畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (8): 1642-1648. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.08.013    PDF    
基于猪丁型冠状病毒重组S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
侯林杉1, 贾敬亮2, 顾文源3, 刘宝京1, 师乾凯1, 袁广富1, 陈少杰1, 范京惠1, 左玉柱1     
1. 河北农业大学动物医学院, 保定 071001;
2. 衡水市畜牧技术推广站, 衡水 053000;
3. 河北省动物疫病预防控制中心, 石家庄 050035
摘要:为了解猪丁型冠状病毒(PDCoV)的流行情况,为PDCoV血清抗体检测提供工具,本研究应用原核表达系统表达部分PDCoV纤突蛋白(S)作为检测抗原,建立了基于PDCoV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并用该方法检测了2017年1月至12月自河北地区部分猪场收集的待检血清样品570份。结果显示:本研究建立的PDCoV间接ELISA方法能够特异地检测血清中的PDCoV抗体;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及伪狂犬病病毒的抗血清无交叉反应;批内重复变异系数1.9%~5.4%、批间重复变异系数2.3%~5.1%。570份待检血样中105份呈阳性,阳性率为18.4%(105/570),高于之前本实验室检测2016年1月至2016年10月河北地区PDCoV IgG抗体阳性率(11%),提示河北地区PDCoV的感染率呈上升趋势。本研究建立的ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点,可用于临床PDCoV血清抗体的检测。
关键词猪丁型冠状病毒    重组S1蛋白    间接ELISA    
Establishment and Application of an Indirect ELISA Based on Recombinant S1 Protein for the Detection of Antibodies against Porcine Deltacoronavirus
HOU Linshan1, JIA Jingliang2, GU Wenyuan3, LIU Baojing1, SHI Qiankai1, YUAN Guangfu1, CHEN Shaojie1, FAN Jinghui1, ZUO Yuzhu1     
1. College of Veterinary Medicine, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China;
2. Hengshui Animal Husbandry Technology Promotion Station, Hengshui 053000, China;
3. Hebei Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention, Shijiazhuang 050035, China
Abstract: This study was conducted to understand porcine deltacoronavirus (PDCoV) epidemic situation, and provide a tool for PDCoV serum antibody detection and the epidemiological investigation. Prokaryotic expression of recombinant PDCoV partial spike (S) protein was used as detection antigen, and an indirect ELISA antibody detection method based on PDCoV S1 protein was established. The method was used to detect 570 serum samples collected from some pig farms in Hebei from January to December 2017. The results showed that the established ELISA method of PDCoV IgG antibody in this study could specifically detect PDCoV antibody; no cross-reaction with antisera against porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine circovirus type 2 (PCV2), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), classical swine fever (CSF) and pseudorabies virus (PRV) was found. The coefficients of variation (CV) of repeated in-batch test was 1.9%-5.4%, CV of batch-to-batch test was 2.3%-5.1%. In 570 blood samples, 105 were positive, and the positive rate was 18.4% (105/570), which was higher than the positive rate of PDCoV IgG antibody (11%) in Hebei from January 2016 to October 2016. It is suggested that the infection rate of PDCoV in Hebei is on the rise. The ELISA method established in this study had the advantages of high sensitivity, strong specificity and good reproducibility, and can be used for the detection of clinical PDCoV serum antibodies.
Key words: PDCoV     recombinant PDCoV S1 protein     indirect ELISA    

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)是近年来新发现的猪肠道冠状病毒,自2012年Woo等[1]首次从中国香港猪群中检测到以后,相继在美国、加拿大、韩国、泰国等国家出现并被报道[2-3]。PDCoV可感染不同品种和日龄的猪,临床症状与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)极为相似。感染后主要表现仔猪脱水、呕吐、腹泻、死亡等症状,组织病理学与感染PEDV的仔猪同样表现为肠上皮空泡化、小肠上皮萎缩[4-5],PDCoV对感染仔猪的致死率为30%~40%,且多与PEDV发生混合感染[6]。由于PDCoV是近年来刚发现的新病毒,目前尚无有效的疫苗和药物用于防控,因此,建立快速灵敏的病毒学或血清学检测方法,对其流行病学进行研究,有助于本病的防控。

PDCoV是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长25.4 kb,与其他已知的冠状病毒相似,共编码4种结构蛋白,分别为表面纤突蛋白(spike, S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)[7]。其中的S蛋白位于病毒表面,可假定为S1和S2两个区域,S2区的主要功能是介导细胞与病毒的融合,S1区域则是S蛋白诱导产生中和抗体的主要位点和抗原结合位点[8-9]。因此,S蛋白是检测冠状病毒抗体和冠状病毒感染的理想抗原。目前S蛋白已被作为靶蛋白用于建立PEDV、TGEV及PDCoV等冠状病毒的ELISA诊断方法[10-12]

