畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (8): 1694-1701. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.08.019    PDF    
不同光照周期对雌兔卵泡发育和下丘脑-垂体-卵巢轴的影响
张玉仙1, 王文利1, 原展航2, 白欣洁1, 王子旭2, 曹静2, 董玉兰2, 陈耀星2     
1. 北京农业职业学院畜牧兽医系, 北京 102442;
2. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193
摘要:本研究旨在观察不同光照周期对母兔的发情率、同期发情和性腺轴的影响并探讨其机制。选用5月龄未经产新西兰母兔48只,随机分成3组,每组16只,前10 d各试验组采用“12 h光照:12 h黑暗”的光照制度,后6 d分别采用长光照(16 h光照:8 h黑暗)、短光照(8 h光照:16 h黑暗)和正常光照(12 h光照:12 h黑暗,对照组)的光照制度,光照强度80 lx。试验结束后统计发情率,并采集血清、下丘脑、垂体和卵巢,用ELISA、HE染色、RT-PCR的方法,研究不同光照周期下对雌兔卵泡发育和激素的影响。结果表明:长光照组血清褪黑激素水平比对照组显著低34.8%(P < 0.05)、比短光照组显著低47.8%(P < 0.05),而短光照组比对照组高25%(P < 0.05)。长光照组母兔下丘脑分泌GnRH mRNA表达显著增强,其mRNA表达量比短光照组显著升高453%(P < 0.05),比对照组显著升高250%(P < 0.05);而短光照组的比对照组降低36.7%(P>0.05)。同样,长光照组母兔垂体的GnRH mRNA表达量较短光照组、对照组分别高70%和41.7%,差异显著(P < 0.05);短光照组则比对照组降低16.7%(P>0.05)。长光照组的血清卵泡刺激素水平分别比短光照组、对照组高33.7%和25.1%,差异显著(P < 0.05)。长光照组血清促黄体生成素含量比短光照组显著高54.2%(P < 0.05)。长光照组血清雌二醇水平较对照组显著高34.8%(P < 0.05),较短光照组显著高47.8%(P < 0.05);短光照组比对照组低17.6%(P>0.05)。长光照组的单位面积初级卵泡数显著多于短光照组120%(P < 0.05)和对照组68.3%(P < 0.05),短光照组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。3个试验组卵巢单位面积窦状卵泡数没有显著差异(P>0.05)。长光照组的发情率为81.25%,而短光照组的仅为12.5%,对照组的发情率为31.25%。由本试验可知,长光周期组可抑制褪黑激素分泌、促进下丘脑分泌GnRH活性增强、提高垂体细胞GnRH受体表达、促进垂体分泌LH、FSH、提高了血清中LH、FSH的水平、促使雌二醇分泌、卵泡发育、成熟和排卵,诱导母兔同期发情。
关键词光照周期        同期发情    激素    GnRH    
The Effect of Different Photoperiods on Follicular Development and Hypothalamus-Pituitary-Ovary Axis in Female Rabbits
ZHANG Yuxian1, WANG Wenli1, YUAN Zhanhang2, BAI Xinjie1, WANG Zixu2, CAO Jing2, DONG Yulan2, CHEN Yaoxing2     
1. Department of Animal Husbandry and Veterinary, Beijing Vocational College of Agriculture, Beijing 102442, China;
2. Laboratory of Anatomy of Domestic Animals, College of Animal Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract: In this study, we investigated the effects and mechanisms of estrus rate, estrus and gonadal axis on female rabbits. A total of 48 5-month-old female New Zealand rabbits, not multiparous, were reared in artificial illumination. They were randomly assigned to 3 groups of 16 each. All groups were reared in 12-h L/12-h D photoperiod for the first 10 days, then the 3 groups were reared in long light group (LD, L:D 16:8), control group (L:D 12:12) or short light group (SD, L:D 8:16) for the last 6 days separately. Light intensity is 80 lx. The blood, hypethalamus, pituitary and ovary were collected, and estrus ratio was recorded. Effects of photoperiod on secretion of development of follicular and gonadotropic hormone were investigated by HE staining, ELISA, real-time PCR methods. Our results revealed that the serum melatonin level in LD was significantly decreased by 34.8%, 47.8% compared to control and SD groups (P < 0.05). Meanwhile, the serum melatonin level in SD was 25% higher than that of control group (P < 0.05). The GnRH mRNA expression of the hypothalamus in the rabbit exposed to LD was increased. The GnRH mRNA level of hypothalamic significantly increased by 453%, 250% compared to SD and control groups (P < 0.05), while there was no significant difference between SD group and control group (P>0.05). Similarly, the GnRH mRNA level of the pituitary exposed to LD significantly was increased by 70%, 41.7% compared to SD group and control group (P < 0.05), while there was no significant difference between SD group and control group (P>0.05). The level of serum follicle stimulating hormone(FSH) in the LD group was 33.7% and 25.1% higher than those of SD group and control group significantly (P < 0.05, respectively). Serum luteinizing hormone(LH) level in the LD group was significantly increased by 54.2% as compared to SD group (P < 0.05). The level of serum estradiol in the LD group was significantly increased by 34.8%, 47.8% compared to control group and SD group (P < 0.05). The number of primary follicles per unit area in long photoperiod group was 120% and 68.3% higher than those of short photoperiod group and the control group (P < 0.05). There were no significant differences in the number of antral follicles per unit area of the ovary among groups (P>0.05). Compared to control group (31.25%), estrus ratio of long photoperiod group increased to 81.25%, while that of short photoperiod group reduced to 12.5%. Melatonin plays a critical role in the mechanism by which photoperiod affects estrus of female rabbit. Long photoperiod reduces the secretion of melatonin, which promotes the secretion of GnRH in hypothalamus and the expression of GnRH in pituitary. Furthermore, the serum LH, FSH level were elevated, which increasing estradiol secretion, and promoting the development mature of follicles. Finally, it induces the estrus of the female rabbit.
Key words: photoperiod     rabbit     synchronization of estrus     hormone     GnRH    

