中山病(Chuzan disease)是库蠓在牛体间传播中山病病毒(Chuzan virus，CHUV)引起的一种虫媒病，又称牛异常分娩病^[1]。该病的易感动物是牛，主要侵害犊牛的中枢神经系统并引起积水性无脑和小脑发育不全综合征(hydranencephaly cerebellar hypoplasia syndrome, HCH)，表现为无脑畸形或脑干发育不全；成年牛为隐性感染，不表现临床症状；但妊娠期母牛感染后可出现异常生产，主要表现为流产、早产、死产或产畸形胎儿^[2-4]。此病在流行期危害较大，是日本引起牛流产的重要病因之一，给其养殖业造成了严重的经济损失^[5]，2007年韩国的一项家畜虫媒病毒血清学调查研究显示，发生流产的牛血清CHUV抗体阳性率为22.8%，认为CHUV与牛的流产有重要关系^[6]。为控制疫病的流行，CHUV灭活疫苗在日本已经投入使用^[7-8]。

CHUV属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)中Palyam病毒亚群，为双链RNA病毒，广泛分布于热带、亚热带与温带地区，可感染多种反刍动物^[9-10]。1985年中山病首次在日本鹿儿岛县中山地区发生，并迅速传播到九州所有县，随后韩国、澳大利亚和我国部分地区牛血清样品中均检测到阳性抗体^[11-13]。虽暂无中山病的暴发记录，但我国地域辽阔，自然条件复杂，很多地方适于各类宿主动物、吸血节肢动物的生存繁殖及虫媒病毒的存在和传播，2012年杨恒等^[14]、2014年王芳等^[15]相继在我国云南师宗县和广西马山市首次分离到CHUV毒株，2016年王孟等^[16]在我国青藏高原的牦牛血液中检测到CHUV核酸阳性，2016年张义爽等^[17]对我国9省区牛羊CHUV血清调查，发现8个省区普遍存在阳性血清，且南方流行较为严重。以上报道表明CHUV在我国分布广泛，存在发生该病的风险，为进一步了解中山病在我国的流行情况，本研究应用C-ELISA方法^[18]对2016—2018年我国吉林、辽宁、内蒙古、河北、新疆、西藏、湖北、重庆、四川、贵州、云南、广西和广东等13个省级区划送检的8 232份牛羊血清样品进行检测，其结果将为我国开展中山病的防控提供有价值的参考资料。

1 材料与方法 1.1 血清样品来源

3 950份肉牛、2 995份山羊和1 287份绵羊血清样品由吉林、辽宁、内蒙古、河北、新疆、西藏、湖北、重庆、四川、贵州、云南、广西和广东各地相关省、自治区、市动物疫病预防控制中心或动物卫生监督所在2016—2018年间采集送检，除西藏牦牛为放养外，其他采集地点均为各省区内集约化养殖场。

1.2 主要试剂及仪器

脱脂奶粉购自BD difco公司；PBS磷酸缓冲液干粉购自北京索莱宝科技有限公司；0.01 mol·L^-1 PBS溶液中加入0.05%的Tween-20配制成PBST洗液，PBST中加入1%的脱脂奶粉配制成稀释液；CHUV C-ELISA试剂盒由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供^[18]；Multiskan FC酶标仪购自Thermo公司；AquaMax-2000洗板机购自Molecular Devices公司。

1.3 竞争ELISA (C-ELISA)检测

取出CHUV抗原固化ELISA板，每块板均设2个重复的空白、阳性、弱阳性和阴性对照；按说明书在每孔中加入40 μL稀释液后，加入10 μL对照和待测血清，按文献[18]步骤进行检测。

1.4 结果判定

根据公式计算对照和待测血清样品抑制率(present inhabitation，PI)%=(阴性对照OD_{450 nm}值-样品OD_{450 nm}值)×100%/阴性对照OD_{450 nm}值；弱阳性上限值=1.1×弱阳性对照PI，弱阳性下限值=0.9×弱阳性对照PI；被检样品PI≥弱阳性上限值，判为阳性；被检样品PI≤弱阳性下限值，判为阴性；被检样品的PI介于上、下限之间，进行重复试验，如果结果相同，判为弱阳性。计算2016—2018年各省级区划不同时间及不同动物血清抗体阳性率，阳性率=(阳性样品数/样品总数)×100%。