目前,对PDCoV感染的确定,主要是应用各种PCR方法来检测病毒的核酸,而用于检测PDCoV抗体的血清学方法却很少。因此,本研究以重组PDCoV S1蛋白作为检测抗原, 建立了检测PDCoV IgG抗体的间接ELISA方法,并用该方法对河北地区2017年1月至12月间25个猪场进行检测,以期为猪PDCoV IgG抗体水平的检测及PDCoV流行情况的血清流行病学监测提供一种快速、灵敏的检测方法。

1 材料与方法 1.1 病毒、血清

PDCoV(MF948005.1)由本实验室自河北保定某猪场分离并保存,抗PDCoV阳性血清采自粪便样本经RT-PCR检测呈阳性的猪群, 阴性血清采自PDCoV阴性猪场。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等的阳性血清由本实验室保存。收集河北省2017年1月至12月间不同地区猪场待检血样570份。

1.2 主要试剂和材料

辣根过氧化物酶(HRP)标记的家兔抗猪IgG购自北京博奥森生物有限公司;His标签纯化试剂盒(包涵体蛋白)购自康为世纪生物科技有限公司,TMB显色液购自索莱宝生物科技有限公司;pET-32a表达质粒由本实验室保存。

1.3 引物设计

根据PDCoV HB-BD株S基因全序列(GenBank登录号MF037204)设计一对特异性表达引物,预期扩增片段为798 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,上游引物F:5′-CCG-GAATTCCACGAAGTGGAGGATGGGTT-3′(EcoRⅠ), 下游引物R: 5′-CCGCTCGAGTGGATGGTCGAGTATTCTGTAATGT-3′(XhoⅠ)。

1.4 PDCoV S1基因克隆、表达及鉴定

以本实验室保存的PDCoV S1亚基菌液为模板[13],利用“1.3”设计的特异性表达引物通过PCR扩增PDCoV-S1基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(美国BIOMIGA公司)回收纯化,将其连接至pET-32a载体并转化到Trans 5α感受态细胞,提取重组质粒,经测序正确的阳性重组质粒命名为pET-32a-S1,转化到BL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol·L-1的IPTG于37 ℃诱导表达后,对表达的S1重组蛋白进行SDS-PAGE检测,并使用His标签蛋白纯化试剂盒纯化。纯化的蛋白经SDS-PAGE后,采用半干转印法转印到NC膜上,进行Western blot鉴定。

1.5 间接ELISA方法的建立 1.5.1 抗原最适包被浓度和抗体最适稀释度的确定

试验根据方阵滴定法确定抗原最适包被浓度和血清最适稀释度。以纯化的PDCoV重组蛋白为抗原,使用包被液将抗原稀释为6个梯度,100 μL·孔-1包被96孔酶标板,每个稀释度作两个重复,4 ℃包被过夜;使用合适的封闭液封闭后,阴、阳性血清作1:25、1:50、1:100、1:200、1:400稀释,100 μL·孔-1依次加入酶标板组成方阵;兔抗猪IgG-HRP作1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:40 000稀释后100 μL·孔-1依次加入酶标板。按照常规间接ELISA方法进行其余操作,当阳性血清OD450 nm值接近1.0且与阴性血清OD450 nm的比值(P/N)最大时,为最佳抗原包被浓度和抗体稀释度。

1.5.2 最适封闭液的确定和其他反应条件的优化

在已确定的抗原包被浓度、血清和酶标二抗稀释度的情况下,分别以5%新生牛血清、5%胎牛牛血清、5%脱脂奶粉和1%BSA作为封闭液。分别对包被条件、封闭时间、一抗作用条件、酶标二抗作用条件和显色时间进行优化,根据“1.5.1”中的判定标准确定最佳反应条件。

1.6 血清阴、阳性临界值的确定

按优化的反应条件,对30份PDCoV阴性血清进行间接ELISA检测,每个样品设3个重复,并计算样品OD450 nm的平均值(x)和标准差(s),确定样品的阴、阳性临界值。根据统计学分析,当样品OD450 nmx+3s时,判定结果99.9%以上为阳性;当样品OD450 nm < x+2s时,判定为阴性;当x+2s < 样品OD450 nm < x+3s时,判定结果为可疑。

