2. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
3. 贵州省草业研究所, 贵阳 550006
, CHEN Xiang1,2
, ZHOU Zhinan1,2, LUO Jinhong3, WEI Shinan1,2, ZHANG Yan1,2, HUI Maomao1,2, WU Yu1,2, YANG Peifang1,2
2. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Guizhou Province Grass Industry Research Institute, Guiyang 550006, China
TGFβ超家族由调节不同生理功能的多种蛋白质组成，分为TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ1β2等4种亚型，其功能包括胚胎发育、伤口愈合、趋化性和细胞周期调控[1-2]。大量研究表明，TGFβ家族的成员在动物繁殖中具有重要的调节作用[3]，如BMP4、BMPR-IB、GDF9等基因。TGFβ2基因作为生长因子β(TGFβ)家族成员之一，在TGFβ/SAMD信号通路中TGFβ2和TGFβ1属丝/苏氨酸激酶受体家族[4]，主要由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞所释放，具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等作用[5]。其核苷酸序列具有高度同源性，且所编码的前体分子C端都有一段保守的半胱氨酸序列[6]，在细胞内以前体形式合成。固定于膜上的蛋白聚糖β聚糖和内皮糖蛋白能与TGFβ2高亲和力地结合[7]。但TGFβ2的活性还受到其他方面的调控，如可以通过胞吞作用在溶酶体中降解，从而控制其在细胞膜上的数量[8]。O’Leary等[9]研究发现，TGFβ2在公猪精液样本中检测到高水平表达，TGFβ是雌、雄生殖道免疫变化的信号传导剂；在产前，糖皮质激素在胎儿肺中TGFβ信号可以诱导并抑制宫内炎症发生[10]。研究还发现，胎儿肺中的产前糖皮质激素可以抑制TGFβ2蛋白的表达[10]；Elhamouly等[11]研究发现，TGFβ2可能对鸡蛋壳的形成具有重要的影响。综上表明，TGFβ2是作为信号传导或调节因子来影响动物繁殖的。
PPP3CA是蛋白磷酸酶3(protein phosphatase 3, PPP3)的催化亚基A，在蛋白磷酸酶3催化(PPP3C)的3种亚基中PPP3CA和PPP3CB广泛存在于真核生物的多种细胞中[12]；而PPP3CC主要存在于睾丸组织中，为睾丸所特有[13]。近年来，多在肌肉组织、骨胳肌上对PPP3CA基因进行相关研究，发现其在控制骨骼肌纤维类中起关键作用，在不同肌肉组织中均有表达[14]，能够抑制成纤维细胞生长因子23(FGF23)的表达，与IGFⅠ共同参与骨骼肌生长发育的调节[15-16]。而与繁殖相关研究的报道较少，Dias等[17]研究发现，PPP3CA基因对性早熟有显著影响。对雌激素信号传导途径和卵母细胞减数分裂具有重要的影响[18]。在精原干细胞减数分裂和精子发生过程中，PPP3CA具有去磷酸化作用[19]。同时PPP3CA也参与了动物胎盘内皮细胞功能的调节[20]。
黔北麻羊是贵州省3大优良地方山羊品种之一，具有繁殖力高的特点，每胎产羔1~3只，产羔率达196%。而繁殖性状是羊的重要经济性状，研究羊繁殖性状的遗传机制是增加产羔数和提高养羊生产效益的重要基础，且一直是该领域研究的焦点。因此，本试验以黔北麻羊为研究对象，通过RT-qPCR技术检测TGFβ2、PPP3CA基因在单、多羔黔北麻羊性腺轴中的表达水平，构建重组质粒，探究超表达TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞的调控影响，为山羊繁殖研究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验样品试验动物来自贵州省习水县富兴畜牧业开发有限公司，根据产羔记录，选取体况健康、4岁左右的单(连续3胎产单羔的为单羔组)、多羔黔北麻羊母羊各3只，采用同期发情处理，待第2次自然发情后4~5 h内进行屠宰，采集子宫、输卵管、垂体、下丘脑和卵巢5个组织，于-80 ℃冰箱保存备用。2岁左右健康母羊屠宰后4~5 h内分离卵巢颗粒细胞并进行培养。