2 结果 2.1 牛血清CHUV抗体检测

对2016—2018年我国13个省区送检的3 950份肉牛血清进行CHUV C-ELISA检测(表 1)，CHUV抗体阳性血清1 700份，抗体阳性率为43.04%，13个省区有12个检测出抗体阳性，且各地的抗体阳性率有所差异，吉林(未检测到)、辽宁、内蒙古、新疆和河北等北方地区和西藏地区阳性率均较低，南方省份阳性率均较高。个别省区不同年份采集的牛血清CHUV抗体阳性率差异不大，2017年和2018年湖北为59.00%和55.00%，重庆为41.82%和37.04%；2016—2018年的3年间河北为2.00%、1.05%和1.00%，云南为57.78%、61.20%和65.51%，表明虫媒病毒的分布和感染有一定的区域固性，适合媒介昆虫生存和繁衍的地区，自然疫源可能长期存在。

各省/区不同采样点的CHUV抗体阳性率及分布见表 1。结果显示，阳性率由北向南、从高纬度到低纬度地区逐渐升高。吉林、辽宁、河北、内蒙古和西藏地区的不同采样点阳性率均小于10%，新疆除和田采样点阳性率高于10%，另外8个点也均小于10%；南方7省/区，除贵州的安顺市、贵安新区和贵阳市3个采样点阳性率小于20%外，其他点阳性率均高于20%，特别是云南、广东和广西3省区内不同采样点的阳性率均高于40%。可见中山病的流行分布情况受地理环境和气候的影响，并与其媒介昆虫活动情况呈正相关，主要分布在北纬40°以下，由北向南感染逐步趋向严重。

2.2 羊血清CHUV抗体检测

对2016—2018年我国12个省级区划送检的2 995份山羊和1 287份绵羊血清进行CHUV C-ELISA检测(表 2)，12个省级区划的山羊血清中10个检测出抗体阳性，阳性血清数142份，总阳性率为4.74%；7个省区的绵羊血清中3个检测出抗体阳性，阳性血清数17份，总阳性率为1.32%。山羊血清抗体阳性率由北向南逐渐升高，符合该病的发生与媒介昆虫的分布密切相关，由于南方地区绵羊养殖较少，检测的绵羊血清主要集中在北方地区，只有内蒙古、新疆和西藏3个地区检测到绵羊血清抗体阳性，并且发现同一地区绵羊血清抗体阳性率和山羊血清抗体阳性率较接近。

2.3 不同季节CHUV抗体阳性率

对由北向南的内蒙古乌兰察布、新疆哈密、广西河池和云南曲靖4个地区不同季节(3—5月、6—8月和9—11月)采集的牛、羊血清进行检测，比较。结果显示(表 3)，牛、羊血清CHUV抗体阳性率均有明显的季节性，4个地区血清阳性率在春季(3—5月)均最低(0~10.00%)，夏季(6—8月)阳性率迅速上升(2.22%~35.00%)，秋季(9—11月)阳性率达到最高(2.50%~60.00%)，表明虫媒病毒CHUV的流行和其媒介昆虫活动密切相关，有明显的季节性，夏秋两季库蠓活动频繁导致感染率升高。同时也显示，同一地区山羊及绵羊血清的阳性率在不同季节的升幅均低于牛的，说明羊CHUV的感染率低于牛的。