集约化养殖场为便于提高生产效率、方便管理和销售,在家畜生产繁殖过程中多采用同期发情,对于牛、羊等生产周期长的大型动物同期发情多采用激素催情,但家兔繁殖的生产周期一般为42或49 d[1],若使用激素催情,需要频繁注射,不仅人工成本大大提高,而且对兔也是极大的应激,造成免疫力和产仔率下降、药物残留等负面影响。而且随着人们生活水平的提高,人们对食品安全的要求也越来越高,绿色、健康、环保等名词在当下越来越受追捧。本研究拟探讨改变光照方式对兔进行催情的可能性,光照催情操作简便、可行性强、造价低廉,能够避免药物残留问题、提高动物福利,因此在家兔养殖的生产实践中合理使用人工光照,对提高家兔生产性能、产品质量,改变传统的饲养模式具有十分重要的生产实践意义。

目前,国内外学者研究的结果表明,光照强度[2-3]、光照颜色[4]和光周期[5]能够有效刺激母兔同期发情。Quintela等[6]采用光周期为“12 h光照:12 h黑暗”(12 h L/12 h D)的人工光照饲养一周后,直接改成光周期为“16 h L/8 h D”再饲养一周的光照刺激法,能够在不使用PMSG的情况下促进哺乳期母兔同期发情且不影响兔的生产性能。谭卫国等[7]采用42 d繁殖模式,人工授精前7 d使用“16 h L/8 h D”(80 lx)的人工光照,伊拉母兔的生产性能与使用药物催情的效果没有差异,人工光照可以应用到肉兔繁殖生产中。

