肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是具有内分泌特性的肽能系统，由两条代谢通路组成，分别为经典的ACE-Ang Ⅱ-AT1R和新的ACE 2-Ang 1-7-MasR。两条通路相互拮抗共同维持着RAS的平衡[1]。血管紧张素Ⅱ (Ang Ⅱ)是经典通路中的关键酶血管紧张素转化酶(ACE)的催化产物，作为途径核心，生理剂量的Ang Ⅱ可通过与其靶细胞膜上的受体结合发挥多种效应。过量的Ang Ⅱ可导致血压升高，血管和组织纤维化、氧化应激以及组织损伤等[2-3]。2000年，随着血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE 2)的发现，形成了RAS中ACE 2-Ang 1-7-MasR新的通路。新通路中ACE 2可以降解Ang Ⅱ产生血管紧张素1~7(Ang 1-7)，后者通过结合Mas受体(MasR)拮抗Ang Ⅱ，发挥抗炎抗损伤的作用[3-4]。
既往的研究已经证实，除了循环系统存在RAS外，局部组织也存在着RAS。并且局部RAS介导或参与了局部组织的促炎和抗炎的调节作用[5]。研究发现在多种组织炎性损伤时，局部RAS处于激活或过度激活状态，而作为RAS最重要的活性成分，高水平Ang Ⅱ可激活炎症因子促进炎症反应, 是促进炎症反应的主要介质[6]。ACE 2可以通过降解Ang Ⅱ，抑制其对炎症反应的上调效应，并且生成Ang 1~7，激活MasR起到拮抗Ang Ⅱ的作用，从而实现对炎症反应下调效应[7-8]。王鲲等[9]用脂多糖(LPS)诱导小鼠乳腺及乳腺上皮细胞炎症损伤，发现小鼠血液和细胞上清中Ang Ⅱ的浓度均有升高，推测Ang Ⅱ与在其他组织中一样，也是乳腺炎症损伤中起促炎作用的主要介质。提示：在牛乳腺组织发生炎症损伤时，过量产生Ang Ⅱ及ACE 2表达下调可能仍然是关键的调控因子，但二者之间有怎样的作用还不清楚。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[10]、白细胞介素(interleukin，IL) -6[11]、IL-8[12]、IL-10[13]均已被证实是参与细胞炎性损伤的细胞因子。因此，本研究拟以牛乳腺上皮细胞为研究对象，以Ang Ⅱ诱导细胞发生炎性损伤，通过检测不同浓度Ang Ⅱ刺激对MAC-T炎性因子释放的影响，并通过比较细胞中降解和产生Ang Ⅱ的主要酶ACE 2和ACE的表达变化，分析ACE 2与各因子之间的相关性。探讨ACE 2与Ang Ⅱ致细胞损伤的相互关系，为进一步研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 细胞来源牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)：美国伊利诺伊大学Loor教授馈赠，本实验室冻存。
1.2 主要试剂血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)购于南京建成生物科技有限公司；牛IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α ELISA试剂盒购于南京奥青生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术公司；ACE 2、ACE抗体均购自英国Abcam公司；磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购于南京生兴生物有限公司；山羊抗兔IgG购于上海生工生物工程有限公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购于Millipore公司；超敏ECL化学发光液购于Tanon公司等。
1.3 Ang Ⅱ体外诱导MAC-T细胞炎症损伤 1.3.1 细胞处理与收集首先进行预试验，用终浓度分别为0、10-8、10-7、10-6、10-5 mol·L-1的Ang Ⅱ处理牛MAC-T细胞24 h后，通过检测细胞上清中应激损伤的相关指标，包括羟基自由基(·OH)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)；结果显示终浓度为10-7mol·L-1时，各指标产生显著或极显著变化；而在10-6、10-5 mol·L-1时各指标均产生了极显著的变化。因此，本试验筛选出10-8 (低浓度)和10-6 mol·L-1 (高浓度)两个浓度用于后续的试验。
