2. 中国兽医药品监察所国家动物布鲁氏菌病参考实验室, 北京 100083
, CHENG Rujia1,2, XU Guanlong2, FENG Yu2, SUN Shijing2, FAN Xuezheng2, PENG Xiaowei2, ZHU Liangquan2, QIN Yuming2, DING Jiabo2, CHANG Weishan1
, JIANG Hui2
2. National Reference Laboratory for Animal Brucellosis, China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100083, China
布鲁菌病(简称布病)是由布鲁菌(Brucella)引起的一种人畜共患病，其主要表现为波浪热、关节炎以及生殖系统障碍[1]，危害公共安全，并且给畜牧业造成严重的经济损失[2-3]。布鲁菌属有6个经典菌种，包括羊种布鲁菌(B. melitensis)、牛种布鲁菌(B. abortus)、猪种布鲁菌(B. suis)、犬种布鲁菌(B. canis)、绵羊附睾种布鲁菌(B. ovis)与沙林鼠种布鲁菌(B. neotomae)，随后又陆续发现6个新布鲁菌变种：海洋哺乳动物分离到的鳍种布鲁菌(B. pinnipedialis)和鲸种布鲁菌(B. ceti)，从红狐狸和土壤中分离到的田鼠型布鲁菌(B. microti)，以及还未有中文命名先例的B. inopinata、B. papionis和B. vulpis[4-7]。其中以羊种、牛种和猪种布鲁菌最为常见且危害性较高[8]。
牛种布鲁菌分为8个生物型，包括1、2、3、4、5、6、7和9型[9]，其中主要的流行株为1型、3型和5型[10]。牛种布鲁菌自然宿主为牛、野牛和麋鹿，其毒力强，易感染人[11]。牛种布鲁菌在麋鹿中最初被发现是在1998年美国的爱达荷州[12]，起初布鲁菌病被认为是从牛传染给麋鹿和野牛的一种外溢性传染病，而后被证实麋鹿也可以传染给牛[13]。鹿的布鲁菌病在世界各地广泛流行，我国关于鹿感染布鲁菌的报道较少，尚无针对鹿源布鲁菌分离株鉴定与测序分析的相关文章。本文对一株从患病麋鹿上分离到的布鲁菌(BJ1株)进行了系统的生化鉴定、毒力测定以及全基因组测序分析，为鹿的布鲁菌病的研究提供参考和依据。
1 材料与方法 1.1 主要菌株和试剂牛种布鲁菌参考强毒株B. abortus 2308、疫苗株B. abortus A19由本实验室保存；B. abortus BJ1株，本实验室于2018年5月从北京某鹿场一流产麋鹿的流产物中分离；单因子血清A、M、R由本实验室保存；Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)、DL1000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；QIAamp DNA Mini Kit购自QIAGEN；硫堇和碱性品红染料购自Sigma公司；胰大豆肉汤(TSB)和胰大豆琼脂(TSA)购自美国BD公司；结晶紫染色液、醋酸铅培养基购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2 生化鉴定 1.2.1 生化特性将B. abortus BJ1株在固体培养基中划线培养后，挑取单个菌落接种到2块新鲜的TSA平板上，分别置于普通生化培养箱和含5% CO2的培养箱，37 ℃培养72 h后，观察细菌生长情况；取100 μL菌液接种到含硫堇(1:25 000)和碱性品红(1:25 000)的TSA平板上，37 ℃培养72 h，观察细菌生长情况；挑取少许细菌培养物接种到醋酸铅培养基中，37 ℃培养72 h，观察培养基表面是否有呈黑色[14]。
1.2.2 S/R型鉴定用结晶紫染色液对菌落染色20 s后观察，粗糙型菌落边缘着色，界限不清晰。光滑型菌落边缘不着色，整齐，圆润[15]；取培养菌液用生理盐水配成浓度为1×109CFU·mL-1的菌悬液，取菌悬液5 mL加入试管中，置80 ℃水浴加热，2 h后观察结果。管底出现明显凝集者为粗造型菌株，不出现明显凝集者为光滑型菌株[16]。
1.3 特异性鉴定 1.3.1 血清学特异性取布鲁菌单因子血清A、M、R各20 μL，分别与等体积的B. abortus BJ1株菌悬液充分混匀进行玻片凝集试验，1~2 min内观察结果。
1.3.2 PCR特异性将B. abortus BJ1灭活，按照QIAamp DNA Mini Kit说明书步骤，提取基因组DNA作为后续PCR反应的模板。参照文献[14]合成AMOS-PCR引物。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。然后对PCR产物进行凝胶电泳分析。
1.3.3 16S rRNA测序参照文献[17]合成细菌通用16S引物，F：5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-ACCTTGTTACGACTT-3′，以B. abortus BJ1基因组为模板，扩增出目的片段后测序。
1.4 毒力测定350~400 g雌性豚鼠，分为3组，5只·组-1，以1×109CFU·只-1的剂量分别感染B. abortus BJ1株、牛种布鲁菌参考强毒株2308和疫苗株A19，14 d后剖检各组豚鼠，观察脾肿胀情况并称重。研磨脾组织，倍比稀释后接种TSA平板测定每克脾组织含菌量。
1.5 全基因组测序分析挑取单菌落涂板连续传两代后，使用无菌生理盐水洗下菌苔，离心并洗三遍后，于80 ℃水浴2 h灭活。按照QIAamp DNA Mini Kit说明书提取细菌DNA基因组。测定核酸浓度和纯度，送至上海烈冰生物科技公司测序。
