2. 重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新研发实验室, 重庆 402460
2. Chinese Veterinary Herbal Drugs Innovation Research Lab, University Veterinary Science Engineering Research Center in Chongqing, Chongqing 402460, China
大肠杆菌所致的仔猪腹泻是猪场中常见疾病之一，严重影响着我国养猪业的发展。现代兽医学普遍认为动物腹泻的主要靶器官在肠道，腹泻动物的肠黏膜均有不同程度的损伤[1]。产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)能产生并释放肠毒素(enterotoxin)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，并造成肠黏膜细胞结构的破坏[2]。炎症在肠黏膜损伤中起着维持内环境稳定的作用，但过度的炎症又会加剧肠黏膜损伤的严重程度。LPS不仅能诱导炎症发生，还可能造成过度炎症而加重肠黏膜的损伤[3]。肠三叶因子(trefoil factor family，TFF3)是由肠上皮杯状细胞分泌的一种小分子多肽，一定范围内表达的TFF3能对损伤的黏膜起到立即修复的作用[4-5]；但过量表达的TFF3却能引起损伤部位的淋巴结转移和肿瘤新生血管的形成[6]。TNF-α和IL-8分别作为促炎因子和炎症趋化因子在炎症形成过程中发挥重要作用[7]，有学者认为特异性地阻断TNF-α和IL-8可为炎症性疾病的治疗提供思路[8-9]。
目前，防治仔猪腹泻通常采用抗生素和化学抗病毒药物，但易产生耐药性，因此采用中药复方防治仔猪腹泻具有一定的实践意义[10]。术芩提取液(Zhu Qin extractive fluid，ZQEF)是由复方术芩中的白术、黄芩和黄芪等中药按照一定比例水醇提取而得的；复方术芩为自拟处方，用于仔猪腹泻的治疗。前期研究表明，复方术芩提取液具有抑菌、抗病毒和抗炎以及增强机体免疫功能的作用[11-13]，术芩颗粒能提高仔猪的生长性能[14]，但复方术芩对仔猪腹泻的治疗机制还有待进一步探究。为此，本试验采用LPS和具有典型肠上皮细胞特性的IPEC-J2细胞建立细胞损伤模型[15]，研究ZQEF对损伤的IPEC-J2细胞的增殖与修复作用以及对TFF3、TNF-α和IL-8转录的影响，以期为ZQEF修复肠黏膜损伤提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料白术、黄芩、黄芪等中药(批号：160201)，购自四川千金方中药饮片有限公司；对照药材白术(批号：120925-201310)、黄芩(批号：120955-201309)、黄芪(批号：120974-201311)，标准物质白术内酯Ⅰ(批号：111975-201501，纯度：99.9%)、黄芩苷(批号：110715-201318，纯度：93.3%)、黄芪甲苷(批号：110781-201314，纯度：95.8%)等均购自中国食品药品检定研究院；胎牛血清(FBS，批号：1347575)，高糖培养基DMEM(批号：8115352)，0.25% Trysin-EDTA(批号：1780400)等均购自美国Gibco公司；LPS(Lipopolysacchrides from Escherichia coli 055:B5，SIGMA，044M4004V)；SYBR® Premix Ex-TaqTM Ⅱ荧光定量试剂盒(货号：RR820A)，DL2000 DNA Marker(TaKaRa)均购自北京宝日医生物有限公司；UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒(货号：B511361)，引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醇(批号：021260702，液相色谱纯)、正丁醇(批号：2015031001，分析纯)、氯仿(批号：20170901，分析纯)等常用试剂，均购自重庆川东化工(集团)有限公司。
1.2 主要仪器GOODLOOK-1000薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)；LC-20A高效液相色谱仪(岛津公司)；3111型隔水式CO2细胞培养箱、Thermo Fisher高速冷冻离心机(Thermo Electron Laboratories，USA)；Mode680酶标仪、CFX96荧光定量PCR仪器[伯乐生命医学产品(上海)有限公司Bio-Rad Laboratories]等。
1.3 细胞系及培养方法IPEC-J2细胞系购西北农林科技大学。IPEC-J2细胞系培养方法：以10% FBS、1%青-链霉素和89% DMEM维持液为培养基，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。当细胞汇合度达到80%时，用0.25% Trysin-EDTA消化传代，传5代后用于试验。
