2. 山西省高等创新研究院, 太原 030032;
3. 大同海关技术中心, 大同 037000;
4. 大同市种猪场, 大同 037000
, WU Yiqi1, CHENG Zhimin2, YANG Xiaowei3, LI Meng1, YANG Yang1, LIU Hong4, GAO Pengfei1, CAI Chunbo1, GUO Xiaohong1, LI Bugao1, CAO Guoqing1
2. Shanxi Academy of Advanced Research and Innovation, Taiyuan 030032, China;
3. Datong Customs Technology Center, Datong 037000, China;
4. Datong Pig Breeding Farm, Datong 037000, China
细胞增殖是细胞的一项重要生理过程，是生物体生长、发育和遗传的基础。细胞增殖是一个精细复杂的过程，涉及到许多分子、通路等的相互作用。细胞周期和凋亡调节因子1(cell-cycle and apoptosis regulator 1, CCAR1)是通过反义依赖性功能基因敲除策略鉴定的一种新的细胞增殖、凋亡信号调节因子[1-2]，在人、小鼠、大鼠、犬、黑猩猩、家禽、蜜蜂和秀丽隐杆线虫等多个物种中表达[3]，具有DNA结合结构域、蛋白结合结构域以及RNA结合结构域(S1-like)[4-5]。探究CCAR1基因的结构和功能，揭示其对细胞增殖的影响和作用机制，阐明其对个体生长发育的影响，将为CCAR1基因作为分子标记应用于畜禽分子育种提供重要依据。研究发现，CCAR1在Wnt信号通路中作为一种转录共激活分子，能够协助开关分子β-catenin在信号通路中发挥作用[6-9]，参与一些信号的扩散和转移[10]。如在HT29结肠癌细胞中，CCAR1与β-catenin共激活其下游的靶基因，促进结肠癌细胞的生长[11]。此外，CCAR1还可以作为一个关键的细胞内转导的增殖或凋亡信号分子响应于不同的信号途径。CCAR1能够参与到Caspase泛素化蛋白酶途径，与APC/C结合，阻滞G2/M细胞周期[12]；CCAR1通过结合肿瘤抑制基因p53，对细胞周期产生正调控作用[13]；CCAR1还能够与辅活化因子p160结合，形成复合物，然后与活化激素核受体结合，激活目标基因的转录，对雌激素诱导的基因表达和人乳腺癌细胞的雌激素依赖性生长有重要作用[14]。CCAR1可以调节阿霉素依赖性DNA损伤诱导的细胞凋亡，其发挥作用依赖于肿瘤抑制基因p53的共激活[15]，若撤去血清生长因子或表皮生长因子受体则会导致CCAR1基因的表达升高。CCAR1能够以类维生素A依赖的方式触发细胞凋亡信号的传导[16]，也可通过激活半胱天冬酶-9(caspase 9)抑制人乳腺癌细胞生长并导致细胞凋亡[17]。总之，CCAR1能够通过多种信号途径影响细胞的增殖或凋亡过程。
目前，有关CCAR1基因的研究主要集中在其对癌症引发的机制及治疗作用上[18]。在胃腺癌组织中，CCAR1表达的异常升高与胃腺癌的发生密切相关[19]。CCAR1功能模拟物CFMs能够通过促进细胞凋亡而抑制癌细胞的生长[20]。而有关猪CCAR1基因的研究未见报道。本研究采用RT-PCR技术扩增猪CCAR1基因完整CDS序列，采用细胞免疫荧光技术对CCAR1进行亚细胞定位，采用qRT-PCR技术检测猪CCAR1基因的表达谱和发育性表达规律，采用CRISPR/Cas9系统、Western blot及CCK8等技术探究CCAR1基因对细胞增殖的影响。本研究将为揭示猪CCAR1基因的结构和功能及在猪生产中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 试验动物和样品采集 马身猪(Mashen pig, 中国地方猪种)和大白猪(Large White pig, 引进商业猪种)来源于山西省大同市种猪场。1日龄马身猪和大白猪各6头，屠宰后，立即采集心、肝、背部皮下脂肪、脾、肾、小肠、小脑以及背最长肌等组织，用于CCAR1基因的CDS区扩增及表达谱分析；初生、3月龄、6月龄的马身猪和大白猪，每个品种每阶段各6头，屠宰后，采集背最长肌和腰大肌，用于CCAR1基因发育性表达规律分析。所采集的样品保存在液氮中带回实验室，置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.1.2 细胞系和质粒 PK15细胞和CRISPR/Cas9质粒均为山西农业大学动物遗传育种与繁殖博士点实验室保存。
