, ZHANG Xingxing, WANG Limin, HUANG Xin, HAN Mengli, ZHANG Yiyuan, GUO Yanhua, TANG Hong, HE Yanhua, ZHONG Fagang, ZHOU Ping
肠道作为大量微生物存在的栖息地，不仅形成了复杂的肠道微生态系统[1]，而且作为宿主生命活动的有机组成部分，对宿主的生长发育具有重要的影响[2-3]。大量研究表明，哺乳动物肠道内微生物结构和组成与宿主、群落种间以及种内相互作用，形成具有一定稳定性的微生物菌群落[4-5]。16S rRNA基因是目前识别肠道微生物群落的重要依据，采用IIlumina HiSeq高通量测序技术对16S rRNA基因进行测序，可了解肠道微生物的多样性及其丰度，并对整个细菌属的功能作用进行评价[6]。
随着转基因生物技术育种的迅速发展，转基因安全问题备受社会与业内关注[7]。在地理环境、饲草料种类和季节气候等同质状况下，测定转基因与非转基因超细毛羊的肠道微生物群落结构及分布[8]，可揭示IGF-1转基因超细毛羊种群与非转基因羊之间的系统进化上与其肠道微生物的系统多样性结果是否有差异[9]。
目前暂未见关于转基因羊和非转基因羊肠道菌群多样性及结构差异的研究[10]。本研究在同一羊场随机选取转基因阳性羊组(GP组)、转基因阴性羊组(GN组)与非转基因超细毛羊组(NG组)共113只供试羊，取直肠粪样，应用IIlumina HiSeq高通量测序技术测定113份羊肠道粪便样本中细菌的16S rRNA V3+V4变异区序列，比较分析转基因超细毛羊与非转基因羊肠道粪样细菌群落组成[6]。旨在通过转基因羊与非转基因羊肠道菌群组成结构和多样性分析，探索转IGF-1基因羊生物安全及环境安全性。
1 材料与方法 1.1 供试材料1.1.1 供试羊分组 依IGF-1基因检测验证结果[11]，对新疆农垦科学院实验羊场经体细胞克隆技术获得并扩繁的包括原代、F1代和F2代转基因阳性组(GP组)41只(其中转基因阳性母羊组(GPF)24只，转基因阳性公羊组(GPM)17只)，扩繁的F1代、F2代经检测转IGF-1基因呈阴性的半同胞后代组成转基因阴性组(GN组)43只(其中转基因阴性母羊组(GNF)25只，转基因阴性公羊组(GNM)18只)，同场饲养的超细毛非转基因组(NG组)29只(其中非转基因母羊组(GNF)18只，非转基因公羊组(NGM)11只)，见表 1。
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表 1 供试羊样品分组 Table 1 Grouping of sheep samples |
1.1.2 日粮组成 参照Nutriment Requirment of Small Ruminants(2007)设计配制基础饲粮(表 2)，TMR混合搅拌后每日10:00和18:00各饲喂1次，悬挂舔食砖，自由采食，自由饮水。
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表 2 基础饲粮组成和营养水平 Table 2 Composition and nutrient levels of basic diets |
1.1.3 直肠粪样采集 在新疆农垦科学院实验羊场，于2017年11月29日采集113只供试羊直肠粪便样本，装入无菌聚乙烯管并做好标记，置于液氮中带回实验室，于-80 ℃冰箱冷冻保存。
1.2 粪便样本DNA提取与检测使用粪便基因组提取试剂盒(TIANamp Stool DNA Kit，天根DP328，中国)按照试剂盒说明书提取羊粪便样品中基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性，使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(Thermo Scientific)检测DNA样品的浓度与纯度。
1.3 16S rRNA基因V3+V4区PCR扩增与产物纯化将提取的粪便总DNA送北京百迈客生物科技有限公司，应用Illumina HiSeq平台对细菌16S rRNA基因的V3+V4区域(338F~806R)进行扩增[12]，引物序列为338F：5′-ACTCCTACGGGA-GGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3′两种引物进行PCR扩增[10]，同时设计真菌ITS1区域引物：5′-CTTGGTCATTTAGA-GGAAGTAA-3′，5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT-GC-3′；及内部ITS1F：5′-AACCTGCGGAAGGA-TCATT，ITS1R-3′：5′-GARCCAAGAGATCCR-TTG-3′作为参比。高效和高保真酶进行PCR扩增，反应体系参照说明书，反应体系为20 μL:PCR Mixture(2×) 10 μL，上游引物和下游引物各0.8 μL，模板DNA 0.8 μL(约100 ng)，BSA(5 mg·mL-1)0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反应条件：98 ℃ 2 min；9 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。每个样品PCR扩增做3个平行。
扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，TEA Ngel Midi Purification Kit试剂盒回收，用超微量紫外分光光度计精确定量，按物质的量比例混合后在Hiseq测序平台进行测序。
1.4 数据分析处理对Illumina测序的结果根据Barcode确定对应样品，并去除Barcode和引物序列，得到有效数据(Clean data)。统计GC含量，Q20和Q30质量值，Effective等参数对数据进行评估[13]。将具97%相似度的数据聚类为用于物种分类的操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，依OTUs聚类对每个OTU的代表序列做物种注释[14]；利用QIIME软件计算样品Chao1指数、Shannon指数、谱系多样性α多样性值，经过UniFrac算法分析样品物种群落差异(β多样性)[15]。用LEfSe和MetaStat统计分析方法对分组样品的物种组成和群落结构进行差异显著性检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 粪便样品总DNA质检与PCR扩增产物凝胶电泳检测粪便样品总DNA经检测质量满足建库要求，总量满足3次及以上建库要求。PCR扩增产物凝胶电泳检测结果(1.8%凝胶；TaKaRa 100 bp Ladder)显示，PCR扩增产物全部合格[16]，部分PCR扩增产物凝胶电泳结果如图 1所示。
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M.DNA相对分子质量标准; 24~46.部分样品PCR扩增结果 M. DNA marker DL-1500; 24-46. The PCR amplification results of partial samples 图 1 部分PCR扩增产物凝胶电泳图 Fig. 1 Gel electrophoresis of partial PCR amplification products |
每个样品至少产生57 973条Clean tags，平均产生72 353条Clean tags。其中GP组Clean Tags为72 591，GN组为71 973，NG组72 587。平均测序读长414~418 kb，样品的序列信息如表 3所示。3组样品有效序列数比率均达90.6%以上，测序质量值Q20 bases rate (%)、Q30 bases rate (%)分别达97%和94%以上，测序结果能够反映微生物整体的真实信息。
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表 3 样品测序有效数据统计 Table 3 Statistics of effective data for sequencing of samples |
所有样本均一化处理后3组样本的Venn图显示(图 2)，3个组共有OTUs为2 455个，GP、GN和NG组独有的OTUs分别有5、1、8个。3组共享OTUs数占全部OTUs总数的98.55%(2 455/2 491)，各组特有的OTUs数仅占OTUs总数的0.562%(14/2 491)。各组间粪样中OTUs组成相似度极高，说明超细毛羊肠道微生态系统相对稳定，受转基因影响的个体差异很微弱。肠道菌群多样性由高到底顺序为NG组＞GP组＞GN组，但差异不显著。
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图 2 样品中细菌群落共享和独有OTUs的Venn图 Fig. 2 Venn diagram representation of shared and exclusive OTUs from bacterial community in different samples |
由表 4可知，各组OTUs均达2 445个以上，表明转基因阳性组(GP组)、阴性组(GN组)及非转基因组(NG组)各组间肠道菌群组成高度相似。OTUs、ACE指数和Chao1指数显示，3组间群落的丰富度无显著差异(P＞0.75)。Shannon及Simpson指数显示，3组间样品群落中物种丰富度和物种均匀度也无显著差异。覆盖率均在99%以上，说明3组样本的测序都达到了很高的测序覆盖率[17]。分析显示，GP、GN和NG组间在肠道菌群结构、菌群丰富度、菌群多样性指数均无显著差异[18]。
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表 4 各组样品粪便菌群的OTU数量及Alpha多样性 Table 4 OTU number and Alpha diversity of fecal microfloraina groups |
Shannon多样性指数稀释曲线(图 3)显示，当样本测序数为5 000时曲线趋向平缓，本试验样本测序数均在78 000以上，Shannon指数曲线已达到平台期[19]。OTUs种类不再随测序量增加而增长，表明样品序列基本覆盖样本中绝大部分微生物种类。
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图 3 Shannon多样性指数稀释曲线 Fig. 3 Rarefaction curves of Shannon index |