将细胞按照合适密度接种于6孔板中，待细胞融合至80%时，弃培养液，加入不完全培养液(不含胎牛血清)饥饿处理12 h；加入Ang Ⅱ终浓度分别为0、10-8、10-6 mol·L-1的不完全培养液，在37 ℃、5% CO2条件下培养6 h，收集上清和细胞。收集的细胞在冰浴环境下破碎，4 ℃离心，取细胞上清作为待测样品。用BCA法测定样品的蛋白浓度。每个处理设3个平行孔，收集细胞上清和细胞待测样品进行相关指标检测。
1.3.2 细胞上清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8和抗炎因子IL-10含量的检测ELISA方法测定，操作步骤按试剂盒说明书进行，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。结果以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，即为样品的实际浓度(单位：ng·L-1)。
1.3.3 Ang Ⅱ处理牛MAC-T细胞中ACE 2/ACE蛋白表达变化Western blot检测各处理细胞中ACE 2、ACE的表达变化，参照王鲲等[9]的方法进行操作。利用Image J软件分析蛋白条带的灰度，均以GAPDH作为内参，目的条带与内参相比得到相对表达量。
1.4 添加ACE 2活性蛋白对Ang Ⅱ诱导损伤的保护作用 1.4.1 牛乳腺上皮细胞培养及分组将细胞按照合适密度接种于6孔板中，待细胞融合至80%时，弃去培养液，PBS洗涤细胞两遍，加入不完全培养液饥饿处理12 h后，将细胞分为：1)空白对照组：加入同体积的不完全培养液；2)Ang Ⅱ高浓度组：终浓度为10-6 mol·L-1Ang Ⅱ；3)Ang Ⅱ低浓度组：终浓度为10-8 mol·L-1 Ang Ⅱ；4)处理组Ⅰ：终浓度为100 ng·mL-1的ACE 2；5)处理组Ⅱ：终浓度为100 ng·mL-1 ACE 2以及终浓度为10-8 mol·L-1 Ang Ⅱ共同处理；6)处理组Ⅲ：终浓度为100 ng·mL-1 ACE 2以及终浓度为10-6 mol·L-1 Ang Ⅱ共同处理。在处理组Ⅱ和处理组Ⅲ中，均为2 h后加入Ang Ⅱ。
每组处理设置3个平行孔，37 ℃、5% CO2培养箱中处理6 h后，收集各孔细胞和细胞上清用于后续ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10等的含量。提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定并计算出蛋白浓度。
1.4.2 细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的含量测定用ELISA方法测定，方法同“1.3.2”。
1.5 数据统计分析获得的数据通过SPSS 16.0统计软件进行统计分析，采用单因子方差分析(One way ANOVA，LSD)进行差异显著性检验。所有数值以平均值±标准误(x±sx)来表示。
2 结果 2.1 Ang Ⅱ体外诱导对牛MAC-T细胞抗炎和促炎作用的影响选用终浓度分别为0、10-8、10-6 mol·L-1的Ang Ⅱ作用于牛MAC-T细胞6 h后，检测其细胞上清中炎性细胞因子的含量。结果见表 1。
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表 1 不同浓度Ang Ⅱ处理牛MAC-T细胞各炎性因子含量(x±sx，n=3) Table 1 Determination of inflammatory factors in bovine MAC-T cells treated with different concentrations of Ang Ⅱ (x±sx, n=3) |
由表 1看出，Ang Ⅱ刺激6 h后可以导致牛MAC-T细胞上清中TNF-α含量升高，高浓度(Ang Ⅱ高浓度组，10-6mol·L-1)时，TNF-α含量极显著升高(P < 0.01)，低浓度(Ang Ⅱ低浓度组，10-8 mol·L-1)时，升高但差异不显著；同时细胞上清中IL-8含量升高，与对照组相比，低浓度处理组IL-8含量显著升高(P < 0.05)，高浓度处理组差异极显著(P < 0.01)；此外细胞上清中IL-6含量升高，在高浓度刺激下，IL-6含量极显著升高(P < 0.01)，而低浓度处理组升高但差异不显著；而细胞上清中抗炎因子IL-10的含量下降，与对照组相比，低浓度处理组差异不显著，高浓度处理组差异显著(P < 0.05)。
