2. 贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
4. 贵州大学生命科学学院, 贵阳 550025
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in Guizhou, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
4. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)又称GDF8(growth differentiation factor 8,GDF8),是一种负调控骨骼肌生长和分化的分泌型蛋白,属于TGF-β超家族的成员之一。MSTN基因在动物幼年及成年时期的骨骼肌及乳腺中高表达[1],在心、肝和脂肪组织中低表达[2]。MSTN基因的突变或敲除会导致动物肌肉异常发达而出现“双肌”表型,这在牛、狗和鼠等动物上都得到了证实[3-5]。也有报道指出,适度抑制MSTN基因的表达水平会导致肌肉的肥大,而MSTN基因的完全抑制会引起增生[6-8],王红娜等[9]报道,通过干扰MSTN基因的表达能够抑制成肌细胞的增殖,而对分化有促进作用。肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)是MEF2家族成员之一,其能调节多种细胞的增殖与分化。MEF2C基因具有组织特异性,广泛存在于肌肉组织中,尤其是骨骼肌和心肌[10]。MEF2C可与一些肌肉特定基因启动子直接结合来调控肌肉发育,而敲除MEF2C基因的小鼠,肌纤维在出生后会迅速出现病变,进而造成心肌、骨骼肌和平滑肌发育的紊乱[11-13]。另有研究表明,MEF2C可能通过结合MSTN启动子的相关位点来调节肌纤维类型相互转换[14]。MEF2C基因可以作为黄牛胴体和肉质性状遗传标记基因[15]。罗婷等[16]建立了MSTN基因敲除小鼠模型,该小鼠腿部骨骼肌肌纤维增粗及体重显著增加。但是,由于MSTN基因启动子的转录调控模式在不同动物之间存在差异,这些调控元件在不同物种间对MSTN启动子的调控机制还需要继续深入研究[14, 17]。因此,研究MEF2C转录因子对牛MSTN启动子在转录水平的调控机制,在动物肌肉发育和产肉性能方面具有重要意义。
本研究首先采用PCR扩增MSTN基因启动子全长序列2 267 bp,再结合课题组前期得出该启动子上具有转录因子结合的位点,构建双荧光素酶报告载体,通过脂质体法转染小鼠C2C12成肌细胞来检测MEF2C对MSTN启动子活性的影响。其次构建pEGFP-N3-MSTN-P1-MEF2C重组表达载体,转染细胞,检测MEF2C在不同细胞中的mRNA表达水平,以期研究了解牛MSTN启动子与MEF2C在转录水平的相互调控作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料背最长肌组织采集于贵州省安顺市幺铺镇屠宰场体况相近的成年关岭牛;小鼠C2C12成肌细胞和大鼠下颌腺上皮细胞均购自中国科学院上海细胞库;真核表达载体pcDNA3.1(+)购自美国Invitrogen公司;荧光报告载体pGL3-Basic和pEGFP-N3空载体均由本实验室保存。
1.2 主要试剂动物基因组DNA、RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、T-载体、质粒抽提试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司;逆转录试剂盒(Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)、限制性内切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、KpnⅠ、AseⅠ和NheⅠ均购自赛默飞世尔(Thermo)科技有限公司;T4 DNA ligase购自大连宝生物公司;无内毒素质粒小提试剂盒购自OMEGA公司;Lipofectamine 3000转染试剂、DMEM高糖培养基均购自Invitrogen公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司、胰蛋白酶替代物TrypLE、Gibco胎牛血清均购自GIBCO公司。
1.3 试验方法 1.3.1 牛MSTN基因启动子区克隆及其荧光报告载体的构建按照动物组织DNA提取试剂盒操作说明提取关岭牛背最长肌组织DNA,并电泳检测DNA质量。根据牛MSTN基因启动子序列(GenBank序列号:DQ530260),采用Promoter 2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)预测MSTN基因启动子区,再用Primer 5.0软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计带有酶切位点的上下游引物(表 1),扩增MSTN基因启动子序列2 267 bp(酶切位点分别为KpnⅠ和XhoⅠ)。PCR反应体系:DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,2×Es Taq MasterMix 10 μL,ddH2O补足20 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 90 s,72 ℃ 10 min,35个循环。将回收纯化的目的片段与pUCm-T载体连接,把经测序验证正确的目的片段与pGL3-Basic载体进行双酶切连接,构建荧光报告载体pGL3-Basic-MSTN。