哺乳动物的发情受到外界诸多因素的影响,如光照、湿度、温度、饲养制度和食物等[8]。下丘脑整合环境因子各种形式的信号后转化为促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)的脉冲式分泌信号,垂体接受来自下丘脑的信号后调控卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)的分泌,FSH、LH协同作用于性腺调节卵巢的发育,卵巢中的卵泡发育成熟时雌激素的分泌增多,刺激中枢神经系统引起动物发情,同时刺激素能作用于下丘脑,对GnRH的分泌产生反馈效应[9]。下丘脑-垂体-性腺轴中三个层次的相互影响形成了反馈环路,能够在不同的生理状态下做出相应的反应并形成稳态[10]

本试验分别采用“16 h L/8 h D”、“12 h L/12 h D”、“8 h D/16 h L”三种光周期的人工光照,探讨光照周期对雌兔卵巢中卵泡发育、性腺轴中激素和发情的影响,有助于分析人工光照对母兔发情机制的研究。

1 材料与方法 1.1 实验动物

48只5月龄未经产健康的新西兰白雌兔,由长沙市天勤生物技术有限公司提供, 许可证号为scxk(湘)2014-0010,该公司生产的实验动物经湖南省实验动物质量检测二站检测,均达到国家标准。兔适应性饲养1周后随机分成3组,每组16只,每笼1只,兔舍采用人工光照及人工控温,饲养温度维持在(24±2)℃,自由采食和饮水。试验期16 d。

1.2 光源与光照制度

采用的光源为白光(400~700 nm)发光二级管(LED)。光照制度前期采用“12 h L/12 h D”,饲养10 d后,长光照组转换为“16 h L/8 h D”,短光照组转换为“8 h L/16 h D”,对照组维持“12 h L/12 h D”不变。光源照射到兔眼部的平均光照强度为(80±5) lx,使用MS6610照度计(上海隆拓仪器设备有限公司)测量实验动物房间光照覆盖面符合试验要求的平均光照强度。饲养16 d统计发情兔数量,计算发情率并取材。实验动物处理遵循北京农业职业学院和中国农业大学动物福利和伦理委员会规定。

1.3 主要检测指标和方法 1.3.1 血清中激素水平检测

心脏采血,室温静置,收取血清,-80 ℃保存待检。采用竞争抑制酶联免疫试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司产品)测定法检测兔血清中褪黑激素(melatonin, MLT)、雌二醇、LH和FSH水平,操作过程均按照试剂盒说明书进行。褪黑激素检测试剂盒的检测范围是12.35~1 000 pg·mL-1,雌二醇检测试剂盒的检测范围是12.35~1 000 pg·mL-1,FSH检测试剂盒的检测范围是2.47~200 ng·mL-1,LH检测试剂盒的检测范围是370.4~30 000 pg·mL-1,批内和批间的变异系数分别小于10%和12%。酶标仪(550,BIO-RAD,美国)在450 nm波长下检测各孔的光密度(OD值),每个样品重复3次。

1.3.2 卵巢组织学检查

耳缘静脉注射20%乌拉坦麻醉,灌流固定,打开腹腔取卵巢放入4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1,pH7.4)中固定48 h,常规石蜡切片;每5张切片选取1张(厚6 μm),每只试验动物选取5张切片,经HE染色后,显微照相观察(Olympus光学显微镜,D72,日本),然后使用Scion Image软件(Version Beta 4.0.2, Scion Co., 美国)测量各试验组雌兔卵巢切片的面积及各级卵泡数量,结果中卵巢面积用“μm2”表示,并统计每张切片各级卵泡占发育卵泡的百分比。

1.3.3 下丘脑、垂体组织中GnRH mRNA转录的检测

于转换光照后第7天,将兔处死后取头部,打开颅腔取下丘脑、垂体组织放入锡箔纸袋,液氮内保存,于-80 ℃保存备用。应用TRIzol法提取兔下丘脑、垂体组织中的mRNA,超微量紫外可见分光光度计(NanophotometerTM Peal,Implen,德国)测mRNA浓度,并将mRNA浓度调整至500~1 200 pg·μL-1。反转录为cDNA,应用荧光定量PCR仪(LightCycler® 480,Roche Applied Science,德国)进行GAPDHGnRH SYBR实时荧光定量检测(退火温度为60 ℃,循环数40)。上述所需要的引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR的引物序列见表 1