1.1.3 主要试剂 固相RNAase清除剂购自Andybio公司；TRIZOL® Reagent购自Life Technologies公司；PrimeScript®RT Master Mix、SYBR® Premix Ex TaqTM II65、感受态细胞购自TaKaRa公司；2×ES Taq MasterMix购自康为世纪公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；低糖DMEM培养基、CCK8试剂盒、2%BSA山羊血清购自博士德生物工程有限公司；DNase /RNase-Free Water、TritonX-100、DAPI溶液、胰酶、青链霉素混合液购自索莱宝公司；RIPA裂解液购自碧云天公司；兔源CCAR1一抗购自Bioworld公司；兔源β-actin一抗、荧光二抗Goat Anti-Rabbit IgG/Alexa Fluor 594购自博奥森公司；多聚甲醛购自Biotopped公司；限制性内切酶BsmB I、T4 DNA连接酶购自NEB公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司；lipo2000转染试剂购自Invitrogen公司；引物合成与测序由上海生工生物工程有限公司完成；无水乙醇、氯仿、异丙醇等购自天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 采用TRIZOL® Reagent试剂盒提取各组织和细胞的总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。将提取的总RNA用核酸蛋白测定仪(ND-1000，Gene Company Limited)测定其纯度及浓度，OD260 nm/OD280 nm为1.8~2.0的总RNA用于后续研究。采用PrimeScript®RT Master Mix试剂盒将RNA反转录成cDNA。合成的cDNA于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 猪CCAR1基因CDS区的扩增及生物信息学分析 猪CCAR1基因CDS区较长，且GenBank数据库中只有预测序列，经多次试验，均未能通过一次反应扩增出全长CDS序列，因此分段设计引物(表 1)，进行扩增并测序，再通过序列拼接获得完整CDS区序列。扩增体系10 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，2×ES Taq MasterMix 5 μL，ddH2O 2 μL；反应程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。反应完成后，用1%的琼脂糖凝胶检测扩增产物，并将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，结果用Sequencher软件进行拼接，获得猪CCAR1基因的全长CDS序列。
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表 1 RT-PCR引物序列、扩增位置、产物长度 Table 1 RT-PCR primer sequences, amplification locations and product lengths |
采用NCBI在线软件CD-search (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)预测CCAR1蛋白保守结构域，利用在线软件TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白质跨膜结构进行预测，利用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点，利用PSORT Ⅱ Prediction软件(https://psort.hgc.jp/form2.html)预测CCAR1的亚细胞定位。
1.2.3 猪CCAR1基因亚细胞定位 用24孔细胞培养板培养PK15细胞，当细胞生长铺满培养板60%左右时，用PBS清洗细胞3次×5 min，再加入1 mL 4%的多聚甲醛固定30 min，弃多聚甲醛，PBS清洗3次×5 min；加0.1% TritonX-100 500 μL，作用30 min，弃液体，PBS清洗3次×5 min；加2%BSA山羊血清500 μL，封闭1 h；弃去封闭液，勿洗，加CCAR1一抗(1:1 000稀释)300 μL，4 ℃过夜孵育；弃一抗，PBS清洗3次×5 min，加500 μL荧光二抗(1:20 000稀释)，在暗处作用1 h，PBS避光清洗3次×5 min；加100 μL DAPI水溶液复染细胞核5 min，PBS清洗2次×5 min。荧光显微镜(EVOS FL Auto，美国)下观察并拍照。
1.2.4 猪CCAR1基因表达特性检测 采用qRT-PCR技术检测1日龄马身猪和大白猪不同组织中CCAR1基因的表达谱以及在初生、3月龄、6月龄等阶段腰大肌和背最长肌中的时序性表达特征。在NCBI数据库中检索猪CCAR1基因序列(XM_021072498.1)，利用在线网站Primer-BLAST设计引物(表 2)，由生工生物工程有限公司合成。反应体系为10 μL：2×UItra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.15 μL，ROX 0.2 μL，Template cDNA 2 μL，RNase-free ddH2O 2.5 μL。反应条件：95 ℃预变性20 s；95 ℃变性20 s，60 ℃退火及延伸20 s，36个循环。18S为内参基因，每个样本做3个技术重复。