1.2 主要试剂PBS缓冲液、DMEM-F12培养基、澳洲源胎牛血清、0.25%无EDTA胰酶、2×UltraSYBR Mixture、OPTI-MEM、无内毒素质粒提取试剂盒、培养瓶、培养板均购自贵州西宝生物有限公司；氯仿、异丙醇、Cy3试剂盒、无水乙醇均购自贵州鼎国生物有限公司；ELISA试剂盒(E2、P4)购自上海基星生物科技有限公司；HiFi Seript cDNA第一链合成试剂盒购自北京康为试剂；Trizol试剂购自贵州绿盟英创生物科技有限公司；LipofectamineTM 3000 CD购自Invitrogen公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8细胞增殖检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；TGFβ2、PPP3CA羊抗兔(一抗)、二抗均购自北京博奥森生物有限公司；限制性快速内切酶Xho I、BamH I及EcoR I均购自大连宝生物工程有限公司。
1.3 引物设计以β-actin为内参，根据GenBank已公布的山羊BMP4(登录号：NM_001285646.1)、FSHR(登录号：NM_001285636.1)、GnRHR(登录号：XM_005681659.2)、TIMP3(登录号：XM_018048225.1)、TGFβ2(登录号：XM_018048225.1)、PPP3CA(登录号：XM_018048225.1)基因的mRNA序列，采用Primer 5.0软件设计RT-qPCR引物，引物序列信息见表 1，引物由北京擎科生物有限公司合成。
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表 1 RT-qPCR引物信息 Table 1 RT-qPCR primers information |
按照Trizol试剂盒操作步骤(绿盟英创生物科技有限公司)提取黔北麻羊组织总RNA，并采用HiFi Script cDNA第一链合成试剂盒(北京康为试剂生物科技有限公司)进行逆转录。将提取的RNA与cDNA各吸取1 μL，于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，RNA于-80 ℃保存，cDNA于-20 ℃保存备用。
1.5 RT-qPCR检测TGFβ2、PPP3CA基因在黔北麻羊性腺轴组织中的表达水平以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR技术检测TGFβ2、PPP3CA基因在黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑和卵巢5个组织中的表达量。RT-qPCR体系为10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5.5 μL；Forward Primer 0.5 μL；Reverse Primer 0.5 μL；cDNA 1 μL；ddH2O 2.5 μL。RT-qPCR程序：95 ℃预变性105 s；95 ℃变性15 s，62.7 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，40个循环；95 ℃变性5 s；最后从60 ℃到95 ℃按0.5 ℃增值进行熔解曲线分析，荧光采集时间为5 s，每个组织样品及内参基因各设置3孔重复，采用2-△△Ct法处理分析数据。
1.6 TGFβ2、PPP3CA基因真核表达载体构建根据NCBI公布的山羊TGFβ2、PPP3CA基因CDS区序列，在TGFβ2基因序列加上保护碱基及EcoR I、BamH I酶切位点，PPP3CA基因序列也加上保护碱基及Xho I、BamH I酶切位点，送北京擎科生物有限公司进行pEGFP-N3-TGFβ2、pEGFP-N3-PPP3CA重组质粒合成。
1.7 黔北麻羊卵巢颗粒细胞的分离与鉴定1.7.1 卵巢颗粒细胞的分离培养 卵巢颗粒细胞分离与鉴定参考文献[21]，选取2岁母羊，屠宰后迅速采集卵巢，按75%酒精→生理盐水→灭菌含双抗的PBS顺序冲洗3遍，放入预冷的PBS中，低温运回室验室，4~5 h内分离卵巢颗粒细胞。分离细胞在灭菌的超净工作台进行；将卵巢于75%酒精中浸泡25 s，按75%酒精→生理盐水→PBS冲洗3遍，用DMEM-F12培养基将卵巢表面的酒精冲洗干净，放入10%完全培养基中，取无菌的注射器轻轻刺破卵巢表面的卵泡，用培养基反复冲洗，使颗粒细胞完全流入到培养基中；收集培养基于10 mL离心管中静置10 min，取上清于新离心管中，2 000 r·min-1离心10 min，去上清；加2 mL PBS进行洗涤，2 000 r·min-1离心5 min，去上清，重复3次；用10%完全培养基轻轻吹打混匀，分装于培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养，24 h后更换培养基并观察细胞生长状态。