1.4 ZQEF制备方法与鉴定ZQEF是将复方术芩中白术(4份)、黄芩(3份)、黄芪(4.5份)等味中药[13]，按水醇提取法提取得到含生药1 g·mL-1的提取液(提取液中乙醇浓度为70%)。将ZQEF用直径0.22 μm的无菌滤膜滤过，并用DMEM维持液稀释成浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5g·mL-1的ZQEF用于细胞试验。参照《中华人民共和国兽药典》二部(2015年版)中白术、黄芩和黄芪的薄层色谱鉴定方法和条件，分别配制ZQEF供试品溶液，白术、黄芩、黄芪对照药材溶液，白术内酯Ⅰ、黄芩苷、黄芪甲苷标准品溶液以及处方中分别不含白术、黄芩、黄芪的阴性对照品溶液，进行薄层色谱鉴定。高效液相色谱法测定ZQEF中黄芩苷含量，色谱条件参照《中华人民共和国兽药典》二部(2015年版)，样品平行测定5次，记录峰面积并计算黄芩苷含量及RSD。
1.5 IPEC-J2细胞分组处理与IPEC-J2细胞增殖率测定将对数生长期的IPEC-J2细胞按每孔104个细胞接种于6孔细胞培养板中，随机分成7个组，分别为空白组、LPS模型组和药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组，5孔·组-1。LPS模型组和各药物组均添加100 μL浓度为100 μg·mL-1的LPS刺激30 min，将造模成功后的药物Ⅰ~Ⅴ组再分别加入100 μL的ZQEF(浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5g·mL-1)，LPS模型组与空白组添加等量DMEM维持液。各组IPEC-J2细胞培养24 h；加入20 μL的MTT，培养4 h，弃液；再加入150 μL的DMSO溶液作用10 min，轻微振动；在490 nm波长下测定OD值。以空白组细胞增殖率为100%并计算各试验组的细胞增殖率，计算公式：细胞增殖率=[1-(空白组OD-试验组OD)/空白组OD]×100%。
1.6 药物对IPEC-J2细胞中TFF3、TNF-α、IL-8转录的影响IPEC-J2细胞随机分为空白组，LPS模型组和药物组(ZQEF浓度为10-2g·mL-1)，各组处理方法同“1.5”，经24 h培养后收集细胞。
1.6.1 IPEC-J2细胞总RNA的提取和反转录(RT)按照UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明书提取IPEC-J2细胞的总RNA。按照promega反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription System说明书操作步骤将提取的总RNA反转录成cDNA，保存于-20 ℃冰箱备用。
1.6.2 PCR引物的设计参考基因库(GenBank)中已发表的猪TFF3、TNF-α、IL-8和β-actin的RNA序列，利用Primer 5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TFF3(2 bp)：引物1，5′-GTDTTAGCCTCTCCCAGCAG-3′；引物2，5′-TCTCAAGGGTCACGGAAAGT-3′。TNF-α(20 bp)引物1，5′-ACCAGCCAGGAGAGA-GACAA-3′；引物2，5′-AGCGTGTGAGAGGGAGAGAG-3′。IL-8引物1(21 bp)，5′-TGAGAA-GCAACAACAACAGCA-3′；引物2(20 bp)，5′-CAGCACAGGAATGAGGCATA-3′。β-actin，引物1(19 bp)，5′-CTCTTCCAGCCCTCCTTCC-3′；引物2(17 bp)，5′-GGTCCTTGCGGATGTCG-3′。
1.6.3 qRT-PCR的测定[16]反应体系：反应体积为20 μL，其中含有2×qPCR SYBR® Premix Ex-Taq 10 μL，QF(10 μmol·L-1)与QR(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Template cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 7 μL。荧光定量PCR的扩增条件：90 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，循环40次。熔解条件：95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，循环1次。TFF3、TNF-α、IL-8和β-actin的mRNA检测结果由计算机工作站给出。以β-actin为内参基因，各待测基因转录强度以基因绝对拷贝数/β-actin绝对拷贝数表示，通过熔解曲线判断是否有非特异性扩增产物或引物二聚体出现，采用2－△△Ct法进行相对定量[17]。
1.7 数据分析采用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著；IPEC-J2细胞增殖率和mRNA相对转录量均以Prism5.0作图。
