2. 华中农业大学动物医学院, 科技部动物疾病防控国际联合研究中心, 武汉 430070
2. International Research Center for Animal Disease, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
板青颗粒(Ban Qing granules)是《中华人民共和国兽药典》2015年版二部收录的中兽药成方制剂,由板蓝根和大青叶两味中药材经水煎煮、滤过和浓缩处理制成浸膏后,与适量蔗糖、糊精混合制粒而得,具有清热解毒、凉血功效,广泛用于畜禽风热感冒、咽喉肿痛、热病发斑等温热性疾病防治[1-3]。薄层色谱实验(thin layer chromatography, TLC)是《中华人民共和国兽药典》2015年版二部中《板青颗粒质量标准》规定的鉴别方法:取板青颗粒样品研细,加入稀乙醇后超声处理,随后过滤,将滤液蒸干后加入稀乙醇溶解,制成供试品溶液,将供试品溶液与稀乙醇溶解的精氨酸对照品同时进行薄层色谱法鉴别,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点[1]。该TLC鉴别主要是对板青颗粒中的精氨酸进行定性鉴别。但是,在实际质量检测过程中,经常会出现色谱图上供试品溶液的精氨酸斑点相比精氨酸对照品的斑点滞后的现象,严重影响结果的判定。本研究旨在查明这种斑点滞后现象产生的原因,并对该鉴别方法进行改进,消除斑点滞后现象的发生,对《中华人民共和国兽药典》2015年版二部《板青颗粒质量标准》的修订提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 仪器、实验材料和试剂KQ5200B超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司生产;DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅,天津泰斯特仪器有限公司生产;XMTD-8222电热鼓风干燥箱,上海市精宏试验设备有限公司生产;Sartorius CPA225D电子天平,赛多利斯科学仪器有限公司生产;硅胶G板,青岛海洋化工厂分厂生产;中速双圈定性滤纸,通用电气生物科技(杭州)有限公司。
精氨酸对照品(纯度100%,ID:CDCW-7CBS,中国食品药品检定研究院);板青颗粒(湖北省某公司产品,批号:20171009、20170511、20160504;江西省某公司产品,批号:1701601;河北省某公司产品,批号:D201704009);板青浸膏(湖北省某公司产品,批号:20171009);蔗糖(湖北斯威特糖粉有限公司,食品级);茚三酮、95%乙醇、葡萄糖、氢氧化钠和CuSO4·5H2O均为国药集团化学试剂有限公司产品,分析纯。
1.2 方法 1.2.1 板青颗粒薄层色谱鉴别方法按照《中华人民共和国兽药典》2015年版二部中《板青颗粒质量标准》规定的薄层色谱法进行鉴别,包括稀乙醇、供试品溶液、对照品溶液的配制方法及薄层色谱测定方法[1]。
1.2.2 还原糖的测定[4]用斐林试剂测定还原糖。
稀乙醇配制:参照《中华人民共和国兽药典》2015年版二部(附录8002)进行,取乙醇529 mL,加水稀释至1 000 mL,即得。稀乙醇在20 ℃时含C2H5OH应为49.5%~50.5%。
斐林试剂配制:包括甲液和乙液。甲液为0.1 g·mL-1的氢氧化钠溶液,乙液为0.05 g·mL-1的CuSO4·5H2O溶液。使用时将4~5滴乙液滴入2 mL甲液中,混合均匀后立即使用(现配现用)。
还原糖测定:称取3份0.5 g蔗糖分别放入3个烧杯中,再分别加入20 mL的超纯水、稀乙醇或95%乙醇,超声处理10 min,用中速双圈定性滤纸过滤。分别取10 mL滤液,蒸干(纯水和稀乙醇加热蒸干,95%乙醇挥干),随后分别相应加入纯水、稀乙醇、95%乙醇复溶并定容至10 mL。分别取空白溶剂、滤液、复溶液各2 mL至比色试管中,每支试管分别加入1 mL斐林试液,将试管放置60 ℃恒温水浴锅中加热,观察是否有砖红色沉淀(絮状物)析出。
1.2.3 美拉德反应取0.5 g蔗糖,加入或不加入精氨酸(1 g),按照上述还原糖测定方法,分别用超纯水、稀乙醇、95%乙醇进行溶解,超声处理、过滤、蒸干(纯水和稀乙醇蒸干,95%乙醇挥干)、复溶后,观察蒸干过程溶液是否变为褐色[5]。