1.7.2 卵巢颗粒细胞的鉴定 取培养24 h的细胞，PBS洗涤3次，每次2 min；4%多聚甲醛4 ℃固定90 min，PBS洗涤3次，每次2 min；5% BSA溶液封闭30 min，不洗；1:100稀释的FSHR抗体，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次2 min，1:100稀释的生物素标记二抗，室温避光孵育30 min，PBS洗涤3次，每次2 min；1:200稀释的SABC-Cy3室温避光孵育30 min，PBS洗干净；在避光的条件下，加入浓度为1 μg·μL-1DAPI，37 ℃避光孵育15 min，PBS洗涤3次，每次2 min，拍照保存。
1.8 重组质粒的转染将细胞分别铺在6和96孔板中用于RNA提取，雌二醇(E2)、孕酮(P4)和细胞凋亡检测，待细胞生长到80%左右的汇合度，更换为无双抗的培养基培养24 h，将pEGFP-N3-TGFβ2、pEGFP-N3-PPP3CA重组质粒转染到细胞，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，倒置荧光显微镜下观察转染情况。
1.9 超表达TGFβ2、PPP3CA基因对雌二醇、孕酮生成的影响收集转染12、24、48 h后的细胞，吸取培养基，用于E2、P4的检测。在待测样品孔中加入40 μL样品稀释液，再加10 μL待测样品，轻轻混匀；加完样品后，用封板膜封板，置于37 ℃孵育30 min，去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s，移去洗涤液，重复5次，拍干；每孔加入50 μL酶标试剂，空白孔不加，37 ℃孵育30 min，甩干，洗涤30 s，洗5次；拍干后加入50 μL显色剂A，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min，再每孔加入50 μL终止液，在酶标仪上进行测定，在450 nm波长处依次测量各孔的吸光度(OD值)，应在15 min内完成酶标仪测定。
1.10 超表达TGFβ2、PPP3CA基因对颗粒细胞增殖和凋亡的影响将细胞铺于96孔板中，待细胞生长到80%左右的汇合度，更换为无双抗的培养基培养24 h，将pEGFP-N3-TGFβ2、pEGFP-N3-PPP3CA重组质粒转染到细胞培养24、48、72 h后，吸取培养基，加入100 μL新培养液，然后再加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃、5% CO2培养箱中培养3 h，于酶标仪上检测450 nm处吸光度(OD值)，分析超表达TGFβ2、PPP3CA基因对细胞增殖的影响。
本试验采用Annexin V-FITC试剂检测细胞凋亡，将细胞培养基吸至合适离心管中，PBS洗涤1次，收集PBS，加入适量的无EDTA胰酶消化细胞，用培养细胞的培养基终止消化；将细胞和洗涤的PBS转移至离心管中，1 000 g离心5 min，弃上清，PBS悬浮并计数；取(5~10)万重悬细胞，1 000 g离心5 min，加入195 μL Annexin V-FITC结合液并轻轻重悬细胞；加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀；加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀；室温孵育20 min，1 000 g离心5 min，取50 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。
1.11 超表达TGFβ2、PPP3CA基因对繁殖相关基因表达的影响将细胞铺于6孔板中，待细胞生长到80%左右的汇合度时，转染pEGFP-N3-TGFβ2、pEGFP-N3-PPP3CA重组质粒，继续培养24 h后，提取细胞RNA，并逆转录为cDNA，采用RT-qPCR检测超表达TGFβ2、PPP3CA基因对TGFβ2、PPP3CA、BMP4、FSHR、GnRHR、TIMP3基因mRNA表达的影响，RT-qPCR体系及程序见1.5。
