双酚A(bisphenol A，BPA)是双酚类化合物中使用最广泛的有机原料之一。由于BPA具有优良的塑型、抗氧化、热稳定和化学稳定等作用，被广泛应用于增塑剂、抗氧化剂、涂料等生产领域[1]。并且，罐头、快餐盒、饮料的内包装、塑料水瓶、婴儿奶瓶及牙齿填充物等多种日用产品的生产过程中也常添加BPA[2-3]。研究发现，人群中广泛暴露BPA，在体内的肝、肾、血液、尿液、胚胎和羊水等多种器官和体液中都可以检测出BPA[4]。而BPA是一种内分泌干扰物质(EDCs)，可以通过结合雌激素受体(estrogen receptor，ER)，对正常的生理活动产生影响[5]。研究表明，BPA不仅可以影响雌性生殖器官的形态和功能，使下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)功能紊乱[5-6]，还可以抑制胎儿的早期发育，产生多种生殖毒性[7-8]。
此外，人们逐渐意识到表观遗传学调控在生殖发育中所起的作用，从根本上讲，表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果。不同于中心法则，表观遗传学认为遗传信息并非单方向传递，环境因素也能改变遗传物质[9]。目前表观遗传学研究主要集中在甲基化、组蛋白修饰、小RNA和染色质重塑等方面。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基添加在DNA分子中的碱基上的过程，是基因沉默结果的维持[10]。哺乳动物细胞中已知有活性的DNMT有3种，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。研究发现，DNA甲基转移酶对小鼠发育至关重要，小鼠胚胎纤维原细胞DNMT失活，会导致染色体结构不稳定，使癌症细胞永生化[11]。
目前，关于BPA的毒理研究多集中在亲代、体外细胞试验[12]、急性慢性毒性试验[13]或胚胎毒性研究等[14]，研究内容也较少涉及表观遗传调控机制。因此，本研究分别从器官组织形态学水平、血液激素水平、组织激素受体及DNMT基因转录水平这三方面探讨妊娠期暴露环境污染物BPA对子代成年雌性小鼠的生殖损伤作用。
1 材料与方法 1.1 试剂和仪器BPA(分析纯≥99%)、玉米油购自Sigma(美国)；Go Taq®PCR Master Mix(A6001)、GoScriptTM Reverse Transcription System(A5001)购自Promega(美国)；Eastep® Super总RNA提取试剂盒(LS1040)购自Promega(北京)；Light Cycler® 96全自动荧光定量PCR仪购自罗氏诊断产品有限公司(上海)；BFM-96型多管放射免疫计数器，购自众成机电技术公司(北京)；FSH放射性免疫试剂(B03PZB)、LH放射性免疫试剂(B04PZB)、E2放射性免疫试剂(B05PZB)、P4放射性免疫试剂(B08PZA)均购自北方生物技术研究所(北京)；ERα酶联免疫吸附试剂盒、Rβ酶联免疫吸附试剂盒购自上海活乐生物科技发展有限公司(上海)；CKX31型光学显微镜购自Olympus(日本)；Multiskan Ascent酶标仪购自Thermo(美国)。
1.2 实验动物分组及处理选用9周龄未经产昆明小鼠，SPF级，购于斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，许可证为SCXK(京)2016-0002。小鼠每日给予光照、黑暗各12 h，饲养环境温度保持在(25±0.5)℃，湿度50%~60%，自由采食和饮水。适应性饲养一周后，小鼠(35±2)g，于当天下午9点合笼，次日上午7点检查阴栓，检出阴栓者，当天中午定为孕0.5 d。将孕鼠随机分为6组(A、B、C、D、E、F组)，每组20只，孕0.5—17.5 d每天A~F各组分别灌服溶解于玉米油内的0、2.5、5、10、20、40 mg·kg-1剂量的BPA，0.2 mL·只-1，子代雌鼠与母鼠同笼饲养至断乳，出生56 d后，每组随机选取10只雌性小鼠采集试验样本(图 1)。本研究中动物的使用经河北省动物保护协会批准，动物处理过程通过实验动物管理和使用委员会的动物伦理学审查。
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图 1 双酚A暴露及试验方法 Fig. 1 Bisphenol A exposure and methods of our study |