1.2.4 板青颗粒薄层色谱鉴别方法的改进为了消除供试品中蔗糖的影响,对板青颗粒供试品溶液的制备方法进行改进。用95%乙醇代替稀乙醇处理样品,用自然挥发干燥代替加热蒸干,修正的方法如下[6]。
1.2.4.1 供试品溶液的制备取2 g板青颗粒供试品,研细,加95%乙醇10 mL,超声处理30 min,滤过,滤液浓缩至2 mL,作为供试品溶液。对照品溶液的制备:取精氨酸对照品,加入稀乙醇制成0.5 mg·mL-1的精氨酸乙醇溶液,作为对照品溶液。
1.2.4.2 薄层色谱测定法吸取上述供试品、对照品溶液各2 μL,分别点于同一以羧基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸-水(15:7:7)为展开剂展开后,取出,热风吹干,喷以茚三酮试液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上显现相同颜色的斑点为合格。
2 结果 2.1 蔗糖对板青颗粒薄层色谱鉴定的影响为了考察蔗糖对板青颗粒薄层色谱鉴定的影响,分别将三种不同来源的含蔗糖的板青颗粒(湖北-20171009、河北-D201704009、江西-1701601)、不含蔗糖的板青浸膏(湖北-20171009),按照文献[1]的方法进行薄层色谱试验。同时设加蔗糖和不加蔗糖的精氨酸对照组。结果显示,未添加蔗糖的板青浸膏组和未添加蔗糖的精氨酸对照品组均出现了与精氨酸对照品一致的斑点,而不同来源的含蔗糖的板青颗粒、加了蔗糖的精氨酸对照组均出现斑点滞后现象(图 1)。
为了研究《中华人民共和国中国兽药典》2015年版第二部里《板青颗粒质量标准》中薄层色谱鉴定实验过程是否使供试品中的蔗糖水解生成还原糖,以及哪些因素可以导致蔗糖的还原,我们将蔗糖分别用纯水、稀乙醇、95%乙醇进行溶解、过滤后,直接加斐林试剂,或过滤、蒸干(纯水和稀乙醇蒸干,95%乙醇挥干)后,分别用纯水、稀乙醇、95%乙醇复溶,再加斐林试剂,同时设无蔗糖对照组。结果显示,只有溶于稀乙醇的蔗糖溶液在加热蒸干复溶后滴加斐林试剂出现了砖红色沉淀,说明蔗糖溶于稀乙醇蒸干时水解产生了还原糖,而溶于纯水蒸干和95%乙醇挥干时不产生还原糖(图 2)。
为了研究蔗糖水解成的还原糖是否能够与精氨酸发生美拉德反应,按照“1.2.3”的方法进行试验,结果发现,蔗糖只有在加入精氨酸,溶于稀乙醇,加热蒸干过程出现褐色反应,而不加精氨酸,或加入精氨酸但溶于纯水加热蒸干过程不出现褐色反应,溶于95%乙醇挥干过程不出现褐色反应(图 3)。
为了消除蔗糖的影响和斑点滞后问题,本研究用95%乙醇替代稀乙醇、用自然挥发干燥代替加热蒸干进行供试品溶液的制备,对照品溶液分别用稀乙醇、95%乙醇制备。结果显示,供试品溶液的薄层色谱斑点滞后问题明显改善,多次重复试验表明该改进方法稳定可靠,重现性好(图 4)。
按照《中华人民共和国兽药典》2015年版二部中板青颗粒薄层色谱(TLC)鉴定实验方法进行供试品鉴定时,经常出现供试品TLC精氨酸斑点滞后现象。为了解决这个问题,本研究首先探索了斑点滞后现象产生的原因。结果发现,不含蔗糖的板青浸膏和未添加蔗糖的精氨酸对照品组在TLC上均不出现斑点滞后,而不同来源的含蔗糖的板青颗粒、加了蔗糖的精氨酸对照均出现斑点滞后现象(图 1),说明供试品中溶解的蔗糖是导致斑点滞后的原因。
为了进一步探讨蔗糖影响的作用机制,本研究先后考察了供试品中的蔗糖在TLC样品制备过程中是否被水解成还原糖,以及美拉德反应(Maillard reaction)的发生[7-10]。结果发现,蔗糖溶于稀乙醇后蒸干时,会水解产生还原糖,还原糖进一步与精氨酸之间发生美拉德反应,而溶于纯水加热蒸干和95%乙醇挥干时不产生还原糖,不发生美拉德反应(图 2、图 3)。美拉德反应又称为“非酶褐变反应”,是法国化学家L. C. Maillard在1912年提出的,是羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应,经过席夫碱(Shiffbase)的生成、N-取代糖基胺的生成、Amadori化合物生成等起始阶段,Amadori化合物通过三条路线进行中间阶段反应(酸性条件下,经1, 2-烯醇化反应生成羰基甲呋喃醛;碱性条件下,经2, 3-烯醇化反应产生还原酮类和脱氢还原酮类;Strecker降解反应产生Strecker醛类),中间阶段的产物与氨基化合物进行醛基-氨基反应,最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精(或称拟黑素)[11-20]。由此可见,中兽药板青颗粒的辅料蔗糖在用稀乙醇溶解后,在加热蒸干过程中被水解成还原糖,还原糖进一步与供试品中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应,形成大分子物质类黑精,导致TLC上斑点滞后。