2 结果 2.1 生化特性生化特性试验结果显示B. abortus BJ1株对CO2无依赖性，醋酸铅培养基培养后，菌落呈黑色，表明产H2S，在含有硫堇(1:25 000)和碱性复红(1:25 000)的TSA培养基上能生长(表 1)。结晶紫染色不着色，80 ℃水浴2 h后管底未出现明显凝集(图 1)。鉴定B. abortus BJ1为光滑型布鲁菌。
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表 1 B.abortus BJ1生化特性 Table 1 The biochemical characters of B. abortus BJ1 |
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A.结晶紫染色；B.热凝集试验 A. Cystal violet staining; B. Heat agglutination test 图 1 B.abortus BJ1表型鉴定 Fig. 1 Identification of bacterial phenotype |
B. abortus BJ1只与M因子血清呈现明显凝集反应，与A、R因子血清无凝集反应；AMOS-PCR结果扩增出牛种(494 bp)的特异性条带(图 2)；16S rRNA测序显示B. abortus BJ1株和牛种布鲁菌有100%的相似性。
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M. Marker 2000; 1. B. abortus 2308; 2. B. menlitensis M28; 3. B. suis S2; 4. B. canis RM6/66; 5. B. abortus BJ1 图 2 B.abortus BJ1的AMOS-PCR鉴定 Fig. 2 AMOS-PCR identification for B. abortus BJ1 |
用B. abortus BJ1菌液以1×109 CFU·只-1的剂量感染豚鼠14 d后，豚鼠脾均发生肿胀，每克脾组织含菌量为1.17×106~2.05×106 CFU，低于强毒菌株2308感染组(1.74×106~6.52×106 CFU)，极显著高于A19免疫组(2.83×104~6.34×106 CFU)。具体结果见图 3。
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图 3 B.abortus BJ1感染14 d豚鼠脾含菌量测定 Fig. 3 Spleen bacteria in guinea pigs infected by B. abortus BJ1 for 14 days |
组装得到的B.abortus BJ1基因组大小为3 270 584 bp，GC含量为57.23%，有2个scaffolds，2个contigs。经预测BJ1株有3 343个基因，3 275个CDS，其中编码基因3 113个，rRNA 9个，tRNA 55个，ncRNA 4个。全基因组序列已上传NCBI(染色体1：NZ_CP033079.1、染色体2：NZ_CP033080.1)。
2.4.2 B. abortus BJ1预测基因的COG数据库注释结合COG数据库对B. abortus BJ1株全基因组序列进行注释，3 113个基因可以分到22类聚类中，其中占比最多的功能为氨基酸的转运和代谢(amino acid transport and metabolism)以及预测到的通用功能(general function prediction only)。具体分类情况见表 2。
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表 2 布鲁菌BJ1基因功能注释COG功能分类 Table 2 COG function classification of B. abortus BJ1 |
通过与KEGG数据库比对分析，发现B. abortus BJ1株有1 339个基因分布于207个信号通路，其中占比最多的信号通路为代谢途径(metabolic pathways)、次生代谢产物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、微生物在不同环境中的代谢(microbial metabolism in diverse environments)、ABC转运蛋白(ABC transporters)和抗生素生物合成(biosynthesis of antibiotics)等。具体分布情况见图 4。
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图 4 布鲁菌BJ1基因功能注释KEGG代谢通路二级图 Fig. 4 KEGG pathway classification of B. abortus BJ1 |
通过对布鲁菌B. abortus BJ1株与2308株全基因组的基因比对，发现在基因编码区共86处Indel差异，针对这些位置设计引物，PCR扩增后测序比对，确认共46处差异，均位于染色体1，主要表达ATP结合蛋白和代谢相关的酶。详细信息见表 3。
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表 3 B.abortus BJ1与B.abortus 2308在基因区的基因突变 Table 3 Gene mutation results of B. abortus BJ1 and B. abortus 2308 in genetic region |
