、受精以及早期胚胎的发育提供了最佳环境[4-5]。输卵管根据其形态特征可分为伞部、壶腹部和峡部。黏膜形成了纵行的初级皱襞，伞部和壶腹部皱襞高而窄，分支多，而峡部皱襞矮而宽，分支少[6]。输卵管伞部的主要功能是拾卵，壶腹部和峡部有利于卵子在输卵管中顺利转运以及精子顺利通过子宫颈、宫管连接部和壶峡连接部这三大障碍，最终精、卵在输卵管壶腹部相遇并结合，整体为受精和胚胎早期的正常发育提供了良好的环境[7-8]。
整合素家族发现于20世纪80年代中期，是细胞黏附分子家族成员之一，其为一类介导细胞间及细胞外基质相互作用的跨膜糖蛋白。目前，已发现18种不同的α亚单位和8种β亚单位，共形成24种功能不同的整合素分子[9]。整合素可以识别、结合细胞外基质中相应的配体，为细胞黏附提供附着点，调控细胞的运动、增殖和凋亡[10-11]。整合素αv属于整合素家族亚单位之一，有研究表明，整合素αv在人输卵管上皮细胞有表达，可特异性地识别RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列，参与细胞间的黏附，使精子与卵子在输卵管中黏附融合，从而完成受精和早期胚胎的发育过程[12-14]。Van Waes和杨筱祎等[15-16]研究发现，在人生殖过程中，输卵管黏膜上皮细胞的分泌活动参与了受精和胚胎早期发育等重要事件，而整合素能够促进输卵管黏膜分泌营养成分、精子头部穿透进入卵母细胞以及受精卵穿透蜕膜层和胎盘滋养层。另外，有报道称，整合素αv蛋白存在于猪卵母细胞表面，并作为精子受体参与精卵结合过程[17]。在猪和绵羊复杂的胚胎植入过程中，整合素αv通过与细胞外基质分子和其他配体的相互作用，介导子宫上皮细胞和滋养外胚层中的细胞信号，从而有利于胚卵对内膜的黏附并促进着床[18-20]。
上述研究表明，整合素αv在雌性动物生殖过程中可能起着重要作用。然而，迄今为止，虽然已知整合素与某些哺乳动物卵母细胞、精子的质膜和输卵管等有关，但它在牦牛繁殖周期输卵管不同部位表达的研究在国内外尚未见报道。因此，本试验通过采用实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹法和免疫组织化学染色法对整合素αv基因及蛋白在母牦牛繁殖周期输卵管不同部位的表达和定位进行研究，了解整合素αv基因及蛋白在牦牛输卵管不同部位的表达情况，确定其是否参与牦牛受精及早期胚胎发育等生殖过程，以期阐明整合素αv在牦牛输卵管中的作用，为进一步探讨整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料选取健康卵泡期、黄体期和妊娠期母牦牛(3~6岁)各6头(样品采于青海省西宁市乐家湾屠宰场)，颈动脉放血处死，并分别收集卵泡期后期(有优势卵泡>6 mm)、黄体期后期(可见多个黄体)同侧以及妊娠期早期(胚胎约长2~3 cm)妊娠侧[21]的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品，并用生理盐水冲洗干净，一部分组织样品用锡箔纸包裹放进有标记的布袋中，置于液氮中运回实验室，-80 ℃保存；另一部分置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存。
1.2 主要试剂和仪器整合素αv抗体(bs-2203R)、二抗(Goat Anti-Rabbit IgG，北京博奥森生物技术有限公司)；β-actin(13E5)Rabbit mAb (Cell Signaling公司)；RNA提取试剂盒(Omega公司，北京)；两步法反转录试剂盒(Promega公司，美国)；蛋白裂解液(索莱宝公司，北京)；DAB显色液、显影液、定影液以及BeyoEcl曝光液(Beyotime公司)；Go Taq® Green Master Mix 2× (Promega公司，美国)；SYBR® Premix Ex TaqTMEraserTM(Tli RNaseH Plus，宝生物(TaKaRa)公司)；阳离子防脱片(北京中杉金桥生物技术有限公司)；免疫组化染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；PCR仪(T100TMThermal Cycler，BioRad公司)；实时荧光定量PCR仪(Roche生物科技公司)；显微照相装置(DP71)(Olympus公司，日本)。
1.3 qRT-PCR检测牦牛整合素αv基因的表达将保存于-80 ℃卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管不同部位的组织研成粉末状，并称量0.1 g后装入标记好的无RNA酶EP管中，用RNA提取试剂盒提取总RNA(表 1)。按照反转录试剂盒步骤在PCR仪中将RNA反转录为cDNA，测其浓度并存于-20 ℃备用。根据GenBank数据库中牛整合素αv基因(NM_174367)和牦牛β-actin基因(JF830811)的序列，利用Primer Premier 5.0软件设计整合素αv和β-actin的引物(表 2，整合素αv引物浓度为10 μmol·L-1；β-actin引物浓度为10 μmol·L-1)，并由华大基因科技有限公司合成。将卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组，每组3个复孔，分别为待测孔、内参对照孔和空白对照孔，进行实时荧光定量PCR扩增。反应总体系为20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL，SYBR® Premix Ex TaqTMEraserTM 10 μL，无菌去离子水7.4 μL。反应条件：预变性(95 ℃)4 min；变性(95 ℃)30 s，退火(56 ℃)30 s，延伸(72 ℃)5 min，40个循环。每个样品重复3次。
