2. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009;
3. 江苏省人兽共患病学重点实验室, 扬州 225009
, MIN Wenyan1,2,3, ZHOU Jiahua1, ZHAO Yutian1,2,3, BIAN Jianchun1,2,3, LIU Xuezhong1,2,3, YUAN Yan1,2,3, LIU Zongping1,2,3
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China;
3. Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou 225009, China
1α, 25-(OH)2D3是维生素D的活性形式，在多种生物或生理学过程中发挥作用。维生素D一个主要的功能是通过增加肠道对钙的吸收来维持钙的稳态[1]，肠内钙吸收和肾内钙再吸收的增加可以促进骨骼矿化。来源于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨细胞(osteoblast，OB)发挥骨合成代谢作用[2]，来源于造血干细胞的破骨细胞(osteoclast，OC)发挥骨分解代谢作用[3]，使机体骨骼和钙磷维持动态平衡。BMSCs具有易分离、自我更新和分化成OB、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞的能力[4]，因此它成为各种细胞的种子细胞。研究发现，人BMSCs表达维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)和维生素D羟化酶(CYP27B1、CYP27A1、CYP24A1)，1α, 25-(OH)2D3能够提升BMSCs向OB分化的能力[5]。一定浓度的1α, 25-(OH)2D3还可促进OB或BMSCs中核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表达，降低骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的表达来间接调控OC的形成[6-7]，也可以直接促进RANKL诱导RAW264.7分化成成熟OC的作用[8]。
蛋鸡骨骼系统与哺乳动物存在差异，尤其产蛋期骨骼及钙磷代谢非常特殊[9]，尽管体外RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)可促进小鼠或人骨髓单核巨噬细胞(bone marrow mononuclear macrophage，BMMs)生成具有骨吸收活性的成熟OC[10-12]，但目前由于种属差异，仍无家禽来源的RANKL和M-CSF可用于诱导鸡BMMs分化成OC。鉴于报道认为1α, 25-(OH)2D3可诱导动物BMSCs及OB等分泌RANKL，从而调控BMSCs与BMMs共培养或OB与BMMs共培养体系中BMMs向成熟的OC分化[13-14]。因此，本研究在鸡BMSCs与BMMs体外共培养的基础上，添加不同浓度1α, 25-(OH)2D3，观察维生素D对体外鸡胚BMSCs和BMMs共培养体系中OC形成的影响，以期建立体外家禽OC培养体系，为家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF鸡胚，购自山东益吉达科技有限公司。
1.2 试剂和仪器胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Gemini, USA)；α-MEM(Gbico, USA)；胰蛋白酶(Amresco, USA)；Trizol(Invitrogen, USA)；SYBER Premix TaqTM Ⅱ kit、PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser(TaKaRa, Japan)；Ⅱ型碳酸酐酶(carbonic anhydrase Ⅱ, CAⅡ)兔源多克隆抗体，组织蛋白酶K(cathepsin K, CtsK)兔源多克隆抗体，基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)兔源多克隆抗体，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH)兔源多克隆抗体(cell signal technology, USA)，活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATc1)兔单克隆抗体(Abcam, UK)；1α, 25-(OH)2D3，骨吸收培养板，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)(Sigma, USA)。
二氧化碳培养箱，SW-CJ-ZFD型生物安全柜，NanoDrop 2000(Thermo fisher, USA)；DMI3000型倒置显微镜(Leica, Germany)；Milli-Q Biocel型超纯水系统(Millipore, USA)；DK-600型恒温水槽(上海精宏试验设备有限公司)；ABI 7500 qRT-PCR仪(ABI, USA)；PROTEAH电泳仪(BIO-RAD, USA)。