1.12 数据处理及分析方法采用2-△△Ct法分析mRNA基因在黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢中的差异表达量，用SPSS 20.0软件对mRNA的表达进行单因素方差分析，P < 0.01表示差异极显著，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 TGFβ2、PPP3CA基因在黔北麻羊不同组织中的表达由图 1可知，TGFβ2、PPP3CA基因在黔北麻羊性单、多羔组性腺轴组织中均有表达，比较发现，TGFβ2基因在单、多羔组黔北麻羊垂体组织的表达量最高，在多羔组中的输卵管表达量最低，在单羔组中的子宫表达量最低，比较发现，在输卵管、卵巢中单羔组显著高表达于多羔组(P < 0.05)，垂体中单羔组极显著高表达于多羔组(P < 0.01)；PPP3CA基因在黔北麻羊单羔组中卵巢的表达量最高，子宫最低，多羔组中子宫的表达量最高，垂体最低，比较发现，垂体中单羔组极显著高表达于多羔组(P < 0.01)，卵巢、输卵管、下丘脑中单羔组显著高表达于多羔组(P < 0.05)。
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*表示差异显著(P < 0.05)，**表示差异极显著(P < 0.01)。下同 * indicates the significant difference (P < 0.05), ** indicates the extremely significant difference (P < 0.01). The same as below 图 1 TGFβ2、PPP3CA基因在单、多羔黔北麻羊组织中的表达水平 Fig. 1 The expression levels of TGFβ2 and PPP3CA genes in different tissues of Qianbei Ma goats in monotocous and polytocous groups |
对构建的重组质粒pEGFP-N3-PPP3CA和pEGFP-N3-TGFβ2经限制性内切酶Xho I、BamH I、EcoR I双酶切，结果见图 2，获得一条约4 729 bp的条带和两条分别为1 566、1 329 bp的条带，分别为pEGFP-N3载体和PPP3CA、TGFβ2基因CDS区序列，初步说明真核表达载体构建成功，可进行下一步试验。
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M. DL-15000 DNA marker; 1-2. pEGFP-N3-PPP3CA(1 566 bp); 3-4. pEGFP-N3-TGFβ2(1 329 bp) 图 2 黔北麻羊pEGFP-N3-PPP3CA、pEGFP-N3-TGFβ2真核表达载体双酶切电泳图 Fig. 2 The electropherogram of Qianbei Ma goats pEGFP-N3-PPP3CA and pEGFP-N3-TGFβ2 eukaryotic expression vectors with double enzyme digestion |
2.3.1 卵巢颗粒细胞分离培养 取培养24、48、96 h细胞于倒置荧光显微镜下观察(图 3)，96 h后细胞已生长到90%以上的汇合度，可进行下一步的试验。
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A.培养24 h的细胞；B.培养48 h的细胞；C.培养96 h的细胞 A. Cells cultured for 24 h; B. Cells cultured for 48 h; C. Cells cultured for 96 h 图 3 卵巢颗粒细胞分离培养 Fig. 3 Isolation and culture of ovarian granulosa cells |
2.3.2 卵巢颗粒细胞鉴定 本试验采用免疫荧光法鉴定卵巢颗粒细胞，结果见图 4，FSHR抗体已发生特异性结合，FSHR特异性受体标记阳性细胞呈红色(图 4A)，所有细胞核在DAPI的染色下呈蓝色(图 4B)，且A和B能完全重合(图 4C)，表明培养的原代细胞为黔北麻羊卵巢颗粒细胞。
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图 4 卵巢颗粒细胞鉴定 Fig. 4 Ovarian granulosa cells identification |
将细胞铺于6孔板中，转染培养24 h后，在倒置荧光显微镜下观察转染情况，结果见图 5，图 5A为转染重组TGFβ2质粒，图 5B为转染重组PPP3CA质粒，图 5C为pEGFP-N3空载体，在蓝色光源的激发下卵巢颗粒细胞均发出大量绿色荧光，表明pEGFP-N3与TGFβ2、PPP3CA重组质粒转染成功。