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表 1 所提取RNA的质量 Table 1 RNA quality extracted in this study |
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表 2 目的基因和内参基因引物序列 Table 2 Primer sequences of target gene and housekeeping gene |
将-80 ℃保存的卵泡期、黄体期和妊娠期牦牛输卵管伞部、壶腹部和峡部组织样品研磨成粉末，称取0.1 g并加入裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)，涡旋后在冰上裂解1 h，1 500 r·min-1离心5 min后，吸取上清，提取总蛋白，于-80 ℃保存。将不同时期输卵管不同部位的蛋白样品与4×蛋白上样缓冲液按照3:1的比例配置蛋白工作液，金属浴变性(100 ℃，10 min)，冰上静置5 min。制备好SDS-PAGE胶并进行预电泳(70 V)20 min，再将蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；依次按照滤纸、胶、PVDF膜、滤纸从下到上的顺序将其固定于转膜夹子上，并将蛋白转至PVDF膜；用5%脱脂奶粉溶液封闭1.5 h；一抗(整合素αv抗体:PBST= 1:1 000；β-actin(13E5)Rabbit mAb:PBST=1:1 000)孵育，4 ℃过夜，PBST清洗3次，每次10 min；二抗(Goat Anti-Rabbit IgG:PBST=1:1 000)孵育2 h，PBST清洗3次，每次10 min；曝光显影与定影，扫描蛋白印迹条带，并用ImageJ测灰度值。
1.5 免疫组织化学法对牦牛整合素αv蛋白进行定位根据常规方法制作4 μm石蜡切片，脱蜡至水，蒸馏水清洗5 min，PBS浸泡5 min。将切片置于柠檬酸盐缓冲液(0.1 mol·L-1)中抗原修复，高火加热至沸腾后转中高火加热10 min，冷却至室温。滴加3% H2O2溶液进行阻断，在37 ℃烘箱中，孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。滴入SP试剂盒A液进行封闭，室温作用15 min。添加一抗(整合素αv抗体:PBS=1:250)孵育，4 ℃过夜，阴性对照组用PBS代替一抗工作液，阳性反应与阴性对照组分开清洗，PBS清洗3次，每次3 min。添加SP试剂盒B液孵育，37 ℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。添加SP试剂盒C液，37 ℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。DAB显色液适度显色，自来水冲洗10 min，蒸馏水浸泡1 min终止显色。苏木精复染并通过盐酸酒精分化。脱水透明，树脂封片，用显微镜照相。
1.6 数据分析利用SPSS 21.0软件对试验所得数据进行单因素方差分析，分析不同繁殖周期输卵管不同部位中整合素αv基因及蛋白的表达差异，相对表达水平表示为“平均值±标准差(Mean±SE)”，每组至少3个重复。P≥0.05为差异不显著，0.01≤P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 qRT-PCR检测牦牛整合素αv基因的表达实时荧光定量试验结果表明，整合素αv基因和β-actin基因熔解曲线中的熔解峰单一且无杂峰，验证了整合素αv和β-actin的引物特异性良好(图 1a)。通过SPSS 21.0软件对实时荧光定量CT值进行分析发现，在卵泡期，整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高，壶腹部表达最低，且二者间差异极显著(P < 0.01)；在黄体期，整合素αv基因在输卵管峡部表达量最高，伞部表达量最低, 且二者间差异极显著(P < 0.01)；在妊娠期，整合素αv基因在输卵管伞部表达量最高，壶腹部表达量最低, 且二者间差异极显著(P < 0.01)，见图 1b~d。
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a.整合素αv和β-actin的熔解曲线；b.整合素αv基因在卵泡期输卵管伞部、壶腹部、峡部中的表达；c.整合素αv基因在黄体期输卵管伞部、壶腹部、峡部中的表达；d.整合素αv基因在妊娠期输卵管伞部、壶腹部、峡部中的表达。不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)；不同的小写字母表示差异显著(0.01≤P < 0.05)。