有学者专门研究了蔗糖在乙醇水溶液中的溶解度,发现蔗糖易溶于纯水、稀乙醇,而在95%乙醇中溶解度低。其机制可能是在加热条件下稀乙醇可以为蔗糖水解提供H+,而纯水在加热条件下不足以为蔗糖水解提供H+,蔗糖在95%乙醇中溶解度很低[21]。鉴于此,本研究对《中华人民共和国兽药典》2015年版二部中《板青颗粒质量标准》规定的TLC鉴定方法进行了改进,用95%乙醇替代稀乙醇、用自然挥发干燥代替加热蒸干进行供试品溶液的制备,减少了供试品中的蔗糖含量和还原糖的产生,有效解决了斑点滞后问题,对板青颗粒质量标准的修订提供科学依据。
4 结论板青颗粒中的蔗糖在供试品溶液制备过程中水解生成的还原糖与精氨酸发生美拉德反应,是导致薄层色谱鉴别斑点滞后的原因,改变供试品溶液制备方法:用95%乙醇替代稀乙醇、用自然挥发干燥代替加热蒸干,可以有效消除蔗糖对板青颗粒薄层色谱鉴别的影响,解决了斑点滞后问题,对现行《中华人民共和国兽药典》2015年版二部《板青颗粒质量标准》的修订提供充分的科学依据,具有重要的理论和现实意义。
[1] |
中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2015年版二部[S].北京: 中国农业出版社, 2016.
Chinese Veterinary Pharmacopoeia Commission. People's republic of China veterinary pharmacopoeia 2015 Part Ⅱ[S]. Beijing: China Agriculture Press, 2016. (in Chinese) |
[2] |
赵晓娟, 李琳, 刘雄, 等. 大青叶的本草学研究、化学成分及药理作用研究概况[J]. 甘肃中医学院学报, 2011, 28(5): 61–64.
ZHAO X J, LI L, LIU X, et al. Study on chemical constituents and pharmacological action of Folium isatidis[J]. Journal of Gansu College of Traditional Chinese Medicine, 2011, 28(5): 61–64. DOI: 10.3969/j.issn.1003-8450.2011.05.025 (in Chinese) |
[3] |
任国萍, 田璐, 李铮, 等. 板蓝根药材中氨基酸含量测定研究[J]. 中国新药杂志, 2014, 23(1): 99–104.
REN G P, TIAN L, LI Z, et al. Determination of free amino acids and connected amino acids in Isatidis Radix by HPLC[J]. Chinese Journal of New Drugs, 2014, 23(1): 99–104. (in Chinese) |
[4] |
蔡炳新, 陈贻文.
基础化学实验[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 99-101.
CAI B X, CHEN Y W. Experiments of basic chemistry[M]. Beijing: Science Press, 2001: 99-101. (in Chinese) |
[5] |
WEAVER G M, DANIE J R.食品化学实验指导[M].杨瑞金, 张文斌, 译.北京: 中国轻工业出版社, 2009: 53.
WEAVER G M, DANIE J R. Food chemistry laboratory[M]. YANG R J, ZHANG W B, trans. Beijing: China Light Industry Press, 2009: 53. (in Chinese) |
[6] |
谭敏洁, 江勋, 彭婷婷, 等. 复方板蓝根颗粒质量标准提升研究[J]. 中国药业, 2018, 27(15): 20–24.