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A.转染重组TGFβ2质粒；B.转染重组PPP3CA质粒；C.pEGFP-N3空载体 A.Transfection of recombinant TGFβ2; B.Transfection of recombinant PPP3CA; C.pEGFP-N3 vector 图 5 pEGFP-N3载体和TGFβ2、PPP3CA基因转染 Fig. 5 pEGFP-N3 vector and TGFβ2, PPP3CA genes transfection |
超表达TGFβ2、PPP3CA基因12、24、48 h后对E2、P4浓度进行检测，结果见图 6，超表达TGFβ2、PPP3CA基因在12 h对E2的分泌具有促进作用，此时E2的含量最高，随着时间加长，E2的生成逐渐降低，其中，12 h超表达TGFβ2能够极显著促进E2生成(P < 0.01)，超表达PPP3CA能够显著促进E2生成(P < 0.05)，但在24和48 h未达到显著水平。超表达TGFβ2基因对P4的生成在24 h具有抑制作用，12和48 h具有促进作用，但都未达到显著水平。超表达PPP3CA基因对P4的生成在12、24 h具有抑制作用，在48 h具有促进作用，但都未达到显著水平。
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图 6 超表达TGFβ2、PPP3CA基因对E2、P4生成的影响 Fig. 6 Effect of overexpression of TGFβ2 and PPP3CA genes on E2 and P4 production |
由图 7可知，在24、48、72 h阶段与对照组(pEGFP-N3空载体组)比较，超表达TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞增殖均具有一定抑制作用，TGFβ2基因在24、72 h达到显著抑制作用(P < 0.05)，PPP3CA基因在24 h达到了极显著抑制作用(P < 0.01)；初步证明TGFβ2、PPP3CA基因能抑制卵巢颗粒细胞的增殖。
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图 7 超表达TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞增殖的影响 Fig. 7 Effect of overexpression of TGFβ2 and PPP3CA genes on the proliferation of ovarian granulosa cells |
分别采用Vehicle和差异基因的重组质粒进行细胞诱导，荧光检测结果见图 8，可知超表达TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞凋亡速率的促进作用大于pEGFP-N3组，表明TGFβ2、PPP3CA基因可促进卵巢颗粒细胞的凋亡。与TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞增殖具有抑制结果相符。
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A.凋亡诱导后细胞；B. Annexin V-FITC染色；A1、B1. Vehicle凋亡诱导组；A2、B2.转染pEGFP-N3空载体对照组；A3、B3.超表达TGFβ2基因试验组；A4、B4.超表达PPP3CA基因试验组 A. The cells after apoptosis induction; B. Annexin V-FITC staining; A1, B1. Vehicle apoptosis induction group; A2, B2. Transfected with pEGFP-N3 empty vector control group; A3, B3. Overexpressing TGFβ2 gene test group; A4, B4. Overexpressing PPP3CA gene test group 图 8 超表达TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞凋亡的影响 Fig. 8 Effect of overexpression of TGFβ2 and PPP3CA genes on apoptosis of ovarian granulosa cells |