2.2 不同浓度Ang Ⅱ诱导细胞中ACE 2、ACE的表达变化Western blot结果(图 1)显示，在10-8 mol·L-1 Ang Ⅱ处理组，ACE 2蛋白表达略低于未处理组(0.91±0.06 vs 1.07±0.21，P>0.05)；在10-6 mol·L-1 Ang Ⅱ处理组，ACE 2蛋白表达显著下调(0.74±0.06 vs 1.07±0.21，P < 0.05)。而在10-8 mol·L-1 Ang Ⅱ处理组，ACE蛋白表达出现显著升高(0.61±0.06 vs 0.42±0.03，P < 0.05)；在10-6 mol·L-1 Ang Ⅱ处理组，ACE蛋白表达极显著上升(0.80±0.03 vs 0.42±0.03，P < 0.01)。此外ACE 2与ACE的比值显示，Ang Ⅱ作用于MAC-T细胞可以引起ACE 2/ACE比值极显著下调。
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与对照组(0 mol·L-1)比较，*. P < 0.05; **. P < 0.01 Compared with control group (0 mol·L-1), *. P < 0.05; **. P < 0.01 图 1 MAC-T细胞中ACE 2、ACE蛋白表达变化 Fig. 1 The ACE 2 protein expression changes in the MAC-T cells |
对不同浓度的Ang Ⅱ与ACE 2蛋白表达之间进行相关性分析，结果如图 2，由图看出：ACE 2的蛋白表达水平与Ang Ⅱ浓度之间呈负相关性，相关性系数为-0.878 8。
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图 2 MAC-T中Ang Ⅱ浓度与ACE 2蛋白表达的线性关系 Fig. 2 Linear relationship between Ang Ⅱ concentration and ACE 2 protein expression in MAC-T |
各处理组炎症损伤指标TNF-α、IL-8、IL-6和IL-10测定结果如图 3所示。
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*. P < 0.05; **. P < 0.01. n=3 图 3 细胞上清中TNF-α、IL-8、IL-6和IL-10含量 Fig. 3 The content of TNF-α, IL-8, IL-6 and IL-10 in cell supernatant |
如图 3A所示，终浓度为10-8 mol·L-1 Ang Ⅱ处理组与无Ang Ⅱ处理组相比，TNF-α浓度显著升高(P < 0.05)；ACE 2活性蛋白与Ang Ⅱ共处理，可以显著降低Ang Ⅱ诱导的TNF-α的升高(P < 0.05)。
2.3.2 IL-8的测定如图 3B所示，结果与TNF-α一致，ACE 2外源活性蛋白的添加可以显著降低10-8 mol·L-1 Ang Ⅱ诱导的IL-8的增加(P < 0.05)。
2.3.3 IL-6的测定如图 3C所示，在Ang Ⅱ终浓度为10-6 mol·L-1时可以诱导IL-6出现显著增高。外源性活性蛋白ACE 2的添加可以极显著降低MAC-T细胞IL-6的分泌(P < 0.01)。
2.3.4 IL-10的测定如图 3D所示，Ang Ⅱ在终浓度为10-6 mol·L-1时，可以显著刺激IL-10分泌的降低(P < 0.05)；添加ACE 2活性蛋白后，细胞上清中IL-10的含量出现上升，其中10-8 mol·L-1 Ang Ⅱ处理组与10-8mol·L-1 Ang Ⅱ+ACE 2共处理组相比差异显著(P < 0.05)。
2.3.5 结果分析根据以上结果，在Ang Ⅱ刺激MAC-T细胞6 h后，检测到细胞上清中的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-8均出现了显著升高，且与Ang Ⅱ浓度呈正相关；而抗炎因子IL-10浓度显著下降，与Ang Ⅱ浓度呈负相关。Ang Ⅱ可引起促炎因子释放，抑制抗炎因子的释放或分泌。不同浓度Ang Ⅱ处理细胞后，ACE 2蛋白表达均有降低，10-6 mol·L-1 Ang Ⅱ处理后显著降低(P < 0.05)，而ACE蛋白表达则相反；ACE 2与Ang Ⅱ浓度之间存在显著负相关。添加外源性ACE 2活性蛋白后，结果显示细胞上清中的TNF-α、IL-6和IL-8浓度均有一定程度的下降，IL-10浓度升高，即ACE 2可以抑制Ang Ⅱ诱导的促炎因子的释放，诱导IL-10的分泌，即抑制炎性反应。