3 讨论

目前国内对CHUV的分布、流行情况及变化规律缺乏系统的研究报告，仅有2002年刘焕章等^[12]用琼脂免疫扩散试验和2016年张义爽等^[17]用血清中和试验方法对我国部分地区进行了CHUV感染状况调查，但被检测地区和样品数量较少。微量病毒中和试验是目前检测CHUV抗原或抗体的金标准，有结果准确、特异性好和敏感性高等特点，但也存在操作繁琐、检测耗时长、对待测血清质量要求较高和需获得活病毒等缺点。因此本文选择采用CHUV竞争ELISA方法对我国由不同地区牛、羊血清进行抗体检测，ELISA方法具有较好的特异性和敏感度，同时兼具快速诊断、操作简便和检测样本通量大等优点，适于大规模的血清调查，已被广泛应用于兽药残留检测及各类疾病诊断等方面^[19]。

CHUV的主要传播媒介是吸血雌性库蠓，通过吸吮带毒动物的血液后，病毒在其唾液腺和血腔细胞内增殖，随后从唾液腺中排泌，通过叮咬易感动物而传播病毒^[20]。因此，中山病的流行主要取决于媒介昆虫的活动，受外界环境温度、湿度、海拔和光照等因素的影响，有明显的地域性和季节性等特点^[21]。本研究对2016—2018年我国部分地区采集的牛羊血清调查发现，除吉林外的12个省级区划普遍存在中山病血清抗体阳性，阳性率由北向南逐渐升高。东北、华北和西北地区的吉林、辽宁、内蒙古、河北和新疆5省区，牛羊血清阳性率均小于10%，5省区纬度较高，均在北纬40°左右及以上，冬季严寒漫长，气温较低，严重影响和限制了库蠓等媒介昆虫繁衍和活动，进而影响了病毒的传播扩散。华中地区湖北，西南地区重庆、四川、贵州和云南，华南地区广西和广东，牛羊血清抗体阳性率较北方地区均大幅升高，7省区均位于北纬30°~20°，并以亚热带季风气候或热带季风气候为主，年均气温均在10 ℃以上，比较适合媒介昆虫生存繁殖和活动，导致阳性率最高。同样位于西南地区的西藏，虽纬度小于40°(北纬26°~36°)，但牛羊血清抗体阳性率均较低，因平均海拔较高，年均气温较低，冰冻期较长，媒介昆虫库蠓稀少，导致CHUV感染率较低。中山病的流行分布与其媒介昆虫库蠓活动呈正相关，主要分布在北纬40^o和南纬45^o之间，越靠近赤道活动越频繁，本次试验结果也印证了这一点。同时也发现，同一地区不同年份采集的血清检测抗体阳性率差异不大，也符合虫媒病毒同地理生态环境有密切关系的特点，当某种病毒的媒介昆虫适应该地区生态环境并生存繁衍下来，该地区就有可能存在其自然疫源地并相对稳定地长期固定下来^[22]。

通过对12个省的牛羊血清抗体阳性率比较发现，不论在牛血清阳性率较高的南方地区还是在阳性率较低的北方地区，山羊和绵羊血清抗体阳性率均较低，与日本学者的研究结论一致，牛比羊更易受CHUV的感染，但原因暂不清楚^[23]。对由北向南4个地区(内蒙古乌兰察布、新疆哈密、广西河池和云南曲靖)，不同季节(3—5月、6—8月、9—11月)采集的牛羊血清进行检测发现，虽然羊血清抗体阳性率低于牛血清，但牛羊血清的抗体阳性率均随季节的不同在变化，春季(3—5月)最低，夏季(6—8月)迅速升高，秋季(9—11月)到达最高，夏季气温较高库蠓活动频繁使感染率升高，秋季库蠓活动有所减弱但依然能使部分动物感染，致使秋季阳性率最高。进一步验证了CHUV的流行和媒介昆虫活动密切相关，具有明显季节性等特点。由于某些采样点在冬季存在采样和运输等困难，因此本研究未获得冬季试验数据，使试验结构存在缺陷，这将是本研究下一步需要解决的问题。

4 结论

通过对我国13个省级区划的牛羊血清进行检测，初步了解了中山病在我国牛羊中的流行和分布，进一步验证了CHUV作为虫媒病毒有明显的地域性和季节性等特点，为该病的有效防控及进一步研究虫媒病在我国的分布提供了重要试验数据。