妊娠是一个涉及到孕体(胚胎及胎膜)、子宫和卵巢黄体之间相互作用的复杂的生理过程[1]。在哺乳动物孕体植入的关键时期,子宫经历重塑以创建一个适宜胚胎生长的优化环境,诱导大量的胚泡延伸和植入相关基因表达,引起子宫内膜腔上皮和浅层腺上皮的激素、细胞因子和生长因子变化[2-4]。生长的胚泡附植于母体子宫后,母体子宫内膜与胎儿尿囊绒毛膜结合形成胎盘。反刍动物存在胎盘子叶,而胎盘块是其基本特征。在胎盘发育期间,其屏障结构由早期的上皮-绒毛膜型转变为妊娠晚期的结缔-绒毛膜型,因此,反刍动物的胎盘被看作是一种有限的侵入性胎盘类型。在奶牛妊娠的早中期,由于低水平的滋养层细胞侵袭使得上皮-绒毛膜连接的稳定性较低,这种结构特征可能扰乱胎儿的发育,并增加流产或早产的风险[5]。因此,为提高牛早期胚胎的存活率,需要明确孕体和子宫内膜之间的生物化学联系,特别是一些关键细胞因子的调节作用。
成纤维生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族,因其成员中大多数与肝素结合发挥作用又称为肝素亲和生长因子,种类多达23种,是一类能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质[6]。FGF4是在哺乳动物胚胎发育过程中第一个被发现的FGF分子,在促进滋养层细胞的增殖过程中有着广泛的作用[7-8]。近年在小鼠的研究表明,FGF4对于早期胚胎的生长及胎盘的发育具有重要作用[9-11]。在猪,FGF4对于围植入期滋养外胚层和外胚层之间的沟通起着重要作用[12-13]。而FGF4在牛附植前早期胚胎及胎盘发育期间的分布与表达尚无报道。本试验运用免疫荧光染色和实时荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)技术对体外培养的牛早期胚胎及妊娠早期牛胎盘组织中FGF4的细胞定位和表达规律进行研究,为探讨FGF4在牛早期胚胎发育及围植入期胎盘发育中的作用提供形态和定量资料。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料荷斯坦奶牛妊娠18、21、27、36、40及50 d胎盘各三例,样品采自西安市某屠宰场。
1.1.2 主要试剂RNA提取试剂盒Cells-to-signal Kit购自Invitrogen公司;反转录试剂盒cDNA synthesis kit购自TaKaRa公司;荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq为Promega公司产品;兔源Anti-FGF4多克隆抗体(ab106355)为Abcam公司产品;二抗(Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG)和DAPI等为碧云天公司产品。
1.2 方法 1.2.1 胎盘组织样品采集及石蜡切片制作所取的胎盘连同子宫以0.9%生理盐水冲洗2~3次,取各日龄胎盘的胎膜组织、子叶、肉阜组织低温冷冻保存,以备qRT-PCR检测。组织学研究的胎盘样品制备参照Wang等[14]的研究方法,取完整的胎盘块及胎盘块间区组织分别浸泡于Carnoy固定液和4%多聚甲醛液中固定。固定好的组织按常规组织学方法进行石蜡包埋、连续切片,切片厚度5 μm。水浴展片,黏附载玻片捞片,40 ℃烘干,共制得三套切片,以备HE、PAS染色和免疫荧光染色。
1.2.2 总RNA提取及cDNA合成将-80 ℃保存的胎盘组织(胎膜、子叶、肉阜)取出,放入灭菌后的研钵中仔细研磨,按照RNA提取试剂盒Cells-to-signal Kit说明书提取各组织中总RNA,按照cDNA synthesis kit说明书反转录为cDNA,-20 ℃保存。