图 2同 a. Melting curve of integrin αv and β-actin genes; b. The expression of integrin αv gene in tubal umbrella, ampulla and isthmus during the follicular phase; c. The expression of integrin αv gene in tubal umbrella, ampulla and isthmus during the luteal phase; d. The expression of integrin αv gene in tubal umbrella, ampulla and isthmus during the pregnancy phase. The different uppercase letters indicate extremely significant difference (P < 0.01); the different lowercase letters indicate significant difference (0.01≤P < 0.05). The same as figure 2 图 1 牦牛整合素αv基因在繁殖周期输卵管不同部位中的表达 Fig. 1 The expression of integrin αv gene in different parts of the fallopian tube at different reproductive stages of yak |
Western-blotting试验表明，整合素αv蛋白在不同时期输卵管的不同部位均有表达，且存在表达差异(图 2a)。在卵泡期，整合素αv蛋白在输卵管伞部的表达量最高，壶腹部表达量最低，且二者间差异极显著(P < 0.01)；在黄体期，整合素αv蛋白在输卵管峡部表达量最高，伞部表达量最低, 且二者间差异极显著(P < 0.01)；在妊娠期，整合素αv蛋白在输卵管峡部和伞部的表达差异不显著，但二者的表达量极显著高于壶腹部(P < 0.01)，见图 2b~d。
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a.整合素αv和β-actin蛋白的免疫蛋白印迹条带：1~3.卵泡期输卵管伞部、壶腹部和峡部；4~6.黄体期输卵管伞部、壶腹部和峡部；7~9.妊娠期输卵管伞部、壶腹部和峡部；b.整合素αv蛋白在卵泡期输卵管伞部、壶腹部、峡部中的表达；c.整合素αv蛋白在黄体期输卵管伞部、壶腹部、峡部中的表达差异；d.整合素αv蛋白在妊娠期输卵管伞部、壶腹部、峡部中的表达差异 a. The Western-blotting bands of integrin αv and β-actin proteins: 1-3.Tubal umbrella, ampulla and isthmus during the follicular phase; 4~6. Tubal umbrella, ampulla and isthmus during the luteal phase; 7~9. Tubal umbrella, ampulla and isthmus during the pregnancy phase; b. The expression of integrin αv protein in tubal umbrella, ampulla and isthmus during the follicular phase; c. The expression of integrin αv protein in tubal umbrella, ampulla and isthmus during the luteal phase; d. The expression of integrin αv protein in tubal umbrella, ampulla and isthmus during the pregnancy phase 图 2 牦牛整合素αv蛋白在繁殖周期输卵管不同部位中的表达差异 Fig. 2 The expression of integrin αv protein in different parts of the fallopian tube at different reproductive stages of yak |
免疫组织化学试验结果发现，阳性产物呈棕黄色，表明整合素αv在输卵管中有分布，在卵泡期、黄体期和妊娠期，整合素αv在输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中均有分布(图 3a-i)；阴性对照试验未见棕黄色阳性表达(图 3j-l)。
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a.卵泡期输卵管伞部；b.卵泡期输卵管壶腹部；c.卵泡期输卵管峡部；d.黄体期输卵管伞部；e.黄体期输卵管壶腹部；f.黄体期输卵管峡部；g.妊娠期输卵管伞部；h.妊娠期输卵管壶腹部；i.妊娠期输卵管峡部；j.输卵管伞部阴性对照；k.输卵管壶腹部阴性对照；l.输卵管峡部阴性对照。LP.固有层；TM.肌层；EP.黏膜上皮；P.初级皱襞；S.次级皱襞；C.纤毛细胞。