TAN M J, JIANG X, PENG T T, et al. Study on improvement of quality standard of compound banlangen granules[J]. China Pharmaceuticals, 2018, 27(15): 20–24. DOI: 10.3969/j.issn.1006-4931.2018.15.007 (in Chinese) |
[7] | WALLER G R, FEATHER M S. The Maillard reaction in foods and nutrition[M]. Pennsylvania: American Chemical Society, 1983. |
[8] | WONG K H, AZIZ S A, MOHAMED S. Sensory aroma from Maillard reaction of individual and combinations of amino acids with glucose in acidic conditions[J]. Int J Food Sci Technol, 2008, 43(9): 1512–1519. DOI: 10.1111/j.1365-2621.2006.01445.x |
[9] | JAEGER H, JANOSITZ A, KNORR D. The Maillard and its control during food processing. The potential of technologies[J]. Pathologie Biologie, 2010, 58(3): 207–213. DOI: 10.1016/j.patbio.2009.09.016 |
[10] |
周逸群, 贺福元, 杨岩涛, 等. 美拉德反应研究现状及对中药炮制和制剂工艺研究方法的影响[J]. 中草药, 2014, 45(1): 125–130.
ZHOU Y Q, HE F Y, YANG Y T, et al. Research situation of Maillard reaction and its influence on research methods for processing and preparation process of Chinese materia medica[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2014, 45(1): 125–130. (in Chinese) |
[11] |
谢嘉宾, 谢青. 美拉德反应产物的研究现状[J]. 四川畜牧兽医, 2010(1): 29–31.
XIE J B, XIE Q. Research of the Maillard reaction products[J]. Sichuan Animal & Veterinary Sciences, 2010(1): 29–31. DOI: 10.3969/j.issn.1001-8964.2010.01.011 (in Chinese) |
[12] |
王延平, 赵谋明, 彭志英. 美拉德反应产物研究进展[J]. 食品科学, 1999(1): 15–19.
WANG Y P, ZHAO M M, PENG Z Y. Research progress of Maillard reaction products[J]. Food Science, 1999(1): 15–19. (in Chinese) |
[13] | VHANGANI L N, VAN WYK J. Antioxidant activity of Maillard reaction products (MRPs) in a lipid-rich model system[J]. Food Chem, 2016, 208: 301–308. DOI: 10.1016/j.foodchem.2016.03.100 |
[14] |
钱敏, 白卫东, 赵文红, 等. 不同氨基酸和糖对美拉德反应产物的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(13): 31–35.
QIAN M, BAI W D, ZHAO W H, et al. Effects of amino acids and reducing sugars on Maillard reaction products[J]. Food Science, 2016, 37(13): 31–35. DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201613006 (in Chinese) |
[15] |
孔保华, 李菁, 刘骞. 美拉德反应产物抗氧化机理及影响因素的研究进展[J]. 东北农业大学学报, 2011, 42(11): 9–13.
KONG B H, LI J, LIU Q. Research progress of antioxidant mechanism of Maillard reaction products and its influencing factors[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2011, 42(11): 9–13. DOI: 10.3969/j.issn.1005-9369.2011.11.002 (in Chinese) |
[16] |
张凌燕, 李倩, 尹姿, 等. 3种氨基酸和葡萄糖美拉德产物的物理化学特性及抗氧化活性的研究[J]. 中国食品学报, 2008, 8(3): 12–22.
ZHANG L Y, LI Q, YIN Z, et al. Physiochemical properties and antioxidant activity of three glucose-amino acid model Maillard reaction products[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2008, 8(3): 12–22. DOI: 10.3969/j.issn.1009-7848.2008.03.003 (in Chinese) |
[17] | BENJAKUL S, LERTITTIKUL W, BAUER F. Antioxidant activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-sugar model system[J]. Food Chem, 2005, 93(2): 189–196. DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.10.019 |
[18] | JING H, KITTS D D. Antioxidant activity of sugar-lysine Maillard reaction products in cell free and cell culture systems[J]. Arc Biochem Biophy, 2004, 429(2): 154–163. |
[19] |
龚巧玲, 张建友, 刘书来, 等. 食品中的美拉德反应及其影响[J]. 食品工业科技, 2009, 30(2): 330–334, 338.
GONG Q L, ZHANG J Y, LIU S L, et al. Maillard reaction and its influence of the food[J]. Science and Technology of Food Industry, 2009, 30(2): 330–334, 338. (in Chinese) |
[20] |
李沙, 郭栋, 王晓雯, 等. HPLC法检测分析温度对中药口服液品质的影响[J]. 中国酿造, 2015, 34(4): 30–34.
LI S, GUO D, WANG X W, et al. Effect of temperature on the quality of oral liquid of traditional Chinese medicine by HPLC[J]. China Brewing, 2015, 34(4): 30–34. (in Chinese) |
[21] |
石兵兵. 蔗糖在乙醇水溶液中的溶解度[J]. 广州华工, 2009, 37(7): 101–102.
SHI B B. Sucrose solubility in alcohol-water solution[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2009, 37(7): 101–102. (in Chinese) |