卵泡的组成包括卵泡膜细胞、颗粒细胞、卵母细胞^[1]，其中颗粒细胞通过间隙连接或旁分泌等方式影响动物的卵泡发育、排卵和卵泡闭锁^[2]。卵泡液有一种富含半胱氨酸的单分子糖蛋白——卵泡抑素(follistatin，FST)，具有抑制垂体释放促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)和阻碍活化素A(activin-A)与其受体相结合的作用^[3-4]。研究表明，妊娠期间人卵泡抑素的水平会发生改变^[5]；条件敲除雌鼠的FST会直接导致雌鼠在胎儿期损失近90%的生殖细胞^[6]。但是卵泡抑素在山羊卵巢颗粒细胞中的影响尚不清楚。山羊作为一种重要的经济动物，与猪、鸡相比，低产羔数一直制约着养羊产业发展，研究山羊卵巢卵泡颗粒细胞发育机制对于揭示山羊卵巢卵泡发育的分子机制、提高繁殖力具有重要意义。

慢病毒载体是一类源自逆转录病毒的载体。通过慢病毒改建而来的慢病毒载体因其转移效率高且稳定成为常用的研究工具^[7]。慢病毒在各种细胞内都具有较高并且稳定的转染能力，并且有着持续、高效和稳定的表达^[8]。干扰慢病毒载体是将干扰靶基因表达的RNA连接到慢病毒载体上从而形成具有干扰效果的重组载体^[9]；过表达慢病毒载体是将克隆基因连接到具有强启动子的慢病毒载体上的重组载体^[10]。本研究通过将FST的shRNA和基因片段分别连接到对应的慢病毒载体上，包装成慢病毒载体，并验证其对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的作用，拟为进一步揭示FST对山羊卵巢卵泡颗粒细胞功能和繁殖能力的影响提供实验基础。

1 材料与方法 1.1 山羊卵巢卵泡颗粒细胞的培养鉴定

采集安徽白山羊卵巢组织，并立即置于4 ℃ PBS缓冲液，用含青链霉素双抗(HyClone，美国)的PBS对直径为3~6 mm的山羊卵泡进行反复抽吸，400目滤网过滤后，1 000 r·min^-1离心3 min弃上清，PBS重悬，重复操作3次，用含10%胎牛血清(四季青)完全培养基(DMEM/F12，HyClone，美国)重悬。调整细胞密度、接种于60 mm细胞培养皿，37 ℃二氧化碳培养箱中培养，于2、24、36、48、72 h观察细胞状态。

针对卵巢卵泡颗粒细胞特异性表达促卵泡激素受体(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)，对分离的原代卵巢卵泡颗粒细胞进行免疫荧光鉴定。将汇合度达到70%~80%的细胞以8×10⁴个·mL^-1接种于24孔培养板。24 h后(对数生长期)用PBS洗涤、多聚甲醛固定、BSA封闭，加入FSHR蛋白一抗(Mouse Monoclonal FSHR Antibody，优宁维公司)，4 ℃孵育12 h；加入二抗(Fluorescein-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG，优宁维公司)，常温孵育1 h，再用PBS清洗4次；加入DAPI避光孵育5 min，PBS清洗3次；倒置荧光显微镜观察。

1.2 FST克隆及shRNA设计合成

提取山羊卵巢卵泡颗粒细胞总RNA，反转录获得cDNA，根据山羊FST序列(NM_001285764.1)，使用Primer blast设计引物(表 1)，采用高保真DNA聚合酶(东洋纺KOD-201，日本)，对FST进行PCR扩增。PCR产物纯化回收后，通过Aidlab Zero-Backgroud pTopo-Blunt Simple Cloning Kit(艾德莱生物，北京)与T载体连接，并转化DH5α，通过菌落PCR及测序进行验证。对于转化成功的菌液，使用Endo-free Mini Kit(OMEGA，美国)提取质粒，获得pTopo-FST重组质粒。