1.3 鸡胚BMSCs和BMMs的分离及共培养无菌条件下，分离若干18日龄鸡胚股骨和胫骨。剃净股骨和胫骨表面的肌肉和结缔组织，用5 mL注射器吸取无菌PBS冲洗骨髓腔至颜色发白。移液器轻轻吹打含有骨髓细胞的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS)使细胞团块分散，再依次经过100和200目的无菌筛网过滤。过滤的细胞悬液，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清。加入PBS再次重悬细胞，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清。用含10% FBS的α-MEM培养基重悬细胞，接种于100 mm培养皿中，放入5%CO2、37 ℃培养48 h。48 h后，贴壁细胞即为BMSCs，未贴壁细胞即为BMMs。BMSCs分别传至96、6孔板、骨吸收培养板中，加入BMMs共同培养。培养液为含不同浓度(10-10、10-9、10-8 mol·L-1)1α, 25-(OH)2D3的α-MEM培养基，不添加1α, 25-(OH)2D3组为对照组。上述细胞培养5 d后，弃去96孔内的培养基，用PBS洗两遍，加入4%多聚甲醛室温固定15 min后，按照TRAP试剂盒说明书进行染色。倒置相差显微镜观察TRAP阳性多核(3个及3个以上核)OC并拍照。随机选取10个视野，对OC进行计数。
1.4 RT-PCR检测相关基因mRNA的表达用Trizol法提取6孔板共培养5 d或BMSCs单独培养5 d的细胞总RNA。通过痕量分光光度计NanoDrop2000对样品进行检测，确定提取总RNA的浓度及纯度(A260 nm/A280 nm比值)。以PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser反转录获取的cDNA为模板，检测CtsK、NFATc1、TRAP (Acp5)、MMP-9、CAⅡ、RANKL、OPG mRNA表达水平。查阅NCBI中的相应序列并设计引物(表 1)。反应体系：Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL、ROX 0.4 μL，模板(cDNA)2 μL，加入无RNA酶水，使反应体系总体积为20 μL。RT-PCR扩增反应条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，40个循环。2-ΔΔCt法对实时荧光定量PCR试验结果进行数据分析，GAPDH为内参。
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表 1 目的基因引物序列 Table 1 The primer sequence for target genes |
RIPA裂解液提取共培养5 d的各组蛋白样本。BCA法测定蛋白浓度，并调整一致。加入5×SDS loading buffer，100 ℃变性10 min。蛋白样品110 V凝胶电泳，90 min。湿转法110 V蛋白转印，90 min。转印完成后，配5%的脱脂乳室温封闭2 h，加入CAⅡ多克隆抗体，CtsK多克隆抗体，MMP-9多克隆抗体，NFATc1单克隆抗体及GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，用TBST进行洗膜，共洗3次，每次洗10 min，再加入羊抗兔二抗，室温孵育2 h。移去二抗，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化学发光试剂显色，显影仪读片。
1.6 鸡胚OC骨吸收活性鉴定将BMSCs和BMMs接种于用于骨吸收分析的96孔培养板中培养5 d，弃去培养液，用PBS反复清洗，洗去贴壁细胞。用倒置相差显微镜观察骨吸收陷窝并拍照，Image-Pro Plus软件分析骨吸收陷窝的面积。
1.7 数据分析所有试验数值均用x±s表示。SPSS v.17.0软件t-test分析组间差异。P＜0.05和P＜0.01分别表示差异显著和差异极显著。
2 结果 2.1 不同浓度1α, 25-(OH)2D3对BMSCs中RANKL、OPG mRNA表达的影响qRT-PCR结果(图 1)表明，不同浓度1α, 25-(OH)2D3处理BMSCs 5 d，RANKL mRNA表达随浓度增加而增强，与对照组相比差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。而OPG mRNA表达随浓度增加而减弱。与对照组相比，10-9、10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3均极显著抑制OPG mRNA表达(P＜0.01)。