1.2.3 qRT-PCR从GenBank中查找相关的牛mRNA序列,通过Primer 5.0进行特异性引物设计。共设计2对引物,序列如下,GAPDH-F:5′-GGCGTGAACCACGAGAAGTA-3′,GAPDH-R:5′-GGCGTGGACAGTGGTCATAA-3′;FGF4-F:5′-CTGTACGGCTCGCCTTTCTTCA-3′,FGF4-R:5′-CGTTCTTGCTCAGGGCGAT-3′。引物由上海生工生物公司合成。
以各胎龄胎膜、子叶及肉阜组织cDNA为模板进行qRT-PCR,反应体系:上、下游引物(0.2 mmol·L-1)各0.4 μL,模板cDNA 2 μL,SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL,Passive ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL, ddH2O 6.8 μL,总反应体系为20 μL。每个样品设三次重复,使用StepOne Real-time PCR system (StepOne and StepOnePlus; ABI)进行qRT-PCR,反应程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环。以GAPDH为内参基因,通过2-△△Ct法分别计算各时期胎盘组织中Fgf4的相对转录量。
1.2.4 胎盘组织切片染色 1.2.4.1 HE染色烘好的切片脱蜡后,下行梯度乙醇溶液复水,按常规方法[15]进行HE染色,切片脱水、透明,中性树胶封片。
1.2.4.2 PAS染色切片脱蜡后,以1%过碘酸溶液作用3 min,水洗三次,入Schiff试剂染色8~10 min,流水冲洗10~15 min;苏木精染核,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片。
1.2.4.3 FGF4免疫荧光染色切片脱蜡,复水;蒸馏水洗2次,每次3 min。PBS洗3次,每次5 min,甩去PBS。将切片浸于加热煮沸的柠檬酸钠抗原修复液中微波抗原修复10 min。冷却至室温后,PBS洗5 min×3。封闭液室温封闭2 h,PBS洗5 min×3。加入FGF4一抗(工作浓度1:200),4 ℃过夜孵育;PBS洗涤5 min×3。加入Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG二抗(工作浓度1:1 000),避光室温孵育2 h,PBS洗涤5 min×3,DAPI染核5 min,PBS洗5 min×3;封片,AIR型激光共聚焦显微镜(日本尼康)观察,采集图片。
1.2.5 数据处理及分析以上试验均重复3次,结果以x±s表示,用SPSS 19.0软件ANOVA分析法对不同区域FGF4表达量差异进行统计学分析。
2 结果 2.1 牛胎盘的组织形态学 2.1.1 大体形态奶牛胎盘为典型多子叶型,胎盘块呈半圆穹顶状,每个胎盘块包含母体肉阜和胎儿子叶两部分,其间为胎盘块间区,略微平坦。随着孕龄增大,母体肉阜也逐渐增大变高,胎儿子叶的绒毛及其分枝伸入陷窝内,形成“子包母”的特殊外观结构(图 1)。
妊娠早期的牛胎盘,从绒毛分布和胎盘屏障结构看,分别属于子叶型和上皮绒毛膜型胎盘。妊娠21 d,母体的肉阜上皮与胎儿滋养层上皮形成不紧密的联系(图 2A);妊娠27 d,两者之间通过微绒毛互相嵌合,形成较广泛的紧密接触;妊娠36 d,这种接触全面发生、高度嵌合(图 2B);妊娠40 d后,滋养层上皮发出多级细长的分枝,形成发达的胎盘子叶,其突入到母体肉阜上皮的凹陷中,两者相互嵌合形成发达的胎盘块(图 2C);随着妊娠进程,胎盘块逐渐变大、其间的肉阜间区则逐渐缩小。妊娠50 d,在胎盘块底部出现程度轻微的胎盘血肿现象(图 2J)。肉阜间区的子宫内膜存在随孕龄增大而愈来愈发达的子宫腺和导管(图 2D~F)。