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表 2 qRT-PCR引物序列 Table 2 The sequences of qRT-PCR primers |
1.2.5.1 sgRNA的设计与合成 根据NCBI数据库中猪CCAR1基因序列(登录号：XM_021072498.1)，利用在线网站http://crispr.dbcls.jp/进行sgRNA的设计。选择得分较高、特异性较强的3条sgRNA序列，分别命名为sg1、sg2和sg3(表 3)，在正链的5′端添加accg，负链的5′端添加aaac，使其能够与线性化的Cas9敲除载体连接。
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表 3 sgRNAs序列 Table 3 The sequences of sgRNAs |
1.2.5.2 Cas9-CCAR1敲除载体的构建与鉴定 1) sgRNA退火连接。将合成的sgRNA序列溶解并稀释至10 μmol·L-1进行退火连接，反应体系：10×Buffer 2 μL，sgRNA上、下游引物各2 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序：93 ℃ 5 min，然后每分钟降1 ℃，降至25 ℃，共68个循环，4 ℃保存备用。2)Cas9质粒线性化。使用BsmB I酶切Cas9载体骨架，1%琼脂糖凝胶电泳检测，之后切胶回收线性化载体。酶切反应体系：10×Buffer 1 μL，质粒DNA 500 ng，BsmB I酶(10 000 U·mL-1)1 μL，ddH2O补足至10 μL。酶切反应条件：55 ℃，2 h；80 ℃，10 min。3)sgRNA退火产物与线性Cas9载体连接。连接反应体系：500 ng线性Cas9质粒，1 μL sgRNA退火产物，T4 DNA连接酶solutionⅠ 5 μL，ddH2O补足至10 μL。连接反应条件：4 ℃，过夜。4)连接产物转化至感受态细胞。转化反应体系：5 μL连接产物，50 μL感受态细胞。转化反应条件：将连接产物与感受态细胞混匀，冰上静置30 min；42 ℃ 90 s；冰上放置5 min。5)转化产物进行涂板，37 ℃过夜培养，隔天挑取单菌落摇菌，提取质粒进行测序鉴定。
1.2.5.3 质粒提取和细胞转染 经测序鉴定构建成功的重组质粒命名为Cas9-sg1CCAR1(SG1)、Cas9-sg2CCAR1(SG2)和Cas9-sg3CCAR1(SG3)，使用去内毒素质粒提取试剂盒提取3种质粒。
PK15细胞接种至10 cm培养皿中，使用含10%FBS和1%双抗的低糖DMEM培养基在37 ℃，5%CO2条件下进行培养。将细胞进行消化计数，接种至6孔板或12孔板中，到细胞生长汇合至40%~50%即可进行转染。准备溶液A：2 500 ng质粒DNA(≥1 000 ng·μL-1)溶于150 μL基础培养基中，混匀；溶液B：脂质体(Lipofectamine 2000，1 mg·mL-1)6 μL溶于150 μL无血清培养基中，混匀，静置5 min。将上述A、B溶液轻柔混合，室温下静置15 min。将细胞用基础培养基清洗1~2遍，然后将混好的溶液加入至细胞板中，6 h后更换为完全培养基，过夜培养后在显微镜下观察转染效率。设定转染空质粒为阴性对照组(negative control, NC)，转染SG1、SG2和SG3重组质粒为敲除试验组SG1、SG2及SG3。
1.2.5.4 qRT-PCR 在转染后48 h收集细胞进行总RNA的提取并反转录为cDNA。以18 S为内参基因，检测NC组与敲除组SG1、SG2和SG3细胞中CCAR1基因及SG3组β-catenin、Mki67、Caspase3、Parp2、C-myc等基因的相对表达量。反应体系10 μL：SYBR 5 μL，Rox 0.2 μL，上、下游引物各0.15 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 2.5 μL。反应条件：95 ℃预变性20 s；95 ℃变性20 s，60 ℃退火及延伸20 s，36个循环。结果根据2-ΔΔCT法计算，引物序列见表 2。
1.2.5.5 Western blot 提取阴性对照组和敲除组细胞总蛋白，利用核酸蛋白浓度测定仪(ND-1000，Gene Company Limited)测定蛋白浓度。取200 ng蛋白上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，采用湿转法进行转膜，5%封闭蛋白粉室温封闭1 h，一抗采用1:1 000稀释，4 ℃孵育过夜。隔天回收一抗，PBST洗膜3次，加入荧光二抗，避光室温孵育1 h，洗膜后使用LICOR仪器(ODYSSEY CLx，Gene Company Limited)曝光，使用仪器自带软件Image Studio计算分析条带光密度值。