基于UniFrac的加权主坐标分析其第1、第2和第3主成分的贡献率分别为20.54%、12.52%和8.73%(图 4)，转基因阳性/阴性组和非转基因组总共113个样本呈现不同程度的混杂，PC1-PC2、PC1-PC3和PC2-PC3坐标系均无法完全分开，包括母羊/公羊3组的样本都具有不同程度的重叠，说明转基因超细毛羊粪样与非转基因超细毛羊粪样菌群组成较为相似。如图 4A所示，GNF、GPF和NGF组分布趋势比较接近，GNM、GPM和NGM组分布趋势比较接近；如图 4B所示，GNF、GPF和GPM组分布趋势比较接近，GNM、NGM和NGF组分布趋势比较接近；如图 4C所示，GNF、GNM和GPM组分布趋势比较接近，GPM、NGF和NGM组分布趋势比较接近。
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GNF.转基因阴性母羊；GNM.转基因阴性公羊；GPF.转基因阳性母羊；GPM.转基因阳性公羊；NGF.非转基因母羊；NGM.非转基因公羊 GNF. Transgenic negative ewe; GNM. Transgenic negative ram; GPF. Transgenic positive ewe; GPM. Transgenic positive ram; NGF. Non-transgenic ewe; NGM. Non-transgenic ram 图 4 基于OTU水平的肠道微生物PCoA(加权主坐标)分析 Fig. 4 UniFrac weighted principal coordinate analysis (PCoA) of the intestinal microbes at OTU level |
由图 5大致可知各组组内样本相似性的中位数、离散程度、最大值、最小值、异常值等，利用双尾Student’s t-test统计方法检验两两组间物种β多样性差异显示[20]，3组间β多样性组间均无显著差异。
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图 5 组间β多样性差异分析的箱形图 Fig. 5 Box diagram of difference analysis of β diversity among groups |
2.5.1 物种注释分析 对OTU进行物种注释得到肠道微生物在门纲目科属种6个层面上的组成信息[21]。在门分类水平上，GP组17个门，其中GPF组16个门，GPM组16个门；GN组17个门，其中GNF组16个门，GNM组17个门；NG组17个门，其中NGF组和NGM组均17个门。在纲分类水平上，GP组32个纲，其中GPF组31个纲，GPM组31个纲；GN组32个纲，GNM组32个纲；NG组32个纲，其中NGF组和NGM均32个纲。在目分类水平上，GP组56个目，其中GPF组，GPM组53个目；GN组56个目，其中GNF组56个目，GNM组54个目；NG组57个目，其中NGF组57个目，NGM组54个目。在科水平上，GP组94个科，其中GPF组94个科，GPM组90个科；GN组94个科，其中GNF组94个科，GNM组91个科；NG组95个科，其中NGF组95个科，NGM组90个科。在属水平上，GP组226个属，其中GPF组226个属，GPM组221个属；GN组228个属，GNF组228个属；NG组225个属，NGF组226个属。在种水平上，GP组184个种，GPF组184个种；GN组183个种，GNF组183个种；NG组184个种，其中NGF组184个种，NGM组180个种。
物种注释分析显示，大部分OTUs都可以注释到属水平上。在门纲目科属种6个层面上注释到各组母羊肠道菌群的丰富性呈现高于公羊肠道菌群的丰富性。此外GP、GN和NG组内还有无法确定分类地位的细菌分别占丰度总量的0.185%、0.174%和0.217%。
2.5.2 肠道菌群的门水平分布 在门水平上，GP、GN和NG组均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)为主，其次是螺旋菌门(Spirochaetace)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、软壁菌门(Tenericutes)、纤维杆菌门(Fibrabacteres)、变形菌门(Proteobacteria)，此7个门的相对丰度占丰度总量的98.8%以上，其中厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度就占到86.568%~88.506%；GP、GN和NG组内厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度比值[22]分别为1.56±0.101、1.571±0.121和1.616±0.122，3组间无显著差异(P＞0.05)。按照细菌相对丰度排序前10个菌门的累积相对丰度占门水平累积相对总丰度的99%以上。门分类水平下的组间主要物种丰度统计见表 5和图 6。
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表 5 转基因超细毛羊与非转基因羊门水平菌群分类及分类菌名称 Table 5 Flora classification and names of microflora at the phylum level of superfine transgenic sheep and non-transgenic sheep |