利用http://rnaidesigner.thermofisher.com/在线工具，设计2对山羊FST shRNA(shRNA1和shRNA2)及阴性对照(shRNA-NC)的上、下游序列(表 1)，通过退火连接，形成双链。PCR引物及相关序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重组载体构建及验证

利用BamHⅠ和EcoRⅠ(NEB，北京)分别对pTopo-FST、pLVX-IRES-Neo和pPLVX-shRNA进行双酶切。纯化后得到FST片段、pLVX-IRES-Neo和pPLVX-shRNA骨架载体。分别将纯化后FST片段与pLVX-IRES-Neo进行连接，双链shRNA片段及阴性对照与pPLVX-shRNA进行连接。连接体系为：目的片段1 μL；骨架载体3 μL；T4 DNA Ligase 1 μL；Buffer 2 μL；ddH₂O 14 μL。22 ℃连接5 h，获得重组载体pLVX-FST、pPLVX-shRNA1、pPLVX-shRNA2和pPLVX-shRNA-NC，并转化DH5α。挑取阳性菌落，通过测序予以验证。利用质粒提取试剂盒对成功表达目标载体的菌液进行质粒提取，分别获得pLVX-FST重组质粒和pPLVX-shRNA重组质粒。

1.4 慢病毒包装及卵巢卵泡颗粒细胞的转染

解冻HEK-293T细胞，传代至细胞正常生长状态。待细胞密度达到80%~90%时，向500 μL的Opti-Mem中加入10 μg重组载体或空载载体(pLVX-IRES-Neo，过表达组阴性对照)，10 μg辅助质粒Pspax2和5 μg辅助质粒PMD2，参照liposuction2000说明书进行转染，48 h后吸取细胞上清，参照病毒浓缩试剂说明书进行浓缩，最终分别得到FST过表达(over-express, OE)、过表达阴性对照(OE-NC)、shRNA1、shRNA2和抑制阴性对照(shRNA-NC)的病毒浓缩液，并分装保存于-80 ℃冰箱。

将原代卵巢卵泡颗粒细胞传至6孔板中，待细胞密度达到30%，吸尽培养液。每孔加入含8 μg·mL^-1聚凝胺的完全培养基1 mL，并分别加入20 μL上述5组的病毒浓缩液。3 h后补齐培养液，24 h后换液并观察荧光表达情况。每处理重复3次，以未处理的组作为空白对照(Blank)。

1.5 FST表达量验证

原代卵巢卵泡颗粒细胞感染72 h后，用Trizol法提取细胞总RNA，反转录得到cDNA后，进行荧光定量PCR(qPCR)，检测不同处理FST表达情况。以GAPDH为内参，qPCR引物序列信息如表 2。

1.6 FST表达对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

将山羊原代卵巢卵泡颗粒细胞按照1.5×10⁴·mL^-1传入96孔细胞培养板，37 ℃培养12 h后，分别加入3 μL的上述5种病毒浓缩液，以未处理的卵巢卵泡颗粒细胞作为空白对照(Blank)。36 h后更换培养液，60 h后避光添加CCK-8溶液(每孔10 μL)，再培育4 h，酶标仪(BioTek Instrumrnts, Inc.ELX808，美国)检测450 nm处细胞OD值。每处理重复3次。

1.7 统计分析

荧光定量PCR采用2^-ΔΔCT方法进行计算，每处理重复3次。细胞增殖试验通过酶标仪得到细胞在450 nm处OD值，数值用SPSS 19.0软件单因素方差分析进行统计学分析。

2 结果 2.1 原代山羊卵巢卵泡颗粒细胞的分离

分别于原代培养的2、24、36、48、72 h观察细胞状态。2 h后细胞开始贴壁，形态为圆形；24 h部分细胞延伸至呈纺锤形；到了36和72 h后细胞密度明显增大，且细胞形态以纺锤形居多(图 1)。为鉴定细胞纯度，通过对卵巢卵泡颗粒细胞特异性表达的FSHR蛋白进行免疫荧光染色，被免疫细胞的细胞质呈现绿色荧光(图 2A)，即细胞能够分泌与FSHR抗体结合的FSHR蛋白，说明该细胞为卵巢卵泡颗粒细胞；DAPI染色观察其细胞核呈现蓝色荧光(图 2B)，两个图叠加后绿色和蓝色荧光重合率达到95%，进一步证明贴壁细胞为卵巢卵泡颗粒细胞(图 2)。