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与对照组相比，*. P＜0.05；**. P＜0.01 *. P < 0.05; **. P < 0.01 vs control 图 1 不同浓度1α, 25-(OH)2D3对BMSCs RANKL、OPG mRNA表达的影响 Fig. 1 Effects of different concentrations of 1α, 25-(OH)2D3 on the expression of RANKL and OPG mRNA in BMSCs |
TRAP染色、计数结果可见，对照组[不添加1α, 25-(OH)2D3]细胞呈梭形，极少见细胞核多于3个及3个以上的OC。随着1α, 25-(OH)2D3浓度的升高，圆形、体积较大、细胞质呈酒红色的TRAP阳性的多核OC形成增多(图 2、3)。计数结果显示，与对照组相比，不同浓度1α, 25-(OH)2D3组形成的OC数量极显著增多(P＜0.01)，且10-8mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3组形成的OC最多。
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图 2 共培养OC在明场和TRAP染色后形态(200×) Fig. 2 The morphology of OC was observed at bright field and after TRAP staining in co-culture system(200×) |
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与对照组相比，**. P＜0.01 **. P < 0.01 vs control 图 3 OC数目统计 Fig. 3 The statistical chart of OC numbers |
qRT-PCR结果(图 4)表明，不同浓度1α, 25-(OH)2D3培养5 d，OC标志性基因Acp5、CAⅡ、MMP-9、CtsK mRNA表达随浓度增加而增强，与对照组相比差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。而NFATc1 mRNA表达在各1α, 25-(OH)2D3处理组随浓度增加(10-10、10-9、10-8 mol·L-1)而下降，与对照组相比差异均极显著(P＜0.01)。
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与对照组相比，*. P＜0.05；**. P＜0.01 *. P < 0.05; **. P < 0.01 vs control 图 4 1α, 25-(OH)2D3对OC标志基因mRNA表达的影响 Fig. 4 Effect of 1α, 25-(OH)2D3on mRNA expression of OC marker genes |
Western blot结果(图 5)显示，1α, 25-(OH)2D3处理共培养细胞可表达NFATc1、CtsK、MMP-9及CA Ⅱ蛋白。灰度值分析显示，不同浓度1α, 25-(OH)2D3培养 5 d，OC标志性蛋白CtsK、MMP-9、CAⅡ的表达随1α, 25-(OH)2D3浓度的增加而上升，与对照组相比差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；各处理组NFATc1的蛋白表达水平随1α, 25-(OH)2D3浓度的增加而下降，与对照组相比差异显著(P＜0.05)。
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与对照组相比，*. P＜0.05；**. P＜0.01 *. P < 0.05; **. P < 0.01 vs control 图 5 1α, 25-(OH)2D3对OC分化标志性蛋白表达的影响 Fig. 5 Effect of 1α, 25-(OH)2D3on expression of OC marker proteins in differentiation |
骨吸收陷窝结果(图 6)表明，不添加细胞的空白培养板表面平整，无吸收陷窝。单独培养的BMSCs不具有骨吸收活性，培养板表面平整，无1α, 25-(OH)2D3处理的共培养组骨吸收陷窝极少，而添加10-8 mol·L-11α, 25-(OH)2D3共培养形成的OC能产生大量大小不一的骨吸收陷窝。对骨吸收面积进行分析(图 7)，10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3组骨吸收陷窝面积极显著大于不添加1α, 25-(OH)2D3组(P＜0.01)。
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白色箭头所指为OC形成的骨吸收陷窝 The white arrow indicates the boneresorption notch formed by OC 图 6 骨吸收陷窝结果(50×) Fig. 6 Bone resorption lacuna results(50×) |