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图 6 GPF、GPM、GNF、GNM、NGF及NGM组细菌门分类水平的比较 Fig. 6 Comparison of bacteria classification at phylum level for GPF, GPM, GNF, GNM, NGF and NGM gruops |
2.5.3 肠道菌群的属水平分布 在属水平上，GP、GN和NG组均以理研菌科RC9粪肠属(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、瘤球菌科UCG-005属(Ruminococcaceae_UCG-005)、瘤球菌科UCG-010属(Ruminococcaceae_UCG-010)、Christensenellaceae_R-7_group、拟杆菌属(Bacteroides)、毛螺菌科NK4A136属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、密螺旋体属2(Treponema_2)、[真细菌]粪甾烷类属([Eubacterium]_ coprostanoligenes_group)、瘤胃球菌属1(Ruminococcus_1)、Alistipes、未培养瘤胃细菌属(uncultured_rumen_bacterium)、瘤球菌科UCG-013属(Ruminococcaceae_UCG-013)前12位菌属为主(相对丰度占到54.334%~55.636%); 其次是拟杆菌BS11肠属(uncultured_bacterium_f_Bacteroidales_BS11_gut_group)、未培养瘤球菌属(uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae)、瘤球菌科UCG-014属(Ruminococcaceae_UCG-014)、未培养毛螺菌属(uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌UCG003属(Prevotellaceae_UCG-003)、相弧细菌(Phascolarctobacterium)、腓尼基克拉菌(Phocaeicola)、普雷沃氏菌UCG-004属(Prevotellaceae_UCG-004)等，相对丰度>1%的20个菌属的相对丰度累积占相对总丰度的75.0%以上。属分类水平下的组间主要物种丰度统计见表 6和图 7。
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表 6 超细毛转基因羊与非转基因羊属水平菌群分类及分类菌名称 Table 6 Flora classification and names of microflora at the genus level of superfine transgenic sheep and non-transgenic sheep |
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图 7 GPF、GPM、GNF、GNM、NGF及NGM组细菌属分类水平的比较 Fig. 7 Comparison of bacteria classification at genus level for GPF, GPM, GNF, GNM, NGF and NGM groups |
LEfSe分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)可在不同组间寻找具有统计学差异的生物标记物。本研究将LDA(linear discriminant analysis)判别分析Effect size阈值设定为4，LDA≥ 4的物种其相对丰度为极显著高丰度的优势菌种[23]。由图 8可知，GP组的优势菌种主要为GPF组的10个生物标记物(biomarker)(LDA值＞4)，分别为螺旋体门(p_Spirochaetae)、螺旋体纲(c_Spirochaetes)、螺旋体目(o_Spirochaetales)、螺旋体科(f_Spirochaetaceae)、密螺旋体属2(g_Terponema 2)、纤维杆菌属(g_Fibrobacter)、纤维杆菌目(o_Fibrobactales)、纤维杆菌门(p_Fibrobacteres)、纤维杆菌纲(c_Fibrobacteria)、纤维杆菌科(f_Fibrobacteraceae)；GPM组有5个生物标记物的LDA值≥4，分别为梭菌纲(c_Clostridia)、梭菌目(o_Clostridiales)、瘤胃球菌科(f_Ruminococcaceae)、瘤胃球菌UCG-005属(g_Ruminococcaceae_UCG-005)、未培养瘤胃球菌UCG-005种(uncultured bacterium_g_Ruminococcaceae_UCG-005)。NG组的优势菌种主要在NGF组，只有1个生物标记物的LDA值≥4，即为拟杆菌BS11科(f_Bacteroidales_BS11_gut_gruop)；NGM组只有1个生物标记物的LDA值>4.5，即为厚壁菌门(p_Firmicutes)。