1.2.5.6 CCK8检测细胞增殖 将细胞消化计数后接种至96孔细胞板中，每组设置6个重复，待细胞汇合至合适浓度时按照之前方法进行转染。在转染后的24、48、72和96 h分别进行检测，每孔加入10 μL CCK8试剂，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养1 h，使用酶标仪(SynerGyH1，BioTek)检测各孔在450 nm波长处的吸光度。
1.3 统计与分析所得数据均采用GraphPad Prism5软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，当P < 0.05时认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 猪CCAR1基因CDS区扩增及生物信息学分析本研究采用RT-PCR方法分段扩增猪CCAR1基因CDS区，结果见图 1，扩增产物大小与预期结果一致。PCR产物直接测序后进行序列拼接，获得猪CCAR1基因完整CDS区，长度为3 459 bp，已提交GenBank，登录号为MH301308.1。
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M.DNA相对分子质量标准；1、2. CCAR1-1 PCR产物；3、4. CCAR1-2 PCR产物；5、6. CCAR1-3 PCR产物；7、8. CCAR1-4 PCR产物；9、10. CCAR1-5 PCR产物；11、12. CCAR1-6 PCR产物；13、14. CCAR1-7 PCR产物；15、16. CCAR1-8 PCR产物；17、18. CCAR1-9 PCR产物 M.DNA 1000 ladder; 1, 2. CCAR1-1 PCR product; 3, 4. CCAR1-2 PCR product; 5, 6. CCAR1-3 PCR product; 7, 8. CCAR1-4 PCR product; 9, 10. CCAR1-5 PCR product; 11, 12. CCAR1-6 PCR product; 13, 14. CCAR1-7 PCR product; 15, 16. CCAR1-8 PCR product; 17, 18. CCAR1-9 PCR product 图 1 RT-PCR扩增结果 Fig. 1 RT-PCR results |
经预测，CCAR1蛋白包括5个保守结构域，分别为S1-Like结构域、SPOR super结构域、DBC1结构域、SAP结构域以及SMC_N super结构域(图 2)；跨膜结构预测发现该蛋白不属于跨膜蛋白(图 3)；磷酸化位点预测结果表明，CCAR1蛋白存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸共3个磷酸化位点，发生在3个位置上磷酸化修饰的氨基酸残基数分别为36、30和6(图 4)；亚细胞定位结果表明，73.9%定位于细胞核，13.0%定位于细胞骨架，8.7%定位于线粒体，4.3%定位于细胞质膜(图 5)。
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图 2 CCAR1保守功能域预测结果 Fig. 2 The prediction results of conservative function domains of CCAR1 |
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图 3 CCAR1跨膜预测结果 Fig. 3 The prediction results of transmembrane of CCAR1 |
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图 4 CCAR1磷酸化位点预测结果 Fig. 4 The prediction results of phosphorylation sites of CCAR1 |
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图 5 CCAR1亚细胞定位预测结果 Fig. 5 The prediction results of subcellular localization of CCAR1 |
为确定CCAR1在细胞中的表达定位，本研究采用免疫荧光技术在PK15细胞系中检测其亚细胞定位，结果表明，CCAR1蛋白在细胞质和细胞核中均有表达(图 6)。
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CCAR1蛋白为红色荧光；细胞核用DAPI染色，为蓝色荧光；Merge为叠加图 CCAR1 protein appeared in red; Cell nuclei were stained with DAPI and appeared in blue; Merge was superposition graph 图 6 CCAR1在PK15细胞中的亚细胞定位 Fig. 6 Subcellular localization of CCAR1 in PK15 cells |