2 结果 2.1 ZQEF有效活性成分的薄层色谱鉴定及黄芩苷含量高效液相测定白术、黄芩和黄芪的薄层色谱鉴定结果显示，ZQEF供试品均在白术、黄芩和黄芪对照药材及标准品处呈现相同颜色的斑点，而阴性对照品则不出现，说明ZQEF中含白术、黄芩和黄芪以及白术内酯Ⅰ、黄芩苷和黄芪甲苷等主要活性成分，分别见图 1~3。高效液相色谱法测定结果显示，ZQEF中黄芩苷的平均含量为1.469 8%，RSD=1.576 7%，见图 4、5。
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1~3. ZQEF供试品；S.白术内酯Ⅰ标准品；R.白术对照药材；N.阴性对照品 1-3. ZQEF samples; S. Standard atractylenolide-Ⅰ; R. Rhizoma atractylodis macrocephalae reference substance; N. Negative reference substance 图 1 ZQEF中白术薄层色谱鉴别 Fig. 1 Identify the atractylodes of ZQEF by TLC |
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1~3. ZQEF供试品；S.黄芩苷标准品；R.黄芩对照药材；N.阴性对照品 1-3. ZQEF samples; S. Standard baicalin; R. Scutellaria baicalensis reference substance; N. Negative reference substance 图 2 ZQEF中黄芩苷薄层色谱鉴别 Fig. 2 Identify the baicalin of ZQEF by TLC |
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1~3. ZQEF供试品；S.黄芪甲苷标准品；R.黄芪对照药材；N.阴性对照品 1-3. ZQEF samples; S. Standard astragaloside; R. Astragalus membranaceus reference substance; N. Negative reference substance 图 3 ZQEF中黄芪甲苷薄层色谱鉴别 Fig. 3 Identify the astragaloside of ZQEF by TLC |
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图 4 HPLC色谱图(黄芩苷标准品) Fig. 4 HPLC chromatogram (Standard baicalin) |
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图 5 HPLC色谱图(ZQEF供试品) Fig. 5 HPLC chromatogram (ZQEF samples) |
结果显示，LPS模型组IPEC-J2细胞增殖率降低，与空白组相比，差异极显著(P < 0.01)。与LPS模型组相比，药物Ⅰ~Ⅴ组IPEC-J2细胞增殖率均增高，其中药物Ⅱ组(10-2g·mL-1)差异极显著(P < 0.01)，药物Ⅲ组(10-3 g·mL-1)差异显著(P < 0.05)，详见图 6。说明不同浓度ZQEF均能促进LPS损伤的IPEC-J2细胞的修复，其中10-2和10-3 g·mL-1ZQEF效果显著，10-2 g·mL-1 ZQEF效果最佳。
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不同大写字母表示组间差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母表示组间差异显著(P < 0.05)。下图同 Different capital letters mean highly significant difference among groups (P < 0.01), different lowercase letters mean significant difference among groups (P < 0.05). The same as below 图 6 不同浓度ZQEF对LPS损伤IPEC-J2细胞增殖率的影响 Fig. 6 Effects of different concentrations of ZQEF on proliferative rate of LPS-injured IPEC-J2 cells |
空白组IPEC-J2细胞中TFF3 mRNA的相对量为0.28，LPS模型组IPEC-J2细胞中TFF3 mRNA的相对量为1.01，与空白组相比，差异极显著(P < 0.01)；药物组(10-2 g·mL-1)IPEC-J2细胞中TFF3 mRNA的相对量为0.66，与LPS模型组相比，差异极显著(P < 0.01)，说明10-2g·mL-1ZQEF能够明显降低TFF3的转录，如图 7所示。
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图 7 药物(10-2 g·mL-1)对IPEC-J2细胞中TFF3、TNF-α、IL-8相对转录量的影响 Fig. 7 Effects of drugs (10-2 g·mL-1) on mRNA transcription of TFF3, TNF-α and IL-8 in IPEC-J2 cells |