系统发育树可以用来表示系统发生研究的结果，并描述物种之间的进化关系。从NCBI基因组数据库中选取了国内外10株牛种布鲁菌的全基因组序列，根据Mauve软件[18]绘制了B. abortus BJ1的系统进化树(图 5)。
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图 5 基于全基因组序列的系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree based on whole genome sequences |
由图 5可知，B. abortus BJ1株全基因组与从内蒙古包头一奶牛场清洁工分离出的B. abortus 8416和河北满城区流产奶牛中分离出两株菌B. abortus MC和B. abortus BD有较高的同源性。
3 讨论布鲁菌病作为一种重要的人畜共患病，给人和动物的健康都带来巨大威胁，而且近年来，布病在国内呈反弹的趋势[14]。布鲁菌主要感染牛、羊、猪、犬等，但是越来越多的其他动物感染陆续被发现[19]。由于麋鹿品种的独特性，相关研究较少，而我国至今没有麋鹿群布病流调及鹿源布鲁菌鉴定分析的相关报道。
麋鹿归属于鹿科，随着我国养鹿业的发展，鹿感染布病越来越常见，阳性率有不断上升的趋势[20]。但与养殖业不同的是，麋鹿的生长环境更类似于野生环境，其传播途径难以追溯。曾有学者对美国麋鹿群体进行布病血清学调查研究，数据显示从20世纪70年代至今，美国麋鹿血清阳性率大致在0%~0.2%[21-23]。据推测可能与感染个体与家畜密切接触有关[24]，与美国野生动物生长环境相比，我国由于地理和社会环境的原因，加上存在放牧的饲养方式，野生动物与家畜接触的可能性非常大，这加大了野生动物感染布鲁菌的风险[25]。而对于野生动物实施布病监测非常困难，故而我国野生动物的真实布病流行情况无法完全掌握，这给我国的布病防控带来一些困难。本研究旨在全面鉴定从麋鹿上分离到的B.abortus BJ1株的生化特性，并分析其全基因组，为我国野生动物布病流调及防控奠定基础。
牛种布鲁菌在我国广泛流行，32个省份均有报道。根据20世纪末从21个省内的人和动物中分离出的3 425株布鲁菌的鉴定，牛种布鲁菌占13.64%[10]。目前，国内牛种布鲁菌的流行株主要为1型、3型和5型。根据OIE手册的判定标准，B. abortus BJ1的生化特性和单因子血清反应性表明其为牛种9型。全基因组系统进化树的结果显示，它与B. abortus 8416有着很高的同源性。经查阅相关文献得知，B. abortus 8416是从内蒙古包头一牛场清洁工身上分离出来的，其常规生化特性和表性特征属于牛种生物9型，但MLVA分型结果却显示B. abortus 8416与牛种生物3型最密切相关，鉴于其表型和分子分型之间存在差异，推测其可能为牛种生物9型的新变体[26]。B. abortus BJ1的MLVA分型还需进一步确认。国内对于9型的相关报道和研究较少，牛种9型的生物学特征与其他生物型均有差异[27]。目前牛种9型已在我国陆续被分离鉴定[28]，是否已成为我国牛种的重要流行株，需要作进一步的调研。
豚鼠对布鲁菌有较高的敏感性，是研究布鲁菌毒力的良好试验模型[29]，因此本试验选择豚鼠来测定B. abortus BJ1的毒力。BALB/c小鼠虽然也经常被用作布鲁菌的毒力试验，且为OIE推荐布鲁菌毒力的方法，但是根据本实验室前期研究发现，不同小鼠个体之间有时差异较大，而豚鼠则差异很小。《兽医生物制品规程》[30]中对布病疫苗种毒的毒力规定，豚鼠每克脾含菌量应不超过2×105CFU，本研究测定的B.abortus BJ1为1.17×106~2.05×106CFU，高于《兽医生物制品规程》对疫苗毒力规定的上限，我们把它归为强毒株范畴。
本研究中，B. abortus BJ1通过与COG数据库注释得到3 113个基因，这些基因主要参与氨基酸和碳水化合物的转运和代谢、能量产生及传递、翻译、核糖体和生物膜合成等生物学过程。研究发现氨基酸和碳水化合物对布鲁菌至关重要，是其主要的能量和碳源来源[31]，在B. abortus BJ1中共有625个基因参与氨基酸和碳水化合物的转运和代谢，占了大约1/5，表明了氨基酸和碳水化合物对B. abortus BJ1的重要性。随后对其进行KEGG数据库注释发现，B. abortus BJ1株有1 339个基因分布于207个信号通路，其中大多数和代谢相关。布鲁菌是胞内寄生菌，需要应对胞内复杂的环境[32]，这些基因可能和布鲁菌适应胞内生存有关。通过B. abortus BJ1和B. abortus 2308的全基因组比对分析与验证，发现在基因编码区内存在46个Indel差异，这些存在小片段插入与缺失的基因大多和代谢相关。ABC转运蛋白是一种膜蛋白，在细菌中，ABC转运体催化必需营养物质的摄取或有毒物质的排出[33]，ABC转运蛋白的突变是否会对BJ1株该方面的功能产生影响还需要进一步的研究。UreE是脲酶辅助蛋白，脲酶催化尿素水解，产生氨和二氧化碳，研究发现产生脲酶的菌株在尿素存在下对强酸具有抗性，有助于布鲁菌通过胃肠道感染[34]，UreE的突变是否对BJ1株抗酸性造成影响有待进一步的研究。其他代谢基因的差异是否与毒力相关，还是由于分离株因适应机体环境而产生变化尚需进一步验证。
4 结论通过生物学特征、全基因组测序等方式全面鉴定了一株鹿源牛种布鲁菌B. abortus BJ1，鉴定其为布鲁菌牛种9型，为深入了解我国布病发生情况和野生动物布病防控提供参考。
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