2.3.1 不同组织CCAR1基因mRNA表达谱分析 本研究采用qRT-PCR方法检测了CCAR1基因在不同组织中的表达规律，结果表明(图 7)，在马身猪中，CCAR1基因mRNA在心、肝、皮下脂肪、脾、肾、小肠、小脑以及肌肉等组织中均有表达，其中，在肾中的表达量最高，极显著高于其他组织(P < 0.01)，其次是小肠和小脑组织，在脾、肝、肌肉中呈中度表达，在心和皮下脂肪中表达量最低。大白猪不同组织CCAR1基因表达谱与马身猪基本相似，在肾和小肠中表达量最高，在肝、脾、小脑、肌肉组织中呈中度表达，在心和皮下脂肪中低表达。
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柱状图的数值为“平均数±标准误”。相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)。下同 Values of histogram are the "mean±standard error". The same letter represents no significant difference(P>0.05), different lowercase letters represent significant difference (P < 0.05), different capital letters represent extremely significant difference (P < 0.01). The below is the same 图 7 1日龄马身猪和大白猪8个组织中CCAR1基因mRNA的相对表达量 Fig. 7 The mRNA relative expression of CCAR1 gene in 8 tissues of Mashen and Large White pigs of 1-day-old |
2.3.2 不同发育阶段肌肉组织中CCAR1基因的表达规律 对大白猪和马身猪在初生、3月龄、6月龄等阶段腰大肌(psoas muscle)和背最长肌(longissimus dorsal)中CCAR1基因mRNA表达量进行了检测，结果发现(图 8)，大白猪腰大肌中，CCAR1基因的表达量在6月龄时最高，极显著高于初生和3月龄(P < 0.01)，而初生和3月龄的表达量差异不显著(P>0.05)；大白猪背最长肌中，CCAR1基因的表达量在3月龄最高，极显著高于初生和6月龄(P < 0.01)，初生时的表达量显著高于6月龄(P < 0.05)。马身猪腰大肌中，CCAR1基因的表达规律与大白猪不同，3月龄时表达量最高，极显著高于6月龄和初生阶段(P < 0.01)，6月龄的表达量显著高于初生阶段(P < 0.05)；马身猪背最长肌中，CCAR1基因的表达量也是3月龄时最高，显著高于初生时(P < 0.05)，但与6月龄时的表达量差异不显著，6月龄的表达量显著高于初生阶段(P < 0.05)。
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图 8 马身猪和大白猪不同发育阶段腰大肌和背最长肌中CCAR1 基因mRNA相对表达量 Fig. 8 The relative expression of CCAR1 mRNA in psoas muscle and longissimus dorsal muscle at different developmental stages in Mashen and Large White pigs |
2.4.1 Cas9-CCAR1敲除载体的构建与细胞转染 将合成的sgRNA序列退火后与经BsmB I线性化的Cas9质粒连接，连接产物转化至感受态细胞，经涂板、培养、单菌落摇菌后，提取质粒进行测序鉴定，结果表明3条重组质粒均构建成功(图 9)。
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阴影部分为sgRNA序列 The shadow parts are sgRNAs sequence 图 9 重组质粒部分测序结果 Fig. 9 Partial sequencing results of recombinant plasmids |
空质粒以及重组质粒转染PK15细胞12 h后即可进行观察。在荧光显微镜下试验组和阴性对照组均可以观察到绿色荧光(图 10)，转染效率为20%~ 30%，表明质粒转染成功，可进行下一步试验。
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图 10 质粒转染PK15细胞荧光下视野 Fig. 10 Plasmid transfected PK15 cells in microscopy under fluorescent field |