1.7 特异性试验和重复性试验

按已建立的PDCoV S1蛋白间接ELISA方法检测已知的PEDV、TGEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PRV阳性血清,每份血清3个重复,同时设立PDCoV阴、阳性血清对照,验证该方法特异性。使用同一批纯化的重组蛋白做抗原,按照已建立的间接ELISA方法检测5份PDCoV阳性血清样品,每份样品平行重复5次。使用三批纯化的重组蛋白作为抗原检测上述5份PDCoV阳性血清样品,测定OD450 nm值,计算批内、批间变异系数(CV)。

1.8 符合率试验

从“1.1”中收集到的阴、阳性血清中随机挑选60份,分别采用本研究建立的间接ELISA方法和中和试验对血清样品进行检测,以中和试验结果为标准计算ELISA方法的阴、阳性符合率。中和试验采用固定病毒-稀释血清法,试验用病毒为本实验室稳定传代的PDCoV HB分离株,具体步骤如下:将60 ℃灭活30 min的待检血清加入96孔培养板,并做连续2倍稀释至1:64(50 μL·孔-1),同时加入等量稀释至200个TCID50的病毒悬液,混匀后37 ℃孵育60 min;中和反应发生后各孔补加2×105个ST细胞(100 μL·孔-1),置37 ℃、5%CO2培养箱培养5 d,逐日观察细胞CPE。以中和试验结果作标准,计算间接ELISA方法的阳性符合率、阴性符合率和总符合率。

1.9 临床样品的检测

在最佳条件下,使用本试验建立的PDCoV S1重组蛋白间接ELISA方法对2017年1—12月从河北各地区收集的570份血清进行检测,并加阴性和阳性血清为对照,统计相关数据。

2 结果 2.1 重组蛋白的表达、纯化及鉴定

含pET-32a-S1的BL21菌液在37 ℃下经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,可见大小约为50 ku的蛋白条带。由图 1可知,蛋白表达量在4 h的时候达到峰值,而未经诱导的菌液和pET-32a空载体均未出现目的条带。

a.重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析(M.蛋白质分子质量标准;1. pET-32a(BL21)经IPTG诱导4 h;2~6.重组蛋白S1诱导0~4 h);b.重组蛋白的Western blot鉴定(M.蛋白质分子质量标准;1.重组蛋白) a. Identification of the truncated recombinant protein S1 protein by SDS-PAGE(M. Protein molecular weight marker; 1. pET-32a induced with IPTG 4 h; 2-6. IPTG-induced recombinant S1 protein for 0, 1, 2, 3, 4 h, respectively); b. Western blot detection of recombinant S1 protein (M. Protein molecular weight marker; 1. Recombinant S1 protein) 图 1 重组S1蛋白的SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定 Fig. 1 SDS-PAGE electrophoresis and Western blot identification of recombinant S1 protein

超声波裂解菌液,将菌液上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳, 结果显示, 表达的蛋白质在沉淀中, 以包涵体的形式存在。使用His标签纯化试剂盒将重组蛋白纯化后进行Western blot分析,在50 ku处出现一条清晰的反应条带,说明重组蛋白在BL21(DE3)中得到正确表达且具有良好的免疫反应活性。

2.2 PDCoV S1重组蛋白间接ELISA方法的建立及优化

经过方阵滴定和ELISA各步骤反应条件的优化,确定最佳的抗原包被量和抗体稀释度,最终条件见表 1

表 1 间接ELISA检测方法反应条件的优化 Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA
2.3 阴阳性临界值的确定

按上述已经优化的ELISA方法对本实验室保存的30份PDCoV阴性血清进行检测,应用SPSS软件分析测得的OD450 nm值,计算其平均值x=0.191,标准差s=0.059。当检测样品血清OD450 nm≥0.368时,判定结果为阳性;当检测样品血清OD450 nm < 0.309时,判定结果为阴性;当OD450 nm值介于两者之间时,判定为可疑。

2.4 特异性试验

为了鉴定本试验所建立的间接ELISA方法的特异性,利用建立的方法对PEDV、TGEV、PCV2、PRRSV、CSFV和PRV 6种病毒的阳性血清进行检测,结果显示纯化的重组蛋白S1仅能够与PDCoV阳性血清发生反应,除PDCoV阳性血清OD450 nm值为1.076外,其余血清检测结果均小于0.309,结果表明所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。

2.5 重复性试验

随机选择5份PDCoV阳性血清样品分别进行批内和批间重复性试验,分析结果显示批内重复变异系数(CV)在1.9%~5.4%,批间重复变异系数在2.3%~5.1%,变异范围均小于10%。两个重复性试验表明重组PDCoV S1蛋白作为检测抗原具有良好的重复性。