表 1 PCR的引物序列 Table 1 Sequences of primers used for RT-PCR
1.4 数据分析

试验结果表示为“ $\bar x \pm s_x^ - $”。试验数据采用SPSS 22(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)单因素方差分析(ANOVA)进行比较,P < 0.05表示差异显著。

2 结果 2.1 不同光照周期对雌兔发情率的影响

母兔发情时,外阴黏膜由苍白转为红色或紫色、肿胀,分泌黏液。经10 d“12 h L/12 h D”的人工光照后,转换为6 d的长光照周期“16 h L/8 h D”、短光照周期“8 h L/16 h D”或“12 h L/12 h D”的人工光照后,长光照组的发情率最高,短光照组发情率最低,长光照组、短光照组和对照组母兔发情的比例分别为81.25%、12.5%、31.25%。

2.2 不同光照周期对雌兔血清中性激素的影响 2.2.1 不同光照周期对雌兔血清中褪黑激素水平的影响

图 1A所示,长光照组血清褪黑激素水平比对照组显著低34.8%(P < 0.05)、比短光照组显著低47.8%(P < 0.05),短光照周期组血清褪黑激素水平比对照组高25%(P < 0.05)。

LD.长光照组; C.对照组; SD.短光照组。标注不同小写字母表示各组间差异显著(P < 0.05) LD. Long photoperiod group; C. Control group; SD. Short photoperiod group. Different letters mean significant differences between the groups (P < 0.05) 图 1 不同光周期对雌兔血清中褪黑激素(A)、雌二醇(B)、促黄体生成素(C)及卵泡刺激素(D)浓度的影响 Fig. 1 Effects of different photoperiod on the melatonin (A), estradiol (B), LH(C) and FSH (D) in serum of female rabbits
2.2.2 不同光照周期对雌兔血清中雌二醇含量的影响

图 1B所示,不同光照周期下,长光照组、短光照组、对照组的母兔血清雌二醇的含量分别为(99.18±5.79)、(63.58±4.09)、(74.79±3.87) pg·mL-1。长光照组血清雌二醇水平比对照组显著高34.8%(P < 0.05)、比短光照组显著高47.8%(P < 0.05),短光照组比对照组低17.6%,但两者没有显著差异(P>0.05)。

2.2.3 不同光照周期对雌兔血清中促黄体生成素含量的影响

图 1C所示,不同光照周期下,长光照组、短光照组、对照组的雌兔血清LH的含量分别为(1 537.49±91.21)、(996.84±120.97)、(1 306.85±106.06) pg·mL-1。长光照组血清LH水平比短光照组显著高54.2%(P < 0.05),比对照组高17.6%,但两者没有显著差异(P>0.05)。短光照组比对照组降低23.7%,两者差异显著(P < 0.05)。

2.2.4 不同光照周期对雌兔血清中卵泡刺激素含量的影响

图 1D所示,不同光照周期下,长光照组、短光照组、对照组的母兔血清FSH的含量分别为(15.10±0.88)、(11.29±0.60)、(12.07±0.76) ng·mL-1。长光照组血清FSH水平分别比短光照组、对照组显著高33.7%(P < 0.05)、25.1%(P < 0.05)。短光照组比对照组降低6.6%,但两者差异不显著(P>0.05)。