2.4.2 不同重组质粒的敲除效果比较 在PK15细胞中转染重组质粒后，继续培养48 h，收集细胞，分别提取细胞RNA和蛋白质，进行qRT-PCR和Western blot检测。与NC组相比，SG1和SG3组CCAR1基因在mRNA和蛋白水平上的表达量均呈现极显著下降(P < 0.01)，SG2组CCAR1基因的表达量呈显著下降(P < 0.05，图 11)。
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A.qRT-PCR检测CCAR1基因的干扰效率；B. Western blot检测CCAR1蛋白的干扰效果。*.P < 0.05, **.P < 0.01，下同 A. The interference efficiency of CCAR1 gene by qRT-PCR; B. The interference efficiency of CCAR1 protein by Western blot.*.P < 0.05, **.P < 0.01, the same as below 图 11 转染SG1、SG2和SG3质粒后PK15细胞中CCAR1基因mRNA和蛋白的表达情况 Fig. 11 mRNA and protein expression of CCAR1 gene in PK15 cell transfected with SG1, SG2, and SG3 plasmids |
2.4.3 CCAR1基因敲除后对细胞增殖的影响 使用CCK8试剂盒检测细胞增殖，结果见图 12。由图 12可以看出，在PK15细胞中，与NC组相比，SG3试验组对细胞增殖的抑制作用最为明显，SG1试验组次之，最后是SG2试验组。但在各试验组中，在48 h及以后，均对细胞增殖产生了极显著抑制(P < 0.01)，表明CCAR1基因敲除后对细胞增殖产生抑制作用。
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图 12 转染SG1、SG2和SG3质粒后PK15细胞的增殖能力 Fig. 12 Cell proliferation ability of PK15 cell transfected with SG1, SG2, and SG3 plasmids |
2.4.4 转染SG3敲除载体对细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响 在PK15细胞中，转染SG3后，细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降(P < 0.05)，凋亡标记基因Parp2的表达量极显著上升(P < 0.01)，而凋亡标记基因Caspase3和Wnt通路核心蛋白β-catenin的表达量未见显著变化，Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降(P < 0.05，图 13)。
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图 13 PK15细胞中转染SG3对C-myc、Parp2、β-catenin、Mki67、Caspase3基因表达的影响 Fig. 13 The mRNA expressions of C-myc, Parp2, β-catenin, Mki67 and Caspase3 genes in PK15 cell transfected with SG3 |
CCAR1基因是细胞中比较保守的基因，在个体发育过程中，其表达量一直处于稳定增长的趋势，说明该基因在个体发育过程中具有重要作用。
贾宝林[2]对中国卤虫CCAR1的细胞定位进行了研究，PSORT软件预测发现，CCAR1中有30.4%位于细胞质中，17.4%位于细胞核中，21.7%位于线粒体中，13%位于内质网中，其余位于高尔基体及囊泡分泌系统等，随后的细胞免疫荧光试验也表明，CCAR1遍布细胞质内[21]，各细胞器均有分布。本研究中，在PK15细胞中，CCAR1在细胞质和细胞核中均有表达，表明CCAR1既可以作为转录共激活分子，在细胞核中调控靶基因的表达，又可以作为信号分子在细胞质中扩散和响应细胞信号，参与各种细胞过程。
本研究中，CCAR1基因在马身猪和大白猪的心、肝、皮下脂肪、脾、肾、小肠、小脑以及肌肉等组织中均有表达，且在初生、3月龄、6月龄等阶段的腰大肌和背最长肌中也均有表达，表明该基因参与绝大多数细胞的生命活动，在个体发育过程中有重要作用。本研究结果与贾宝林[2]对中国卤虫的研究结果一致，该结果表明，CCAR1在卤虫的头、胸、腹以及附肢、卵囊等器官和组织内均有表达，且在卤虫的整个发育时期内都保持着较高的表达量，其表达量变化趋势与卤虫的生长发育有一定的关联性[2]。本研究中，不同猪种不同肌肉组织中CCAR1基因的发育性表达规律不同，大白猪背最长肌、马身猪腰大肌和背最长肌中CCAR1基因的表达量均表现为3月龄时最高，随后维持稳定或下降；而大白猪腰大肌中CCAR1基因的表达量在6月龄达到最高。这种差异可能与品种与肌肉类型的互作有关，需要进一步深入研究。