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图中展示了LDA值(LDA score)大于设定值(默认设置为4.0)的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小 The figure shows the species whose LDA score is greater than the set value (default setting is 4.0), the length of the bar chart represent the impact of different species 图 8 LDA值分布柱状图 Fig. 8 Histogram of LDA value distribution |
GP和NG组相关优势菌种的进化分支图中(图 9)，GPF组中螺旋体目(Spirochaetales)、螺旋体科(Spirochaetaceae)、密螺旋体2属(Terponema 2)和纤维杆菌目(Fibrobacterales)、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)及纤维杆菌属(Fibrobacter)显著高于其他组(P＜0.05)；GPM组中梭菌目(Clostridiales)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、瘤胃球菌属UCG-005种(Ruminococcaceae_UCG-005)、未培养瘤胃球菌UCG-005属(uncultured bacterium_g_Ruminococcaceae UCG-005)显著高于其他组(P＜0.05)；NG组中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌科BS11(Bacteroidales Bsll gut gruop)显著高于GP组(P＜0.05)。
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进化分支图由内至外不同的圆环代表了由门至种的分类级别；在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比；将无显著差异的物种统一着色为黄色 The different circles from inside to outside represent the classification level from phylum to species; Each small circle at different classification levels represents a classification at that level; The diameter of the small circle is proportional to the relative abundance; Species without significant difference were uniformly colored yellow 图 9 GP和NG组肠道菌群LEfSe分析进化分枝图 Fig. 9 Evolutionary branch diagram of LEfSe analysis of intestinal microbial groups in GP and NG groups |
本研究在相同环境和饲养管理模式下探究转入外源IGF-1基因的转基因阳性/阴性超细毛羊与非转基因羊肠道微生物的群落结构差异。已有研究表明，肠道微生物群落结构主要由宿主遗传、性别、年龄及外界环境因素等决定[24-26]。本研究结果表明，3组羊肠道微生物的群落结构整体相近，并均表现为母羊肠道菌群丰富性高于公羊肠道菌群。转IGF-1基因对超细毛羊肠道微生物细菌群落结构组成影响微弱。
3.2 3组样本肠道菌群种群多样性分析Shannon指数、Simpson指数、ACE及Chao1指数对比提示，3组菌群多样性无明显差异；α多样性分析表明，3组间的肠道菌群结构和多样性无明显差异(P>0.05)，3组样本肠道菌群的丰富度NG组>GN组>GP组，但无显著差异(P>0.05)。两两组间物种β多样性差异分析显示，3组间β多样性均无显著差异。无度量多维标定法(NMDS)分析结果显示，3组的样本都具有不同程度的重叠，说明GP、GN和NG组的微生物组成比较相似。
3.3 3组样本肠道菌群在门水平上的构成绝大部分reads分属17个门(表 5)。厚壁菌门(Firmicutes)在3组中丰度均为最高，与王悦[27]的试验结果相似。GP、GN和NG组分别为52.736%，54.080%，54.635%，在113份样品中平均为53.735%。拟杆菌门(Bacteroidetes)在3组中丰度次之[27]，分别占到33.832%，34.426%，33.819%(表 5)，在113份样品中所占比例为34.054%；门类水平上在细菌相对丰度>0.1%的前10个菌门的累积相对丰度占门水平累积相对总丰度的99%以上。但GNF组、GPF组未检出SR1-[Absconditabacteria]门，GPM组未检出Chlorobi(绿菌门)，只有16个门，而GNM组、NGF组和NGM组具有17个门。