2.3 不同光照周期对雌兔卵巢各级卵泡数量和发育情况的形态观察

光镜下,新西兰白兔卵巢表面被覆有单层立方的生殖上皮,其下是由致密结缔组织构成的白膜;卵巢的实质由位于外层的皮质及中央的髓质构成。皮质较厚,内有不同发育阶段的卵泡。本试验分别统计了各组的初级卵泡、窦前卵泡和窦状卵泡的数量(图 2),三者均没有明显的形态学变化。数据统计发现,长光照组、短光照组和对照组在转换光周期6 d后母兔的卵巢单位面积中初级卵泡、窦前卵泡及窦状卵泡数量,长光照组卵巢单位面积初级卵泡数比短光照组显著多120%(P < 0.05),比对照组显著多68.3%(P < 0.05),短光照组和对照组没有显著差异(P>0.05)。3个试验组卵巢单位面积窦状卵泡数没有显著差异(P>0.05)。从初级卵泡、窦前卵泡和窦状卵泡分别占发育卵泡总数的百分比来看,光照周期对初级卵泡和窦前卵泡的比例没有显著的影响,而短光照组窦状卵泡的比例显著下降,长光照组窦状卵泡的比例显著升高。

A.原始卵泡;B.初级卵泡;C.窦前卵泡;D.窦状卵泡 A. Primitive follicle; B. Primary follicle; C. Preantral follicle; D. Antral follicle 图 2 雌兔卵巢中各级卵泡 Fig. 2 Photomicrographs of sections of follicles at all levels
2.4 不同光照周期对雌兔下丘脑、垂体GnRH mRNA的影响 2.4.1 不同光照周期对雌兔下丘脑GnRH mRNA的影响

图 3A所示,长光照组的母兔下丘脑GnRH mRNA的相对表达量最高,比短光照组显著高453%(P < 0.05),比对照组显著高250%(P < 0.05)。短光照组比对照组降低36.7%,但差异不显著(P>0.05)。

LD.长光照组;C.对照组;SD.短光照组。标注不同小写字母表示各组间差异显著(P < 0.05) LD. Long photoperiod group; C. Control group; SD. Short photoperiod group. Different letters mean significant differences between the groups (P < 0.05) 图 3 不同光周期对雌兔下丘脑(A)、垂体(B)中GnRH mRNA的相对表达量的影响 Fig. 3 Effects of different photoperiod on the GnRH mRNA level of hypothalamic (A) and pituitary (B)
2.4.2 不同光照周期对雌兔垂体GnRH mRNA的影响

图 3B所示,长光照组的母兔垂体的GnRH mRNA相对表达量最高,比短光照组和对照组分别显著高出70%(P < 0.05)、41.7%(P < 0.05)。短光照组比对照组降低16.7%,两组间没有显著差异(P>0.05)。

3 讨论

兔子常年可生育,虽不是严格的季节性繁殖动物,但野生雌性兔子的季节性繁殖同样受光照周期的调控[11-12]。人工饲养的兔子繁殖活动也明显地受到季节影响,日照短的季节养殖场中的母兔繁殖能力下降[13]。本试验中试验兔在入舍10 d后,分别采用“16 h L/8 h D”(长光照组)、“12 h L/12 h D”(对照组)、“8 h L/16 h D”(短光照组)3种不同光照周期采光制度,试验结束后,记录各试验组母兔的发情率,结果发现长光周期组发情率最高、其次是对照组、短光周期组发情率最低,说明光照周期影响母兔发情的效果明显,与Quintela等[6]、谭卫国等[7]、Mousa-Balabel等[13]、王琦等[14]的结果一致。试验证明母兔从“12 h L/12 h D”的光周期转换至长光照周期(16 h L/8 h D)能够有效促进母兔的同期发情。