称取小鼠体重，麻醉后处死，剖开腹腔，取卵巢和子宫，除去多余脂肪后称重。
| $ \text{卵巢指数=卵巢质量(mg)/体重(g)×100}\% $ |
| $ \text{子宫指数=子宫质量(mg)/体重(g)×100}\% $ |
仔鼠卵巢取出后固定在4%甲醛溶液中，常规制备组织切片，在光学显微镜下进行观察。
1.3.3 子代成年雌鼠血清中激素的测定小鼠麻醉后，眼眶窦采血，血液经3 500 r·min-1离心后收集血清，对雌性子鼠的血清试管沉淀物进行放射性计数，用众成机电科技发展有限公司(合肥，中国)的多管放射免疫分析计数器检测和分析血清中E2与P4含量，FSH与LH活性。
1.3.4 子代成年雌鼠卵巢中ERα和ERβ含量测定将部分卵巢制备成10%组织匀浆，3 500 r·min-1离心后，吸取上清液，按照Horatio生物科技发展有限公司(上海，中国)ELISA试剂盒说明书操作测定上清液中子代雌鼠卵巢ERα和ERβ水平。
1.3.5 子代成年雌鼠卵巢中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ERα及PgR mRNA的表达使用总RNA提取试剂盒提取卵巢中总RNA。通过RNA质量鉴定，所有样品RNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.9~2.1，OD260 nm/OD230 nm值在2.0~2.5。说明RNA未被DNA、蛋白质及有机试剂污染，也没有发生大量降解。随后用反转录试剂盒合成cDNA。采用Real-time quantification PCR法对DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ERα及PgR基因转录水平进行检测，引物(表 1)由TaKaRa(大连，中国)设计并合成。预变性处理为95 ℃ 120 s，扩增进行45个循环，包括95 ℃ 5 s，64 ℃ 30 s。GAPDH为内参照基因，以2-ΔΔCt计算各目的基因相对转录水平。
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表 1 引物和基因序列 Table 1 Gene sequence and primers |
使用SPSS 21.0软件进行统计学分析。组间比较经方差齐性检验后进行单因素方差分析，方差不齐时，采用独立样本T检验。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 妊娠期暴露BPA对子代成年雌鼠脏器指数的影响如图 2所示，妊娠期暴露10 mg·kg-1 BPA可极显著增加子代成年小鼠子宫指数(P＜0.01)。妊娠期暴露2.5、10和40 mg·kg-1 BPA可极显著增加子代成年小鼠卵巢指数(P＜0.01)。
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与空白对照组(0 mg·kg-1)相比，**.P < 0.01; *.P < 0.05，下同 Compared with the control group (0 mg·kg-1), **.P < 0.01; *.P < 0.05, the same as below 图 2 妊娠期暴露BPA对子代成年雌鼠脏器指数的影响 Fig. 2 Effects of BPA exposure during pregnancy on uterine and ovarian index of adult offspring females |
从图 3可以看出，空白组成年小鼠卵巢内可看到一定数量的原始卵泡(PmF)、初级卵泡(PrF)、次级卵泡(SF)、成熟卵泡(GF)和黄体(CL)，闭锁卵泡(AF)较少，各级卵泡依次排列，黄体界限清晰。BPA暴露小鼠成年后，随BPA剂量增加，卵巢内原始卵泡数量减少，初级卵泡和次级卵泡数量增多，黄体相对较少并且没有清晰界限，而闭锁卵泡增多，20和40 mg·kg-1 BPA组卵巢体积明显缩小。