2.2 重组载体的构建

使用山羊卵巢卵泡颗粒细胞的cDNA为模板，PCR扩增获得长度为1 036 bp的FST序列。琼脂糖凝胶电泳(图 3)及测序结果证明基因扩增正确。分别将shRNA1-F、shRNA1-R，shRNA2-F、shRNA2-R和shRNA-NC-F、shRNA-NC-R经退火形成双链shRNA1、shRNA2和shRNA-NC。利用BamHⅠ和EcoRⅠ分别对pTopo-FST、pLVX-IRES-Neo和pPLVX-shRNA进行双酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化获得FST片段、pLVX-IRES-Neo和pPLVX-shRNA载体。T4 DNA Ligase连接获得，pLVX-FST、pPLVX-shRNA1、pPLVX-shRNA2和pPLVX-shRNA-NC，转化DH5α后，挑选阳性克隆进行培养测序，双链shRNA测序结果如图 4，测序峰值完好、杂波少、序列准确性高，表明成功构建重组质粒，可用于后续试验。

2.3 慢病毒载体包装及感染卵巢卵泡颗粒细胞

将重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染至HEK 293T细胞，48 h后观察细胞的状态，如图 5所示，转染后细胞形态良好、绿色荧光蛋白成功表达且细胞阳性率达到90%。慢病毒载体感染汇合度为30%的原代卵巢卵泡颗粒细胞，感染后72 h利用显微镜观察细胞状态，结果如图 6所示，表达绿色荧光蛋白的卵巢卵泡颗粒细胞占比80%，表明慢病毒成功感染卵巢卵泡颗粒细胞。

2.4 FST表达量验证

慢病毒感染山羊卵巢卵泡颗粒细胞72 h后，利用qPCR方法对FST表达促进/抑制效果进行验证(图 7)。结果显示，shRNA1、shRNA2慢病毒感染后，山羊卵巢卵泡颗粒细胞中FST表达量均显著下调(P＜0.05，图 7A)，shRNA1、shRNA2的抑制效率分别为93%和87%；感染OE慢病毒后，山羊卵巢卵泡颗粒细胞中表达量显著提升(P＜0.05，图 7B)，是感染OE-NC的75倍。结果表明，通过细胞感染重组慢病毒载体的方式，可以显著改变山羊卵巢卵泡颗粒细胞中FST的表达情况。

2.5 FST表达量对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

FST干扰及过表达慢病毒感染山羊卵巢卵泡颗粒细胞，通过CCK-8检测细胞增殖效果。结果如图 8所示，shRNA1干扰组和shRNA2干扰组的卵巢卵泡颗粒细胞OD值显著(P＜0.05)高于阴性对照组(shRNA-NC)和空白对照组(Blank)，表明干扰后的FST表达被抑制，能够促进山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖；过表达FST时细胞OD值显著(P＜0.05)低于阴性对照组(OE-NC)和空白对照组(Blank)，表明FST过表达可以抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖。结果显示，FST表达对于山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖具有调控作用。

3 讨论

本研究采用免疫荧光染色、凝胶电泳、测序、荧光定量PCR等方法对各步骤进行验证。首先对分离培养的卵巢卵泡颗粒细胞进行免疫荧光染色，根据卵巢卵泡颗粒细胞特异性表达FSHR^[11]，通过抗体与之结合后呈现绿色荧光，验证出培养细胞为卵巢卵泡颗粒细胞；同时绿色荧光与被DAPI核染染成的蓝色荧光重合，重合率达到了95%，进一步表明分离的细胞为卵巢卵泡颗粒细胞^[12]。克隆FST时利用琼脂糖凝胶电泳的方法，将目的条带与标记条带进行对比，发现目的条带在1 000~2 000 bp，与NCBI基因数据库中的序列长度信息相吻合，测序结果进一步验证了FST序列正确。构建干扰和过表达慢病毒载体后，通过生物公司的测序，验证了载体上连接的片段为FST的CDS区，或者为前期设计的shRNA片段。