3 讨论本实验室前期研究发现，当奶牛乳腺发生炎症时，乳腺Ang Ⅱ水平升高[14]，提示Ang Ⅱ的过量产生可能与乳腺炎的发生有着一定的联系，但详细机制尚不清楚。IL-6是在损伤后协调机体防御反应的一种重要的细胞因子，是炎症反应的重要介质。IL-6和IL-8多在细胞受到TNF-α的刺激后产生[15-16]。Boudjellab等[17]使用MAC-T细胞的体外研究表明，当用不同浓度梯度的LPS刺激时，MAC-T表达IL-8 mRNA并分泌IL-8蛋白，且这种反应呈时间和剂量依赖性，当LPS刺激1 h时，可以检测到IL-8 mRNA水平表达；当使用20 μg·mL-1的LPS刺激48 h时，IL-8表达量达到最高，提示MAC-T在乳腺炎症早期可以是IL-8的来源，IL-8在抵抗细菌感染中起到重要作用。Lee和Zhao[18]通过共同培养MAC-T和牛主动脉内皮细胞，发现rHIL-8(recombinant interleukin-8)可通过由诱导嗜中性粒细胞的迁移，且rHIL-8以剂量依赖性方式刺激牛嗜中性粒细胞的迁移。
本试验中笔者检测了细胞上清中TNF-α和IL-6以及IL-8和IL-10水平，结果Ang Ⅱ刺激MAC-T细胞6 h后，细胞上清中TNF-α和IL-6以及IL-8的升高，IL-10的下降，证实Ang Ⅱ在浓度为10-8(低浓度)和10-6(高浓度)mol·L-1时作用MAC-T细胞6 h可以导致细胞炎性因子的释放或细胞炎性反应。这个结果也与王鲲等[9]在大鼠乳腺上皮细胞上的研究结果一致。
已经证实，Ang Ⅱ是RAS经典通路中的重要活性物质，生理水平的Ang Ⅱ在调节血压和维持机体水电解质平衡等方面发挥着重要作用，但过量的Ang Ⅱ可导致血压升高，血管和心脏纤维化，氧化应激，进而促进组织损伤的发生发展[19-20]。已证实ACE 2是RAS系统的负向调控因子[21]。其在体内、外均能够有效水解Ang Ⅱ产生Ang 1~7，后者与MasR受体结合，抑制Ang Ⅱ的作用，从而实现对组织的保护作用。还通过诱导内皮细胞释放NO，减轻氧化应激，实现对组织的保护作用[22]。
近些年ACE 2-Ang 1-7-Mas途径在抗炎症的作用得到了广泛的关注，由于外界作用导致机体积累形成高水平的Ang Ⅱ成为激发炎症反应的主要因素之一。Imai等[23]指出SARS冠状病毒感染可以导致ACE 2表达的下调。ACE 2下调引发RAS失衡，使Ang Ⅱ累积，最终造成肺水肿和肺损伤。并提出肺局部RAS参与机体的炎症反应，Ang Ⅱ可激发炎症反应，诱导肺组织损伤。炎症反应早期，即有Ang Ⅱ表达的升高，Ang Ⅱ受体表达上调，Ang Ⅱ可诱导单核细胞活化，促进血管平滑肌细胞和巨噬细胞分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及单核细胞趋化蛋白(MCP-1)等细胞因子的释放[24-25]。本研究中直接用Ang Ⅱ诱导细胞损伤，观察了ACE 2和ACE蛋白表达的变化，发现在所选浓度Ang Ⅱ的诱导下，ACE 2和ACE的蛋白表达发生了相反的变化，ACE 2蛋白表达下降，ACE蛋白表达升高，且ACE 2蛋白表达与Ang Ⅱ浓度呈负相关。因此提示：ACE 2/ACE轴的失衡是Ang Ⅱ诱导损伤的主要原因。
ACE 2在心[26]、肾[27]、肺[28]、肠[29]、胰腺[30]等组织器官中的抗损伤作用主要是通过降解Ang Ⅱ，介导Ang 1-7/MasR通路实现的。Ang Ⅱ与细胞炎症反应和氧化应激等存在明显的正相关性，它本身能够引起细胞炎症反应，也能被炎症反应上调。高水平的Ang Ⅱ对Ang 1-7是ACE 2的产物也是ACE 2-Ang 1-7-MasR轴的重要环节，能够直接参与调节细胞炎症损伤。本研究中发现外源ACE 2活性蛋白加入，对Ang Ⅱ诱导的牛乳腺上皮细胞炎性损伤有一定的抵抗作用，与He等[31]在间充质干细胞上的研究一致。
4 结论本研究表明Ang Ⅱ诱导细胞炎性损伤的主要原因是使ACE 2/ACE轴失衡。高水平Ang Ⅱ可激活炎症因子促进炎症反应，是促进炎症反应的主要介质，而外源ACE 2活性蛋白的加入，可以抑制其对炎症反应的上调效应，对细胞炎性损伤有一定的缓解作用。
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