2.6 间接ELISA方法与中和试验的符合率

在中和试验检测中,当血清稀释至1:4或更小稀释倍数若孔内细胞出现CPE判定为PDCoV阴性血清。结果显示本研究建立的间接ELISA检测阳性样品21份,阴性样品39份;中和试验检测结果为阳性样品25份,阴性样品35份,以中和试验结果作为标准计算ELISA方法阳性符合率为80.95%,阴性符合率为79.49%,总符合率为80%(表 2)。

表 2 两种方法对60份待检血清的检测结果 Table 2 The test results of two methods for 60 clinic serums
2.7 临床样品的检测

应用PDCoV S1重组蛋白间接ELISA方法对河北部分地区25个猪场的570份血清进行检测,检测结果显示血清样品的阳性率为18.4%(105/570),其中未发生腹泻猪场的血清样本中的抗体阳性率为13.0%(47/360),发生腹泻猪场的血清样本中的抗体阳性率为27.6%(58/210)。

3 讨论

由于PDCoV是近年来新发现的猪肠道冠状病毒,且易与PEDV、TGEV等肠道病毒发生混合感染,临床上很难准确判断致病病原,因此现阶段针对该病毒主要依靠于实验室检测[14]。在病原检测方面国内外已建立了基于PDCoV MN基因的RT-PCR、巢式RT-PCR和qRT-PCR等方法[15-18],笔者实验室还建立了PDCoV与PEDV的双重实时荧光定量RT-PCR方法[19],而用于检测该病毒的血清学检测方法较少,仍处于开发阶段。杨浩等[20]、逄凤娇等[21]、张帆帆等[22]先后以原核表达重组N蛋白为抗原建立了间接ELISA方法,Luo等[23]以原核表达的重组M蛋白建立了检测PDCoV IgG抗体ELISA检测方法。然而一些研究表明PDCoV的M、N蛋白并不是建立血清学检测方法的最佳抗原,在Ma等[8]的研究中发现,PEDV和PDCoV的N蛋白上的抗原表位可能导致两种病毒发生双向抗原交叉反应,在Gimenez-lirola等[24]的研究中使用以PEDV M蛋白为抗原构建的ELISA方法对PDCoV阳性血清进行抗体检测时出现阳性结果,作者推测两种病毒的M蛋白可能存在共同抗原表位。与之相比,虽然PDCoV S1基因在基因序列上存在较多点突变,但B细胞抗原表位预测结果显示,不同分离株S1蛋白在抗原表位上基本保持一致[25]。Thachil等[10]和王经纬等[26]分别以真核表达系统和昆虫-杆状病毒表达系统表达PDCoV S1亚基为抗原,建立了间接ELISA方法,在试验过程中也未与其他病毒阳性血清出现交叉反应。但两者使用的表达系统与本实验室用的原核表达系统相比成本较高、操作复杂、实验周期较长,不利于该检测方法的普及和应用。

本研究针对PDCoV S1亚基的优势抗原表位, 构建pET-32a-S1重组表达载体,原核表达大量高浓度的重组S1蛋白,经Western blot鉴定具有良好的抗原性。通过优化抗原最适包被浓度和包被条件、血清最适稀释倍数、酶标抗体最适稀释倍数和反应条件以及封闭液和封闭条件,建立了基于重组PDCoV S1蛋白的IgG抗体间接ELISA检测方法。在符合率试验中分别使用本研究建立的ELISA方法与中和试验平行检测60份血清样本,结果显示具有很高的符合率;在特异性试验中,本研究建立的间接ELISA方法与PEDV、TGEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PRV的阳性血清均不发生交叉反应,证明了该方法具有很高的特异性;在批内重复试验、批间重复试验中,组间、组内变异系数均小于10%,证明了该方法重复性较好,检测结果可信度高。

为了解河北地区2017年PDCoV感染情况,本研究使用建立的间接ELISA方法对2017年1月至12月河北地区25个猪场收集的570份血清进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为18.4%(105/570),与之前本实验室对2015年1月至2016年10月河北地区PDCoV IgG抗体阳性率(11%)[22]相比有所提高。临床血清样品检测结果表明河北地区PDCoV感染率呈上升趋势。这个结果的确定仍需要通过对PDCoV流行病学进行更为广泛的血清学调查来证实。

4 结论

利用体外原核表达系统获得大量高浓度的猪丁型冠状病毒(PDCoV)重组S1蛋白,建立了以纯化的S1蛋白为抗原的间接ELISA方法, 该方法与其他常见猪病病毒抗血清不发生交叉反应,具有良好的特异性、敏感性、重复性。使用本方法对2017年1月至12月临床血清样品检测结果表明河北地区PDCoV感染率与2016年相比呈上升趋势,对PDCoV进一步的流行病学调查研究具有参考价值。

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