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与对照组相比，**. P＜0.01 **. P < 0.01 vs control 图 7 骨吸收陷窝面积统计 Fig. 7 The statistical chart of bone resorption lacuna area |
家禽骨骼发育异常，如肉仔鸡胫骨软骨发育不良(tibial dyschondroplasia，TD)[15]、佝偻病、股骨头坏死等均给家禽养殖业带来严重的经济损失，直接危及家禽的福利。就蛋鸡而言，目前笼养蛋鸡骨质疏松等疾病发病率仍较高[16]，传统鸡笼中的蛋鸡易患骨质疏松症，主要原因是活动受限、缺乏锻炼以及蛋壳生成消耗大量的钙[17]等，这些因素导致笼养蛋鸡在产蛋期骨质疏松的发病率高达6.6%~15.7%，不仅可致骨质疏松性骨折的发生，更可导致产蛋下降或者停产、产软壳蛋等，给蛋鸡生产带来了巨大损失[18-19]。作为与钙磷存在相互调节关系的维生素D，它在家禽机体内也发挥着不可或缺的作用，血清25-(OH)D是维生素D的主要循环形式，较稳定，通常作为检测维生素D水平的指标[20]。根据相关文献的报道，正常人体内的25-(OH)D水平大约为5×10-8 mol·L-1[21]。体外研究中，10-10~10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3是研究最多的生理浓度范围[22]，因此，本试验选择接近机体正常生理水平的维生素D浓度范围进行探究。
OC是体内能够溶解骨有机质和无机质的细胞，在机体骨骼及钙磷内环境稳态中发挥重要作用[23]。因此OC形成及骨吸收功能机制的研究，有助于认识并防控家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病。在OC调控机制中，核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/RANKL/OPG轴是研究最深入的[24]，该系统对骨骼的调控有着至关重要的作用[25]；OB表达的RANKL与OC前体BMMs表面RANK结合[26]，促进BMMs进一步融合分化成成熟的OC，并能增强OC的骨吸收功能。OPG属于分泌型蛋白[27]，它可以通过阻止OC的分化、成熟而调节骨代谢，当骨吸收大于骨形成时，OB分泌更多OPG，阻止RANKL与RANK的相互作用[28-29]，抑制骨吸收功能，抑制OC形成，使骨内环境继续保持相对稳定状态。根据本实验室前期摸索及Song等[30]的研究，BMMs诱导培养5 d即可形成大量OC，用于分子生物学研究。因此，本研究采用BMSCs与BMMs共培养，添加不同浓度1α, 25-(OH)2D3处理5 d，结果显示1α, 25-(OH)2D3能促进RANKL mRNA表达、抑制OPG mRNA，其中10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3效果最明显。与Cong等[7]发现10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3能够促进小鼠OB RANKL的表达，从而促进OC的形成相似。
共培养模型可分为transwell培养、可拆卸型渗透性装置培养、直接培养、选择性培养基培养[31]。研究表明，将MC3T3-E1和RAW264.7在transwell小室中进行共培养，OPG在基因和蛋白水平的表达均低于单一培养组，而RANKL基因和蛋白表达水平高于单一培养组，OC形成增加[32]。本试验利用直接共培养模型探究了1α, 25-(OH)2D3对BMSCs与BMMs共培养过程中OC形成及骨吸收活性的影响。1α, 25-(OH)2D3处理5 d，对OC标志蛋白和mRNA表达均有促进作用，但抑制NFATc1的蛋白和mRNA表达水平，其中10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3效果最明显。对NFATc1呈现的抑制作用跟OC形成过程中的负反馈调节机制相关[33]，具体还有待于进一步研究。由于骨吸收活性是OC重要的生物学功能，是检验体外培养的OC是否具有生物学功能的标准[34]，因此本研究亦检测了OC的骨吸收活性。10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3处理共培养5 d的BMSCs与BMMs，所形成的OC能在骨吸收培养板上产生大量深浅不一、不规则形状的骨吸收陷窝。由此可见，10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3介导BMSCs与BMMs共培养形成的OC具有较强的生物学功能，为OC在家禽骨骼及钙磷代谢中的作用及机制研究奠定了基础。
4 结论10-10~10-8 mol·L-11α, 25-(OH)2D3均可促进SPF鸡胚来源BMSCs和BMMs共培养体系中OC的形成及相关蛋白的表达，其中10-8 mol·L-1 1α, 25-(OH)2D3效果最明显。所形成的OC具有明显的骨吸收活性，为进一步研究OC在家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病中的作用机制奠定了基础。
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