慢病毒包装过程中和慢病毒感染卵巢卵泡颗粒细胞过程中均利用慢病毒载体在细胞中表达绿色荧光蛋白的特性，证明慢病毒成功包装和感染。干扰和过表达慢病毒感染卵巢卵泡颗粒细胞后通过提取总RNA，逆转录和进行荧光定量PCR，验证干扰和过表达的效果。经过上述各个环节的验证，本研究构建的山羊FST干扰和过表达慢病毒是可信的和有效的，也进一步奠定本研究中FST对卵巢卵泡颗粒细胞增殖影响结果的真实性。

慢病毒有着普通转染试剂难以媲美的优势，能够极大地提高感染效率，且能够整合到动物基因组中稳定表达外源基因^[13]。慢病毒已被广泛地应用到人类基因治疗、转基因动物制备等过程中，具有不可估量的应用价值^[14]。本研究通过慢病毒感染细胞的方式克服了普通转染试剂难以转染原代细胞的难题。笔者运用酶切连接及生物合成的方法将FST或其shRNA分别插入到pLVX-IRES-Neo载体和pPLVX-shRNA载体中，较为便捷地构建载体；pLVX-IRES-Neo载体的强启动子CMV增强过表达的效果；利用pPLVX-shRNA载体中的荧光蛋白基因，为验证病毒包装和感染的结果，即快捷并稳定的构建基因的过表达和干扰的慢病毒^[15]。此外，通过病毒浓缩试剂处理慢病毒载体，大幅度提高了病毒的浓度，便于慢病毒的存储和使用。

卵泡发育和排卵是由多种相互作用的途径和细胞类型调控的复杂发育过程^[16]。FST表达合成的是一种分泌的蛋白质——FST，FST首先参与了垂体中卵泡刺激素分泌的调节，随后又参与了与生殖功能相关的人体其他区域的调节^[17]，并调控生殖细胞和支持细胞的发育^[18]。FST调节小鼠生殖细胞巢的破坏和原始卵泡的形成^[19]。在山羊卵泡发育研究中，Silva等^[20]发现体外早期卵泡发育的过程中均有FST的表达，添加FST对分离的初生卵泡的生长有抑制作用。以上研究中表明FST对卵泡发育具有一定的抑制作用，与本研究中的抑制卵巢卵泡颗粒细胞增殖的结果具有一致性。Nakamura等^[21]发现FST可高亲和地结合活化素(activin)，起到中和活化素的作用。同时Xu等^[22]发现activin主要通过结合其受体激活下游Smad4从而调控相关基因的转录，并且条件敲除Smad4干扰卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素的生成并导致卵泡发育障碍^[23]。从而我们猜测FST可能通过抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖进而抑制初级卵泡的生长，抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖可能是由于FST抑制促卵泡激素的释放或者拮抗促卵泡激素。综合分析上述研究结果，FST在山羊卵泡的发育过程中具有一定的抑制作用。

4 结论

分离并鉴定了原代山羊卵巢卵泡颗粒细胞；成功构建一个携带FST的过表达慢病毒载体，两个携带FST干扰片段慢病毒载体；同时发现慢病毒载体感染山羊卵巢卵泡颗粒细胞后，慢病毒过表达载体使FST的mRNA表达显著提高75倍，两个慢病毒干扰载体使FST的mRNA表达显著降低93%和87%；揭示了山羊FST对卵巢卵泡颗粒细胞的增殖具有抑制作用，为进一步研究FST调控哺乳动物卵泡发育提供试验研究基础。