3.4 3组样本肠道菌群在属水平上的构成在属水平上共获得228个属，GP组226个属，其中GPF组226个属，GPM组221个属；GN组228个属，其中GNF组228个属；NG组225个属，其中NGF组226个属。GP、GN和NG组3组间无显著差异(P>0.05)；按照细菌相对丰度排序前33个属的累积相对丰度占累积相对总丰度的79%以上(表 6)。
3.5 3组样本肠道菌群的相关微生物标志物GP组(LDA值>4)的生物标记物有15个。其中GPF组有10个，分别为源于螺旋体门、螺旋体纲、螺旋体目、螺旋体科及密螺旋体属2和源于纤维杆菌门、纤维杆菌纲、纤维杆菌目、纤维杆菌科、纤维杆菌属；GPM组5个生物标记物，分别为梭菌纲、梭菌目、瘤胃球菌科、瘤胃球菌UCG-005属、未培养瘤胃球菌UCG-005种。研究表明，反刍动物消化道中纤维杆菌门、纲、目、科、属到种的主要作用就是分解纤维素，而螺旋体门、纲、目、科、属则通常是与纤维素降解细菌互作参与降解消化秸秆纤维素的有效降解菌[28]，尤其是密螺旋体2属较为多见[29]。在粗饲粮为主的瘤胃环境中，纤维杆菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属是参与纤维降解代谢的高丰度主导细菌[30]。
NG组的优势菌种主要为：NGF组只有1个生物标记物的LDA值≥4，即为拟杆菌BS11科；NGM组只有1个生物标记物的LDA值>4.5，即为厚壁菌门。厚壁菌门广泛存在于哺乳动物肠道内[31]，尤其通常在是草食动物粪便中为优势菌门[32]。它与脂肪、蛋白质消化密切相关[33]。拟杆菌门是反刍动物肠道内的主要菌群，是饲粮多糖类的重要降解菌[34]。但拟杆菌被归属于中性菌，也称为条件致病菌[35]。当其正常的微生态平衡被打破时可引发内源性感染[36]。
由进化分枝图可看出，NGM组的生物标记物是整个厚壁菌门(包括4个纲、7个目、21个科、105个属及119个菌种)，GPM组的生物标记物则是在厚壁菌门范围内的梭菌纲(包括84个属、99个菌种)和瘤胃球菌科(包括30个属、36个菌种)，尤其是未培养瘤胃球菌UCG-005种呈现显著性差异物种。NGF组的生物标记物是拟杆菌BS11科，为显著性差异物种；GPF组的生物标记物分别为纤维杆菌门、纲、目、科、属和螺旋体门、纲、目、科、属及3个菌种，呈现显著性差异物种[32]。总之，本试验发现的上述呈极显著高丰度的优势菌种都是反刍动物肠道内常见的优势菌群[37-38]。
3.6 3组样本肠道菌群的共享菌分析超细毛羊在整体遗传背景、季节、饲养管理环境及饲粮都一致的情况下，对转基因羊与非转基因羊肠道共享菌的分析可以说明转IGF-1基因对其肠道菌群结构分布的影响[39]。对113个粪样品的门水平共享菌分析显示，所有检出的17个门中，有16个门为共享菌。其中，GPM组未检出绿菌门(Chlorobi)，GNF和GPF组未检出SR1_[Absconditabacteria]门。前者检出相对丰度为0.000 1%~0.002 8%，后者检出相对丰度为0.000 3%~ 0.006 8%，均为极低丰度分布。门水平拥有共享菌比例94.12%。
对113个粪样品属水平共享菌分析显示，所有检出的228个属中，有214个属为共享菌。其中6个属在GPM、GNM、NGM组均未检出，2个属在NGM组未检出，1个属在GPF、GNF组均未检出，1个属在GPM、NGM组均未检出，1个属在GPF组未检出，1个属在NGF组未检出，1个属在GPF、NGF组未检出。属水平拥有共享菌比例93.86%。对113个粪样品菌种水平共享菌分析显示，所有检出的185个菌种中，有174个菌种为共享菌。其中3个菌种在GPM、GNM、NGM组均未检出，3个菌种在GPF组未检出，2个菌种在NGF组未检出，1个菌种在GNF、NGM组均未检出，1个菌种在GNF组未检出，1个菌种在NGM组未检出。菌种水平拥有共享菌比例94.05%。
对所有粪样品门纲目科属种6个分类水平共享菌分析结果表明，其各分类水平上共享菌所占比例分别为门水平94.12%(16/17)，纲水平93.75%(30/32)，目水平91.07%(51/56)，科水平92.55%(87/94)，属水平93.86%(214/228)，种水平94.05%(174/185)。说明转入IGF-1基因未改变超细毛羊肠道菌群的总体结构分布。
4 结论转基因阳性羊、阴性羊及非转基因羊肠道菌群组成α多样性和组间差异分析显示，3组间肠道菌群结构、丰度及多样性指数无显著差异，表明转基因超细毛羊粪样与非转基因超细毛羊粪样菌群组成较为相似。在门水平上，3组样本均以厚壁菌门、拟杆菌门为优势菌门；在属水平上，3组均以理研菌科RC9粪肠属、瘤球菌科UCG-005属、瘤球菌科UCG-010属、Christensenellaceae_R-7_group、拟杆菌属、毛螺菌科NK4A136属、密螺旋体属2为优势菌属。转基因阳性羊(GP)组中，GPF组有10个生物标记物，GPM组有5个，均是反刍动物肠道菌群的常见定植菌；非转基因羊(NG)组中，NGF组的生物标记物为拟杆菌BS11科，NGM组为厚壁菌门，均为反刍动物肠道菌群的主要优势菌。对所有样品门纲目科属种6个分类水平共享菌分析结果显示，3组拥有共享菌比例高达91%~94%，表明转入IGF-1基因并未改变其肠道菌群的整体结构分布，转基因超细毛羊仍然保持着超细毛羊肠道微生态菌群组成结构的稳定定植[39]。
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