褪黑激素(MLT)主要由松果体合成,其合成部位还有视网膜、眼眶腔的副泪腺、唾液腺、肠的嗜络细胞及红细胞等[15]。光照对MLT分泌具有节律性影响,除赤道地区外,光照周期会随着月份的不同而发生周期性的变化,因此非赤道地区动物的MLT分泌还具有明显的季节性变化[16]。目前,大量研究表明MLT对生物生殖活动的影响,因动物的种类、生理状况不同而表现出促进或抑制或无作用的多重性,对牛、鼠类、禽类等动物和人,MLT具有抑制生殖作用;对绵羊和鹿等动物具有促进作用;而对光不敏感的动物无作用[17]。MLT抑制长日照繁殖动物的性活动,刺激短日照繁殖动物的性活动,但MLT供给的持续性是抑制或刺激性腺反应的关键[18-20]。本研究发现长光周期组母兔发情率最高,但血清中MLT含量最低,短光周期组母兔发情率最低,但血清中MLT含量最高,说明兔MLT分泌受光照周期影响,与光照时间呈负相关性,MLT分泌量与母兔发情率呈负相关。

FSH和LH的分泌其规律基本一致,在长光照下表达量增多,短光周期下分泌受到抑制,这结果与高原甘加型藏羊在发情期及间情期的结果相似[21],显示人工光照对母兔垂体的影响与人工光照对季节性哺乳动物垂体的影响相似。雌二醇(主要由卵泡细胞分泌)升高能够引起动物发情。本试验长光照组血清中雌二醇的表达量显著高于另外两组,与注射PMSG、母仔隔离的母兔刺激雌二醇分泌的效果相似[22],同时与发情状况相一致。

不同光照周期对雌兔下丘脑、垂体组织中GnRH的影响来看,长光周期组比短光周期组和对照组高,短光周期组比对照组低。下丘脑分泌的神经肽GnRH能够刺激垂体分泌促性腺激素LH、FSH,从而促进性腺的成熟及提高其活性[23-26],而性腺分泌的性激素也能影响GnRH神经元及垂体细胞的活性。GnRH是调控机体生殖活动的核心分子,本试验结果显示长光照能显著促进母兔下丘脑GnRH mRNA表达,与Zhang等[27]的研究中发现饲养在绿色的LED灯下的肉鸡,下丘脑的GnRH mRNA表达受到显著抑制结果一致,表明人工光照能够影响下丘脑GnRH的分泌。

对靶器官卵巢的研究发现长光周期组、短光周期组和对照组在转换光周期6 d后母兔的卵巢中初级卵泡、窦前卵泡及窦状卵泡每平方毫米数量,长光照组卵巢单位面积初级卵泡数分别比短光周期组显著多120%(P < 0.05),比对照组显著多68.3%(P < 0.05),短光照组和对照组没有显著差异(P>0.05)。三个试验组卵巢单位面积窦状卵泡数没有显著差异(P>0.05)。从初级卵泡、窦前卵泡和窦状卵泡分别占发育卵泡总数的百分比来看,不同光周期下初级卵泡和窦前卵泡的比例没有显著的差异,而短光照组窦状卵泡的比例显著下降,长光照组窦状卵泡的比例显著升高[28-31]。本研究表明长光照可促进母兔卵巢卵泡细胞增殖、卵泡生长发育、卵泡的成熟、促进排卵,从窦状卵泡的数量上来看长光照组最多,其次是对照组,短光照组最少,长光照组可使母兔排卵数增多。据此,合理光照计划,可增加成熟卵泡的比例,提高产仔率。

从整个试验来看,光照刺激兔的视网膜,将光信号传到松果体转化为化学信号,使松果体分泌或抑制分泌褪黑激素,长光照抑制褪黑激素分泌,短光照促进其分泌,褪黑激素可调节下丘脑、垂体GnRH的分泌,GnRH能够调节下丘脑FSH和LH的分泌,FSH和LH可调节卵巢雌二醇的分泌,雌二醇可使母兔卵巢卵泡发育成熟、排卵、发情。褪黑激素不能直接作用于GnRH神经元,但是能够调节下丘脑的kp神经元和RFRP-3神经元的活性,如何进行调节需要进一步研究。

4 结论

在规模化养兔场,适当延长母兔的光照时长,可抑制母兔松果体分泌褪黑激素,导致垂体分泌FSH和LH增多,刺激卵巢合成分泌雌激素(如雌二醇),促使母兔同期发情和卵泡发育。

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