重点对滋养层上皮进行了观察。经PAS染色后,滋养层上皮明显可分为两类细胞:一类是单核滋养层细胞(UTC)(图 2K),PAS反应呈阴性,核呈球形或不规则形、色浅。另一类是以三种形式存在的PAS阳性滋养层巨细胞(TGC),其分布及形态特征如表 1和图 2G~I、K所示。
PAS染色的切片上,三种滋养层巨细胞细胞质中的阳性颗粒随孕龄增大呈一定的动态变化,滋养层上皮及子叶绒毛间隙中的滋养层巨细胞可见阳性颗粒呈现不同程度的释放后,细胞质着色变浅甚至完全排空后不着色的现象。
2.2 妊娠早期牛胎盘组织FGF4的分布特征荧光显微镜下,FGF4阳性反应呈绿色荧光,蓝色荧光为DAPI染的细胞核。FGF4在胎盘的不同区域均有分布。在各胎龄牛胎盘的滋养层上皮及间充质、肉阜上皮、肉阜间区子宫腔上皮及子宫腺上皮等部细胞细胞质均观察到FGF4阳性反应;从反应强度来看,以胎儿滋养层巨细胞及子宫腺上皮呈强表达(图 3)。随着妊娠进程,滋养层上皮FGF4阳性反应逐渐减弱,子宫腺上皮FGF4阳性反应有所增强。
Fgf4在不同时期牛胎盘组织的转录情况如表 2所示。由表 2可知,在所检测的各胎龄胎盘的羊膜、子叶及肉阜组织均检测到Fgf4 mRNA,其中,羊膜组织中Fgf4 mRNA的相对表达量在妊娠18 d时最大,而后随日龄加大呈降低-缓增-降低的趋势;子叶中Fgf4转录量在妊娠21 d后呈骤然降低而后增高的现象;而肉阜组织中Fgf4的转录量则呈现先逐渐升高然后降低的趋势。
哺乳动物在胚胎发育过程中的一个主要特征是形成胎盘,它是由母体的子宫内膜和胎膜(主要是尿囊绒毛膜)共同构成,在反刍动物胚泡发生附植后胎盘起到重要的功能。本研究观察结果显示,牛胎盘在妊娠早期为上皮绒毛膜类型(胎盘屏障分类)、绒毛分布形式为子叶型,这与文献报道的相符[16]。在牛妊娠的27 d,母体的子宫内膜上皮和胎儿的滋养层上皮借助微绒毛彼此穿插而发生完全的接触。至32~34 d,已建立起牢固的母-胎联系[17]。本研究观察结果与此基本相符,组织学观察显示,在妊娠的27 d,可观察到母体的肉阜上皮与胎儿滋养层上皮两者之间通过微绒毛互相嵌合,形成较广泛的紧密接触;至36 d发生全面接触、高度嵌合;至40、50 d,由多级的绒毛分枝与肉阜相互嵌合形成发达的胎盘块。Kamal等[18]就奶牛胎盘大体解剖学与环境和母体之间关系的研究也证实,对于发育的胎儿而言,子叶的表面积对于营养物质的转运至关重要,而掌握不同发育阶段胎盘块上子叶微绒毛的分枝情况就显得非常重要。本研究观察到,随着奶牛的妊娠进程,子叶上微绒毛分枝越来越发达、并与肉阜组织形成紧密的相互嵌合,这种形态学上的结构特征极大地增加母-胎之间联系区域的表面积,两者之间相互嵌入的程度也随着妊娠进程不断加深,子叶上绒毛通过愈来愈发达的细长多级分枝以加强母-胎盘界面建立营养输送关系,并通过增加两者之间的接触表面积以保证胎儿对营养物质的吸收。
组织学研究证实,反刍动物早期胎盘的滋养层上皮存在形态和功能上不同的两种滋养外胚层细胞——滋养层单核细胞和滋养层双核细胞,尤其双核细胞在胚胎附植前及整个妊娠阶段都存在于滋养外胚层,因此该类细胞在反刍动物的胚胎附植期和胎盘形成期中的作用显得尤为重要[19]。本试验结果表明,在牛妊娠早期的胎盘组织胎儿滋养层存在三种形态各异的滋养层巨细胞,它们主要分布在滋养层上皮间及子叶绒毛间隙,且细胞中的PAS分泌颗粒随妊娠进程呈一定的动态变化,在所观察的胎盘子叶组织均存在阳性颗粒不同程度的释放而细胞质着色变浅甚至完全不着色的现象。结果提示,PAS阳性滋养层巨细胞中糖原等物质释放出来后,可通过母-胎屏障转运到母体组织。一般认为,滋养层双核巨细胞系部分单核细胞在获取营养物质后经有丝分裂而成;之后,单核或双核的滋养层巨细胞经过一定方式的迁移、并和定居部位的肉阜上皮细胞发生融合,以实现营养或代谢物质的传输。本研究结果表明,在牛妊娠早期胎盘块中观察到的这几类不同的滋养层巨细胞,在胚胎发育过程的营养信息传递及滋养层绒毛上皮结构的特征维持上均发挥着重要作用。