空白组IPEC-J2细胞中TNF-α mRNA的相对量为0.27；LPS模型组IPEC-J2细胞中TNF-α mRNA的相对量为1.00，与空白组相比，差异极显著(P < 0.01)；药物组(10-2g·mL-1)IPEC-J2细胞中TNF-α mRNA的相对量为0.44，与LPS模型组相比，差异极显著(P < 0.01)，说明10-2g·mL-1 ZQEF能够明显抑制炎性因子TNF-α的转录，如图 7所示。
2.5 ZQEF对IPEC-J2细胞中IL-8转录的影响空白组IPEC-J2细胞中IL-8 mRNA的相对量为0.08，LPS模型组IPEC-J2细胞中IL-8 mRNA的相对量为1.00，与空白组相比，差异极显著(P < 0.01)；药物组(10-2g·mL-1)IPEC-J2细胞中IL-8 mRNA的相对量为0.92，与LPS模型组相比差异不显著(P>0.05)，说明10-2 g·mL-1ZQEF能够抑制炎性因子IL-8的转录，如图 7所示。
3 讨论随着仔猪腹泻病的频发以及抗生素的滥用，农业农村部提出了“减抗”的要求。而中药对于仔猪腹泻的治疗作用除抑菌外，还包括抗肠毒素、抑制小肠推动和抑制炎性渗出等作用[18]。查阅文献发现，含白头翁、黄芩和苦参等中药的复方可以加速肠组织修复、减轻炎症和调节免疫，对猪流行性腹泻的疗效优于抗生素疗法[19-20]。本研究所用的复方术芩主要是从补脾健胃、益气健脾、清热燥湿等方面组方，其术芩总多糖能增强机体免疫力[21]。本试验结果显示，ZQEF中主要活性成分有白术内酯Ⅰ、黄芩苷和黄芪甲苷，并测得黄芩苷平均含量为1.469 8%。其主要成分白术内酯Ⅰ具有较强的抗炎活性[22]，黄芩苷具有广谱抗菌活性[23]，黄芪甲苷能起到抗病毒和调节免疫的作用[24]。提示ZQEF可能具有抗菌、抗病毒、抗炎和调节免疫的作用。
动物腹泻的原因主要是肠黏膜受损，局部血管通透性增加，继而引起肠道渗出液分泌增加[25]。本试验结果显示，LPS能明显降低IPEC-J2细胞增殖率，与文献[26]结果一致，说明LPS能损伤肠黏膜细胞。当肠上皮细胞处于损伤或炎症等病理状态时，TFF3除了表达部位的特异性消失，还具有促血管形成作用，因此TFF3被认为是一种能促进肿瘤生长和转移的小分子多肽[27]。本试验结果显示，LPS能明显增加IPEC-J2细胞中TFF3 mRNA的量，与文献报道一致[28-29]，ZQEF提高IPEC-J2细胞增殖率并降低LPS损伤的IPEC-J2细胞中的TFF3 mRNA量。提示ZQEF通过促进肠上皮细胞增殖和调节TFF3表达，参与了损伤的肠上皮细胞的修复过程。
在LPS的作用下，细胞因子及炎症介质会过度释放，引起机体组织损伤，严重时甚至导致器官衰竭、死亡。研究认为LPS可通过促进IκB的磷酸化，激活NF-κB炎性通路而发挥致炎作用[30]，也有研究认为TNF-α和IL-8是NF-κB炎性通路的下游因子[31]。童明宏等[32]认为当TNF-α和IL-8的分泌量增加后，能在局部使得粒细胞发生聚集进而引起炎症反应，进一步地造成病理损伤。因此，LPS所诱导产生的TNF-α和IL-8都是重要的促炎因子。TNF-α主要在巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的细胞质中表达，能激活淋巴细胞，也可正向调控靶细胞以合成IL-8[33]。IL-8的作用则表现在诱导嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T淋巴细胞浸润到炎性部位并释放炎性介质，引起炎性反应。
目前，笔者未查阅到复方术芩对LPS诱导的相关疾病的研究，但查阅了该复方中白术、黄芩及黄芪等味药及主要活性物质对LPS诱导的炎症的研究。颜亮等[34]发现黄芩中的主要活性成分黄芩苷能抑制LPS致敏的小鼠巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化；钟秀会等[35]研究表明黄芩和白术的组方能降低LPS诱导产生的TNF-α水平；杨天任等[36]发现黄芪多糖能显著降低经伤寒沙门菌攻毒后小鼠血清中的TNF-α含量。本试验结果显示，LPS能明显增加IPEC-J2细胞中TNF-α和IL-8 mRNA的量，而ZQEF降低了TNF-α和IL-8 mRNA量，但对IL-8转录的影响并不显著，提示ZQEF通过拮抗TNF-α和IL-8等炎性因子的表达而降低肠上皮细胞的炎性损伤。对于IL-8 mRNA量降低不显著的原因，笔者认为可能是IL-8的合成存在多个途径，ZQEF可能仅通过拮抗TNF-α表达以负调控IL-8合成，而并没有拮抗其主要合成的途径。因此，ZQEF对IL-8的调控机制还有待进一步研究。
4 结论术芩提取液中含白术内酯Ⅰ、黄芩苷和黄芪甲苷等成分，其中黄芩苷含量为1.469 8%，对LPS所损伤的IPEC-J2细胞具有修复作用。其机理可能是通过促进LPS损伤的IPEC-J2细胞增殖，拮抗LPS损伤的IPEC-J2细胞中TNF-α、IL-8等炎性因子的表达，达到修复肠黏膜的作用。
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