黑色五角星为分泌细胞；黑色细箭头为基细胞；黑色三角形为浆液腺 a. Tubal umbrella during the follicular phase; b. Tubal ampulla during the follicular phase; c. Tubal isthmus during the follicular phase; d. Tubal umbrella during the luteal phase; e. Tubal ampulla during the luteal phase; f. Tubal isthmus during the luteal phase; g. Tubal umbrella during the pregnancy phase; h. Tubal ampulla during the pregnancy phase; i. Tubal isthmus during the pregnancy phase; j. Tubal umbrella negative control; k. Tubal ampulla negative control; l. Tubal isthmus negative control. LP. Lamina propria; TM. Muscular layer; EP. Mucosal epithelium; P. Primary wrinkles; S. Secondary wrinkles; C. Ciliated cell. Black five-pointed star. Secretory cell; Black thin arrow. Basal cell; Black triangle. Serous gland 图 3 牦牛整合素αv蛋白在繁殖周期输卵管不同部位中的免疫组织化学染色 Fig. 3 Immunohistochemical staining of integrin αv protein in different parts of the fallopian tube at different reproductive stages of yak |
整合素αv是跨膜糖蛋白家族成员之一，广泛存在于人和动物体内各种组织中。有研究显示，整合素αv分子以及包含αv亚基的其他整合素二聚体分子参与动物受精和早期胚胎发育等过程[22]，但在牦牛输卵管中的作用尚不清楚。因此，本研究探究了整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管中不同部位的表达情况。
前人通过免疫组织化学方法定位了整合素αv蛋白在人[23-24]、鼠[25-26]和奶牛[27]等输卵管中的表达，表明其主要存在于输卵管上皮中。本研究通过免疫组化方法发现，整合素αv主要分布在牦牛输卵管的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中。上皮细胞中的纤毛细胞主要参与输卵管物质的运输，分泌细胞主要分泌营养物质，为输卵管受精和早期胚胎发育提供良好的环境[28-29]，整合素αv在输卵管上皮纤毛细胞和分泌细胞中表达，可能与其发挥这些功能有关。
为了进一步探究整合素αv在牦牛输卵管中的表达情况，本研究检测了牦牛繁殖周期不同阶段输卵管伞部、壶腹部及峡部中整合素αv基因和蛋白的表达。结果显示，在卵泡期，整合素αv基因和蛋白在输卵管伞部的表达量最高，壶腹部表达量最低。由于整合素αv有黏附功能，并且这种黏附在拾卵过程中参与输卵管黏膜上皮纤毛细胞与卵子间的黏附。输卵管伞部表达量高可能是由于卵泡期输卵管伞部产生大量整合素与卵子上整合素受体双向识别，从而有助于伞部接收卵子[30]。
雌性动物卵泡破裂后，在卵巢上会形成一个临时性的分泌器官——黄体。本研究显示，黄体期整合素αv在输卵管峡部表达量最高，伞部表达量最低。有研究发现，排卵后输卵管峡部上皮高表达的整合素αv有可能参与此时期精子功能的调节和精子受精前修饰，而且为输卵管峡部发挥精子“储存器”的功能提供一种分子机制[24]。排卵后，输卵管峡部黏膜上皮高表达的整合素αv可以通过与精子表面的细胞外基质配体结合，使精子内某些蛋白激酶的酪氨酸磷酸化，从而激活精子，使之从输卵管峡部黏膜上皮分离，进入到输卵管壶腹部与卵子结合并受精[31]。卵巢排卵后，输卵管上皮纤毛细胞变长且增多，分泌细胞分泌功能也更加旺盛，从而有助于卵子的运输[5]。因此，整合素αv可能参与了输卵管纤毛摆动、运送卵子和精子的过程。
精、卵在输卵管壶腹部结合后被运送至子宫着床，动物进入妊娠期。在此阶段，整合素αv在输卵管峡部和伞部的表达差异不显著，壶腹部表达量最低。输卵管中存在一种输卵管分泌的特殊蛋白—骨桥蛋白，并且整合素通过其RGD氨基酸序列与骨桥蛋白结合从而参与细胞黏附和细胞信号传导，这种细胞附着系统在体内输卵管环境中可能对配子、胚胎和上皮之间的相互作用至关重要[32-33]。在这一时期，输卵管壶腹部已经完成为精卵结合提供场所的功能，这可能是整合素αv在这一部位低表达的原因，因此推测，整合素αv参与牦牛受精和早期胚胎发育过程。
近年来，整合素αv在精卵结合和胚胎着床、发育方面受到了广泛关注。前人研究发现，人、羊、鼠子宫内膜中检测到多种整合素，表明它们可能在着床开始时参与滋养细胞与子宫内膜的黏附[34-37]。也有报道称，在人睾丸中的生精细胞上检测到了整合素αv [38-39]，精子上整合素的存在和卵母细胞上整合素配体结合结构域的存在表明，整合素αv亚型可能参与了受精过程[40]。而本研究发现，整合素αv基因和蛋白在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中存在表达差异，推测整合素αv在牦牛受精及早期胚胎发育方面发挥着重要作用，为研究整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供了理论依据，但其参与牦牛卵子接收、精卵结合及受精卵运输等的具体机制还需进一步研究。
4 结论整合素αv在牦牛繁殖周期中输卵管伞部、壶腹部和峡部中均有表达，且存在表达差异性，在繁殖周期输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中均有分布，因此推测，整合素αv可能参与了输卵管受精以及早期胚胎发育等生殖过程，为牦牛的繁殖性能研究提供了理论依据。
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