本研究在50 d的胎盘块底部还发现“胎盘血肿”的存在,从胎盘屏障角度分析,该血肿并非由滋养层细胞对母体血管直接发生侵蚀而致,而可能是自母体肉阜部位毛细血管端渗出的部分血液积聚于母-胎结合面形成的一种现象,有关其功能意义还需要进一步的研究。
3.2 牛胎盘组织中FGF4的分布特点Krawchuk等[9]运用不同的Fgf4突变体基因型降低附植前胚胎中FGF4的含量,结果在内胚层特化中观察到一种母源性的Fgf4,它对于发育是非必需的。以外源性FGF4处理Fgf4突变体胚胎后,各种基因型胚胎的内胚层比例均以FGF4剂量依赖方式递增。表明FGF4是对小鼠胚泡期原始内胚层和外胚层比例进行调控的一种限制性因子。有研究者通过活细胞示踪法追踪8-细胞期的细胞谱系,发现在单独的内细胞团和随后的细胞命运的发育史之间并没有明确的联系。然而,通过抑制受体/丝裂原活化蛋白激酶(receptor/MAP kinase)通路或通过添加外源性FGF可以改变内细胞团(ICM)细胞向外胚层或内胚层转变的命运[20]。
运用基因打靶技术干扰小鼠Fgf4基因后,子宫移植纯合子胚胎,出现子宫蜕膜化,胚胎不能继续发育;体外培养的Fgf4纯合子胚胎也显示出严重的增殖障碍,而培养液中添加FGF-4蛋白时,内细胞团的生长和分化得以恢复。表明FGF4的异常表达阻止了ICM的生长和分化[11]。对小鼠敲除Fgf4基因后,出现胚胎植入后的流产现象,分析认为FGF4的异常表达可能干扰到小鼠胎盘的正常发育及功能[21]。通过免疫荧光染色发现,FGF4阳性反应特异性地存在于内细胞团,进一步研究显示,FGF4具有调控原肠形成中内细胞团分化为原始内胚层和外胚层的作用,决定着两个胚层的分布比例[9],并可调控胚内外胚层与胚外外胚层之间交流的诱导信号[10]。Feldman等[11]在小鼠的研究还发现,FGF4突变胚胎在着床前发生死亡,分析认为FGF4的异常表达严重干扰了小鼠早期胚胎发育期间囊胚内细胞团的分化和生长。
本研究在各胎龄牛胎盘块的滋养层上皮及间充质、肉阜上皮、肉阜间区子宫腔上皮及子宫腺上皮等部细胞的细胞质均观察到FGF4阳性反应,以胎儿滋养层巨细胞及子宫腺上皮呈强表达。在所检测的各胎龄胎盘的羊膜、子叶及肉阜组织均检测到Fgf4 mRNA,其中,羊膜组织中Fgf4 mRNA的相对量在18 d时最大,而后随孕龄增大而降低;子叶中的表达量在21 d后呈降低-增高的趋势;肉阜中的表达量则呈现先逐渐升高然后降低的现象。提示在附植之后的妊娠早期,由孕体和母体子宫内膜上皮(肉阜上皮、子宫腺上皮)均可合成FGF4,随着孕龄增大主要由母体子宫产生。这与Jeong等[22]的研究结果相符,他们的研究证实,妊娠早期的猪胚胎的孕体或子宫内膜可分泌FGF4,滋养层细胞FGF受体的激活正是由孕体或子宫内膜分泌的FGF4通过磷脂酰肌醇3-kinase PI3K/AKT通道转换信号来实现的,该通道又是与胚泡滋养层的细胞迁移密切相关,对猪胚胎的生长发育尤为重要。牛妊娠早期胎盘组织中FGF4的这种规律性定位及表达提示,FGF4在牛早期妊娠维持、胎盘发育及子宫细胞增殖分化中可能发挥重要作用。
4 结论妊娠早期的牛胎盘组织存在FGF4及其mRNA,其表达量在胎儿胎盘(子叶)表现为先降低而后增高的规律,而在母体胎盘(肉阜组织)则呈现先逐渐升高然后降低的趋势。
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