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A、B、C、D、E、F(其后数字1代表 100×, 数字2代表 400×)分别为空白对照组和2.5、5、10、20、40 mg·kg-1BPA组。PmF.原始卵泡；PrF.初级卵泡；SF.次级卵泡；GF.成熟卵泡；AF.闭锁卵泡；CL.黄体 A. The control group (following number 1 stands for 100× and number 2 for 400×); B. The 2.5 mg·kg-1 BPA group; C. The 5 mg·kg-1 group; D. The 10 mg·kg-1 group; E. The 20 mg·kg-1 group; F. The 40 mg·kg-1 group, the same as below. PmF. Primordial follicle; PrF. Primary follicle; SF. Secondary follicle; GF. Gratian follicle; AF. Atretic follicle; CL. Corpus luteum 图 3 子代成年小鼠卵巢的组织学观察 Fig. 3 Histomorphological observation of the ovaries in adult offspring females |
如图 4所示，妊娠期暴露各剂量BPA(2.5、5、10、20和40 mg·kg-1)可显著或极显著降低子代成年雌鼠血清FSH与LH活性(P < 0.05或P < 0.01)，极显著降低血清E2与P4含量(P＜0.01)。
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图 4 妊娠期暴露BPA对子代成年雌鼠血清E2、P4、FSH和LH水平的影响 Fig. 4 Effects of exposure to BPA during pregnancy on serum E2, P4, FSH and LH levels of adult offspring females |
由图 5结果可以看出，BPA各剂量组(2.5、5、10、20和40 mg·kg-1BPA)均极显著提高子代成年雌鼠卵巢ERα含量，5、10、20和40 mg·kg-1 BPA极显著提高子代成年雌鼠卵巢ERβ含量(P＜0.01)。
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图 5 妊娠期暴露BPA对子代成年雌鼠卵巢ERα和ERβ含量的影响 Fig. 5 Effects of exposure to BPA during pregnancy on ovarian ERα and ERβ contents of adult offspring females |
如图 6所示，5、10、20和40 mg·kg-1 BPA可极显著降低子代成年雌鼠卵巢ERα mRNA转录水平(P＜0.01)。BPA各剂量组(2.5、5、10、20和40 mg·kg-1 BPA)均极显著降低子代成年雌鼠卵巢PgR相对转录水平(P＜0.01)。
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图 6 妊娠期暴露BPA对子代成年雌鼠卵巢ERα和PgR mRNA转录水平的影响 Fig. 6 Effects of BPA exposure during pregnancy on mRNA relative transcription levels of ovarian ERα and PgR in adult offspring females |
如图 7所示，妊娠期暴露不同剂量BPA(2.5、5、10、20和40 mg·kg-1 BPA)均能极显著降低子代成年雌鼠卵巢DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA转录水平(P＜0.01)。
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图 7 妊娠期暴露BPA对子代成年雌鼠卵巢DNA甲基转移酶mRNA相对转录水平的影响 Fig. 7 Effects of BPA exposure during pregnancy on mRNA relative transcription levels of ovarian DNMT in adult offspring females |