转染培养24 h后，提取细胞RNA，并逆转录为cDNA，采用RT-qPCR技术检测TGFβ2、PPP3CA基因在卵巢颗粒细胞的表达，以及对TGFβ2、PPP3CA、BMP4、FSHR、GnRHR、TIMP3基因mRNA表达的影响。结果见图 9，转染TGFβ2、PPP3CA基因组mRNA的表达水平极显著高于pEGFP-N3空载体组(P < 0.01)，表明转染成功。对BMP4、FSHR、GnRHR、TIMP3基因mRNA表达水平检测发现，其在pEGFP-N3空载体组的表达极显著高于转染TGFβ2、PPP3CA基因组(P < 0.01)，说明超表达TGFβ2、PPP3CA基因对繁殖相关基因具有极显著抑制作用。
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图 9 超表达TGFβ2、PPP3CA基因及对繁殖相关基因表达的影响 Fig. 9 Overexpression of TGFβ2 and PPP3CA genes and their effects on the expressions of reproduction-related genes |
本研究发现，TGFβ2基因单羔组中输卵管、卵巢显著高表达于多羔组(P < 0.05)，单羔组中垂体极显著高表达于多羔组(P < 0.01)；PPP3CA基因在垂体中单羔组极显著高表达于多羔组(P < 0.01)，卵巢、输卵管、下丘脑中单羔组显著高表达于多羔组(P < 0.05)，TGFβ2、PPP3CA基因在单、多羔黔北麻羊卵巢组织中的表达趋势与转录组测序结果一致。有研究表明，动物卵巢内的颗粒细胞和卵泡膜细胞也会分泌TGFβ2，调控卵泡的发育，并在卵巢功能的调节中起重要作用[22]。在大鼠的卵巢、卵泡中都有TGFβ2的表达，并且在维持和激活原始卵泡中具有浓度的依赖性[23-24]；在窦前卵泡中表达水平低[25]。Fernandes-Silva等[26]研究发现，TGFβ2在鸡的胚胎期肺发育过程中就有表达。Dadarwal等[27]研究发现，奶牛产仔后29~35天TGFβ2在子宫内膜的表达极显著提高(P < 0.01)，并且发现，TGFβ2表达减少是子宫内膜炎恢复的指标。而PPP3CA基因对动物繁殖调节的报道较少，如在绵羊的胎盘中发现，抑制PPP3CA可以增强血管内皮生长因子诱导的AKT1，但不会改变VEGF和FGF2刺激的细胞增殖[28]。通过转录组测序发现，PPP3CA对山羊繁殖力有重要的影响[18]。研究表明，PPP3CA在雄性动物中，对减数分裂和减数分裂后的精子发生过程具有重要作用[29]。
在卵巢颗粒细胞中研究发现，超表达TGFβ2、PPP3CA基因抑制卵巢颗粒细胞中FSHR、GnRHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达，促进颗粒细胞凋亡，抑制其增殖，并且也能够显著促进E2的分泌，但对P4分泌无显著影响。在卵巢成熟过程中，FSHR在类固醇生成和卵泡增殖调控中起重要作用，如FSHR不足动物很可能会不育[30]；降低FSHR表达水平导致卵母细胞数量下降，卵泡减少[31]；而E2浓度显著增加(P < 0.05)会导致FSHR mRNA水平显著降低[32]。相关研究表明，GnRHR可刺激垂体LH和FSH的合成和分泌，也可以调节卵母细胞成熟、排卵、黄体形成以及激素分泌[33-34]。但是E2、P4对GnRHR基因mRNA的表达无显著影响[35]。有研究发现，BMP4基因能够促进卵泡的生长，并且能促进FSH诱导E2的合成，在卵巢中发挥旁/自分泌调节作用，调节卵泡发育[36]。其次，BMP4可以抑制P4的生成，不会抑制E2的生成[37]。而E2、LH也可调节TIMP3基因的表达[38]，但TIMP3基因的表达因E2作用时间的长短而变化，随着时间增加，TIMP3基因表达量会降低[39]。综上表明，TGFβ2、PPP3CA基因抑制了繁殖相关基因的表达，推测该基因会间接降低黔北麻羊的繁殖力，为研究黔北麻羊繁殖相关候选基因提供有价值的理论依据。
4 结论本研究成功构建了TGFβ2、PPP3CA基因真核表达载体，并转染至卵巢颗粒细胞，荧光定量结果显示，超表达TGFβ2、PPP3CA基因抑制了繁殖相关基因BMP4、FSHR、GnRHR、TIMP3的表达，促进E2生成，抑制细胞增殖，提示，TGFβ2、PPP3CA基因对山羊繁殖相关基因表达有一定的影响。为进一步研究TGFβ2、PPP3CA基因对黔北麻羊产羔性状影响提供基础数据。
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