采用Trizol法提取关岭牛背最长肌总RNA,按照逆转录试剂盒(Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)操作说明,逆转录为cDNA。根据牛MEF2C基因的mRNA序列(NM_001046113),采用Primer 5.0软件设计带有酶切位点的上下游引物(酶切位点分别为BamH Ⅰ和Xho Ⅰ),以cDNA为模板扩增MEF2C基因CDS区1 425 bp。PCR反应体系:cDNA模板4 μL,上、下游引物各3 μL,2×Taq PCR Master Mix 15 μL,ddH2O补足30 μL。反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,72 ℃ 10 min,35个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳和测序验证正确后,继续通过双酶切连接到pcDNA3.1(+)载体上,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MEF2C(引物序列见表 1)。
1.3.3 小鼠C2C12细胞的培养及瞬时转染用含10%胎牛血清的DMEM培养基,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养小鼠C2C12成肌细胞(Myoblast),待细胞生长到80%~90%汇合时,采用LipofectamineTM3000脂质体法将pEGFP-N3空载体转染C2C12细胞,观察C2C12细胞的生长状态及转染效果,同时将pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C共转染小鼠C2C12细胞,海肾素酶活性参照pRL-TK载体,每次转染设3个复孔,同一试验重复3次,24 h后检测其双荧光素酶活性,以M1/M2为被检测载体的相对荧光素酶活性(M1为PGL3-Basic-MSTN报告载体的萤火虫荧光素酶活性;M2为pRL-TK的海肾荧光素酶活性),取3次试验的平均值(转染体系见表 2)。
在本课题组已筛选的MSTN启动子核心区的基础上,选择一段即满足核心区范围,又含有MEF2C转录因子结合位点的序列MSTN-P1(-475 ~-1 090 bp),采用Primer 5.0软件重新设计含酶切位点的引物(上下游酶切位点分别为Ase Ⅰ和Nhe Ⅰ),以上述构建的重组质粒pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C为模板分别扩增MSTN启动子核心区P1片段(MSTN-P1)和MEF2C基因CDS区,PCR扩增的体系条件同上。采用双酶切连接的方法将MSTN-P1片段连接到pEGFP-N3载体上,以核心启动子片段MSTN-P1的活性替代pEGFP-N3载体的(CMV)启动子区,经酶切测序验证正确后;将MEF2C与重组质粒pEGFP-N3-MSTN-P1进行双酶切连接,构建重组表达载体pEGFP-N3-MSTN-P1-MEF2C,经酶切测序验证无误后,将重组表达载体分别转染小鼠C2C12成肌细胞和大鼠下颌腺上皮细胞,转染12~24 h后观察细胞发出绿色荧光的情况(引物序列见表 1)。
1.3.5 MEF2C基因在小鼠C2C12细胞和大鼠下颌腺上皮细胞中的表达转染48 h后,Trizol法提取小鼠C2C12细胞和大鼠下颌腺上皮细胞总RNA,并逆转录成cDNA,采用Primer 5.0设计荧光定量引物(qMEF2C),以牛GAPDH为内参基因(qGAPDH),以未转染任何质粒的小鼠C2C12细胞和大鼠下颌腺上皮细胞作为空白对照。荧光定量PCR体系(10 μL):2×ULtraSYBR Mixture(High ROX) 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 3.2 μL。反应条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,61 ℃ 1 min,40个循环后进行熔解曲线分析,以每5 s上升0.5 ℃的速率从65 ℃升高到95 ℃,荧光信号在循环结束时检测,每个样品做3个重复。
1.3.6 数据统计分析以M1/M2为被检测载体的相对荧光素酶活性,取3次试验的平均值,并用t-test差异检验差异是否具有统计学意义。实时荧光定量PCR所得MEF2C、GAPDH基因表达量采用2-△△CT方法计算,采用SPSS Statistics 18.0软件对所得数据进行单因素方差分析,结果用“X±SD”表示,显示为柱状图和误差线。
2 结果 2.1 牛重组质粒pGL3-Basic-MSTN与pcDNA3.1(+)-MEF2C的构建及鉴定以提取的关岭牛背最长肌组织DNA和逆转录cDNA为模板,PCR扩增MSTN启动子序列和MEF2C基因CDS区,产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,并胶回收目的条带,将回收纯化的目的片段分别与载体进行双酶切连接。以重新提取的重组质粒pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C为模板进行双酶切鉴定,电泳条带与目的条带大小相符(图 1A、1B),经测序验证无误后,成功构建了pGL3-Basic-MSTN荧光报告载体和pcDNA3.1(+)-MEF2C真核表达载体(测序结果见图 2)。