CRISPR/Cas9系统是目前应用最广泛的基因组编辑系统[22-24]，该系统通过向导RNA和靶标DNA的碱基互补配对实现对基因组DNA的特异性切割[25-27]，已应用于多种动物基因组靶向修饰的研究中[28-33]。Bi等[34]利用CRISPR/Cas9技术得到了MSTN基因单敲除猪，检测发现，MSTN的表达量下降了大约50%。Zhou等[35]用CRISPR/Cas9系统成功获得PINK1和PARK2两个基因同时敲除猪及酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)双染色体突变个体，为研究白化病提供了动物模型。本研究利用在线网站http://crispr.dbcls.jp/针对CCAR1基因的CDS区进行sgRNA的设计，选择了3条得分较高的序列作为打靶序列进行敲除载体的构建，结果表明，在PK15细胞中，SG1和SG3试验组CCAR1基因mRNA和蛋白质表达水平极显著下降(P < 0.01)，SG2组CCAR1基因mRNA和蛋白质表达水平显著下降(P < 0.05)，表明构建的3个敲除载体均具有降低CCAR1基因表达水平的作用，综合来看，SG3敲除效果最好且最稳定。
细胞增殖是细胞生长发育的基础[36-37]，研究表明，CCAR1基因对细胞增殖存在一定的调控作用。CCAR1是细胞核周的磷酸化蛋白，是Wnt/β-catenin信号通路的一个新的组成元件，可作为类固醇/甲状腺细胞核受体、β-catenin、(APC/C)E3连接酶和抑癌基因p53等的共激活因子，调节细胞生长和凋亡等生物学过程[2]。目前有关CCAR1的研究主要集中在癌症与癌细胞上。在167个肝细胞癌案例中，共观察到149个案例存在高的CCAR1蛋白表达以及微血管侵犯、肝内转移等[38]。在人类乳腺癌细胞中，CCAR1最初被鉴定为一种由维甲酸(CD437)和化疗药物诱导凋亡信号中所必需的蛋白质[16]。结肠癌细胞系中，在依赖于β-catenin存在的情况下，CCAR1与Wnt信号通路靶基因的启动子结合激活Wnt靶基因，敲除CCAR1会抑制Wnt靶基因的表达并且抑制结肠癌细胞系的生长[17]。本研究中，转染CCAR1敲除载体48 h后，PK15细胞的增殖能力明显下降(P < 0.01)，且转染SG3后，细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降(P < 0.05)，Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降(P < 0.05)，这与前人研究中敲除CCAR1抑制Wnt靶基因表达的结论一致。在对胃癌细胞株AGS和MKN28的研究中，使用慢病毒表达载体shRNA沉默CCAR1的表达后，内源CCAR1的水平降低，显著影响Wnt信号转导的靶基因如AXIN2、Lgr5、CD44、survivin和C-myc的表达[10]。可见，CCAR1基因不仅在癌细胞中调控细胞增殖，在PK15细胞中，也可以通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的作用而影响细胞的增殖。
CCAR1似乎是调节细胞生长和细胞凋亡的双相调节因子。Ou[11]研究表明，在HT29结肠癌细胞中，CCAR1能够与β-catenin相互作用，增强β-catenin下游靶基因的转录活性，介导结肠癌细胞的生长；减少CCAR1或β-catenin的表达，不影响结肠癌细胞生长，只能够降低结肠癌细胞的克隆形成能力。本研究中，在PK15细胞中，通过CRISPR/Cas9技术减少CCAR1表达的同时，也显著降低了Wnt靶基因C-myc及细胞增殖标记基因Mki67的表达，并对细胞增殖产生了显著的抑制作用。此外，转染SG3前后，虽然凋亡标记基因Caspase3的表达在PK15细胞中未发生显著变化，但Parp2的表达量却极显著上升(P < 0.01)。Parp2是细胞凋亡核心成员Caspase的切割底物[39]，在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用[40]，可作为细胞凋亡的标志。本研究结果表明，在PK15细胞中，敲除CCAR1基因不仅抑制细胞的增殖，还有可能会促进细胞凋亡，这与Chang等[10]研究中通过慢病毒表达载体shRNA沉默CCAR1的表达后，不仅显著抑制Wnt信号通路靶基因的表达而抑制细胞增殖，而且导致AGS和MKN28细胞产生凋亡的结果相一致。
4 结论本研究成功获得了猪CCAR1基因的完整CDS区序列(MH301308.1)，长3 459 bp，定位于细胞质和细胞核中；CCAR1基因在马身猪和大白猪所检测的组织及不同月龄的肌肉组织中均有表达；采用CRISPR/Cas9技术敲低CCAR1基因的表达后，PK15细胞的增殖能力受到显著抑制，CCAR1基因通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的作用而影响细胞增殖，在个体生长发育过程中有重要作用。
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