研究表明，BPA的无明显作用水平(no observed adverse effect level, NOAEL)为50 mg·(kg·d)-1[15-16]，并有研究表明，90%~99%的成年人或儿童因为饮食而暴露BPA[4, 16-18]。因此本试验通过口服灌胃的方法建立孕鼠BPA暴露模型，探究BPA对子代成年雌鼠的生殖损伤作用。
BPA发挥作用的机制之一是与雌激素受体结合[19]，形成双酚A-ER复合物，模拟E2-ER复合物与核内DNA上的雌激素应答元件(estrogen response element，ERE)结合，顺势激活ERE及下游转录因子。Yuan等[4]研究发现，BPA可通过结合雌激素受体，下调SGK1和ENaCα蛋白的表达，从而干扰胚胎发育。另有研究发现，女性暴露BPA可能会降低体外受精期间卵母细胞质量[20]。通过体内试验笔者发现，母鼠妊娠期暴露BPA可显著提高子代成年雌鼠卵巢内ERα与ERβ含量，极显著降低子代成年雌鼠卵巢ERα和PgR mRNA转录水平(P < 0.01)。BPA作为一种人工合成雌激素，与天然雌激素相似的结构意味着它可以与体内雌激素受体结合[21]，人为地增加了体内雌激素的含量，促进雌激素受体的产生，然而雌激素受体持续过多表达，机体可能通过多方位调控，使ERα和PgR mRNA转录水平发生下调，同样，由于BPA的弱雌激素效应，抑制成年小鼠体内E2的正常产生。因此，试验发现，BPA组子代成年雌鼠血清中E2水平显著降低。本试验还发现，BPA可极显著降低子代成年雌鼠血清P4含量，以及LH与FSH的活性。FSH刺激卵泡的生长发育，LH对于卵泡成熟、黄体形成及P4的分泌有重要作用。卵巢的组织学观察也发现，BPA组卵巢内黄体较少，原始卵泡和初级卵泡较多，但与空白组相比成熟卵泡并没有显著增加，可能是由于BPA的雌激素效应使卵巢内卵泡数量增多，但卵泡的正常发育需要多种生殖激素(如FSH和LH)的精细调控，而BPA打破了机体内分泌的稳态，使得大部分卵泡无法正常发育成熟，卵巢是生殖激素生成和分泌的主要器官，它们的细微变化反过来也可能对生殖激素产生极大的影响。并且P4和PgR水平的降低对子代小鼠的正常妊娠极为不利，基础雌激素低水平是卵巢反应性下降的预测指标，BPA能使子代雌鼠血清E2水平降低，使卵巢反应降低。持续卵巢低反应使雌、孕激素水平低下，FSH活性降低，抑制LH峰，从而阻断排卵过程，引起过多发育卵泡的闭锁[22]。
一些研究表明，环境内分泌干扰物质(EDCs)能够引起卵巢的多囊卵泡综合征，使卵巢出现囊泡，子宫发生水肿，提高器官指数[23-25]。本研究发现，妊娠暴露BPA组子代成年雌鼠卵巢和子宫指数出现上升，但组织学观察显示卵巢实质器官出现萎缩，猜测指数升高可能的原因是剖检时卵巢表面多有液状囊泡，在计量时增加了质量，然而固定过程中液状囊泡发生破裂，卵巢的实质部分表现萎缩。
由DNA甲基转移酶所介导的DNA甲基化是基因沉默的结果，并对基因沉默加以维持[26]。研究发现，BPA暴露改变胎盘形成过程，在DNA甲基化重编程过程中下调WNT2基因表达，引起怀孕小鼠先兆子痫样变化[27]。本研究发现，与空白组相比，妊娠期暴露BPA可显著降低子代成年雌鼠卵巢DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的转录水平。而DNA甲基转移酶的降低不利于成熟配子对印记基因的维持，可能使基因丧失时空特异性，导致多种发育疾病的发生[28]。本研究中，BPA组子代成年雌鼠DNA甲基转移酶转录水平显著下降，大大降低其染色质结构的稳定性，使基因处于异常活化状态，加剧卵巢功能的紊乱，并对小鼠生殖能力造成严重危害。本研究将生殖激素、卵巢激素受体与DNA甲基转移酶的变化相结合，从表观遗传学角度看待BPA造成的生殖损伤，发现BPA能导致DNA甲基转移酶水平降低，干扰生殖。但本研究仅对子一代进行了试验分析，关于BPA更进一步的遗传毒性、生殖毒性及在表观遗传学上的影响还需深入探索。
4 结论妊娠期暴露BPA能显著抑制子代成年雌鼠生殖激素的活性与含量，增加卵巢雌激素受体含量，抑制雌激素受体、孕酮受体和DNA甲基转移酶的基因表达。从组织学水平、生殖激素及受体水平、受体及DNMT基因水平说明BPA可通过母体作用于下一代，并具有一定的生殖毒性。
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