将构建正确的pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C真核表达载体共转染至小鼠C2C12细胞,以pGL3-Basic空载体为试验对照组,转染24 h后,检测其双荧光素酶活性。结果显示,转染了pEGFP-N3空载体的C2C12细胞发出的绿色荧光情况良好(图 3B),说明其转染效果好。共转染pcDNA3.1(+)-MEF2C试验组的相对荧光素酶活性是pGL3-Basic-MSTN试验组的2倍(P < 0.05),是pGL3-Basic对照组的3.6倍(P < 0.01)(图 4),有统计学意义。结果表明,MEF2C基因能显著上调MSTN启动子活性。
将成功构建的pEGFP-N3-MSTN-P1-MEF2C重组表达载体分别转染小鼠C2C12细胞和大鼠下颌腺上皮细胞,12~24 h后观察细胞发光情况。结果显示,这2种细胞均能发出微弱的绿色荧光(图 5C、5D),初步说明MSTN-P1启动子核心片段能驱动MEF2C基因在细胞中表达。48 h后,提取细胞总RNA,以逆转录的cDNA为模板,采用qRT-PCR检测MEF2C基因在这2种细胞中mRNA的表达量。结果显示,在小鼠C2C12细胞中,MEF2C基因mRNA表达量是空白对照组的3倍(P < 0.01,图 6A);在大鼠下颌腺上皮细胞中,MEF2C基因mRNA表达量是空白对照组的1.8倍(P < 0.05,图 6B)。结果表明,在2种细胞中MEF2C基因mRNA表达量均高于空白对照组,说明MSTN启动子核心片段能驱动MEF2C基因在小鼠C2C12细胞和大鼠下颌腺上皮细胞中表达,且MEF2C基因在小鼠C2C12细胞中的mRNA表达量高于在大鼠下颌腺上皮细胞的表达量。提示,在转录水平,MSTN启动子与MEF2C转录因子有相互调控作用,可能在C2C12成肌细胞中的调控机制更为关键。
本试验扩增了牛MSTN启动子的全长序列,通过双酶切连接的方法,分别构建了报告载体pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C真核表达载体,将其共转染小鼠C2C12细胞,发现,共转染pcDNA3.1(+)-MEF2C试验组的相对荧光素酶活性是pGL3-Basic-MSTN试验组的2倍(P < 0.05),是pGL3-Basic对照组的3.6倍(P < 0.01)。结果表明,MSTN启动子具有启动活性,且MEF2C能显著增强MSTN启动子活性。李佳等[18]报道,猪MSTN启动子上含有MEF2C转录因子结合位点,且能明显上调MSTN启动子活性,与本研究结果一致。MEF2C属于MEF2(MEF2A、MEF2B和MEF2D)家族成员之一,是影响成肌细胞分化过程中特异性基因的转录因子[19]。在成年小鼠中,MEF2C高表达于骨骼肌中,脾中也有少量表达,而MEF2A、MEF2B和MEF2D则广泛表达于小鼠的各个组织中[20-21]。近期研究表明,敲除与MEF2家族相关的microRNA可导致动物在胚胎期致死或骨骼肌发育不全、肌纤维形态异常等现象[22]。如果同时敲除MEF2A、MEF2C和MEF2D这3个基因会导致肌肉再生能力受阻[23]。已有报道表明,MEF2C可以与一些调控肌肉生长发育的基因启动子相结合,并激活或增强肌源性启动子的活性[24]。
根据试验组前期筛选出的MSTN启动子上MEF2C转录因子的结合位点(TTAATATTAAA,位于-587 ~-598 bp)[25],继续构建pEGFP-N3-启动子-转录因子重组真核表达载体。把成功构建的pEGFP-N3-MSTN-P1-MEF2C重组质粒转染小鼠C2C12细胞和大鼠下颌腺上皮细胞,分别以未转染任何质粒的细胞为空白对照。结果发现,这2种细胞均能发出微弱的绿色荧光,在小鼠C2C12细胞中,MEF2C基因的mRNA表达量极显著高于空白对照组(P < 0.01),在大鼠的下颌腺上皮细胞中,MEF2C基因的mRNA表达量显著高于空白对照组(P < 0.05),MSTN-P1核心启动子片段均能驱动MEF2C在这两种细胞中的表达。研究表明,MEF2C能与MSTN-P1片段上转录因子结合位点相结合,从而上调控MSTN启动子的转录活性,在C2C12成肌细胞中的mRNA表达量更高,可能是MEF2C在肌肉发育过程中对MSTN启动子的影响更为重要。吴文武[26]报道,在生物发育过程中,MEF2C具有广谱表达模式,且能参与下游基因的表达调控。MEF2家族能通过钙凋素-钙调磷酸酶通路靶向识别目的基因的DNA序列,从而激活多种与肌肉生长发育相关基因的表达[27]。MEF2C能通过与MSTN的启动子结合来抑制小鼠心肌细胞增殖,并降低心重量[28]。Hennebry等[29]报道,MSTN促进慢性肌纤维形成时可正向调控MEF2C基因mRNA表达水平。
本研究发现,过表达MEF2C后,MSTN启动子活性明显增强,将重组表达载体转染细胞,MEF2C的mRNA表达量显著上调。研究结果表明,MSTN基因在抑制肌肉生长发育的同时上调了MEF2C的表达,而MEF2C激活MSTN启动子的活性的现象可能是该因子负反馈调节抑制肌细胞增生的机制之一,MEF2C可能通过调控MSTN基因的激活及MSTN依赖的相关基因的表达来调节生肌等生理过程。
4 结论本试验扩增了牛MSTN基因启动子全长序列,通过构建荧光报告载体,发现MEF2C能显著上调牛MSTN启动子活性。将重组表达载体转染小鼠C2C12细胞和大鼠下颌腺上皮细胞,发现MSTN-P1核心启动子片段均能启动MEF2C在两种细胞中表达。结果表明,MEF2C能正向调控MSTN启动子的转录活性。
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