2. 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410128
2. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科、疱疹病毒属，又被称为猪疱疹病毒1型，可引起多种家畜和野生动物感染而发生伪狂犬病，但猪是PRV的天然宿主和贮存宿主，常呈流行性感染。感染后，成年猪常表现为隐性感染和呼吸道症状，母猪出现流产、产死胎和木乃伊胎等症状，公猪表现为睾丸炎，仔猪表现发热、昏迷和神经症状等，死亡率较高[1]。PRV感染猪后可建立隐性感染，主要潜伏在猪的神经组织中，在应激因子的刺激下病毒基因组被激活，重新产生感染性病毒粒子，导致动物发病，并传播给其他动物[2]。因此，很多国家将猪伪狂犬病列为法定传染病，为此制定并严格执行净化计划，在一些国家的家猪中已根除，但在一些生猪饲养密度较大的国家仍是一种重要的传染病[1, 3]。
热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一类重要的分子伴侣，在蛋白质折叠、装配、蛋白酶体降解等多种生物学活动中发挥作用[4]。当细胞受到外界环境刺激如高温、缺氧或病原体感染时，可调节HSPs在细胞内的表达以维持细胞稳态。研究表明HSPs在病毒感染中具有重要作用，可参与病毒的复制、病毒蛋白和颗粒的合成，不同HSPs在不同病毒的感染刺激下其表达不一致。在猪圆环病毒2型(PCV2)感染宿主细胞的过程中，HSP27在核区以磷酸化形式上调和积累，当抑制HSP27的磷酸化或下调总HSP27时，均可显著减少病毒的复制；同时，过表达HSP27可增强PCV2基因组的复制和病毒粒子的产生，提示PCV2在细胞中的产生需要HSP27的参与[5]。在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和乙肝病毒感染或稳定转染病毒核酸的细胞中，HSP27的表达显著上调[6-7]，而猪流行性腹泻病毒感染MARC-15细胞可诱导细胞中HSP27的显著下降，当过表达HSP27时可显著降低病毒滴度(28倍)[8]。作为HSPs家族成员之一，HSP70在多数病毒感染细胞内均呈现高表达。在口蹄疫病毒感染诱导的羔羊心肌炎中，HSP70在心肌组织中过表达[9]；在登革热病毒感染的细胞中，HSP70的诱导形式也显著升高[10]；在高致病性PRRSV感染细胞中，使用高通量蛋白质组学鉴定发现HSP70作为细胞因子参与病毒的复制[11]。HSP90在细胞内广泛分布、表达量较高、进化过程中高度保守，作为细胞内最活跃的分子伴侣之一，HSP90对细胞周期的控制、细胞生存、激素作用以及大量相关信号转导通路等发挥重要作用[4]。HSP90是PCV2在宿主细胞中复制所必需的，抑制HSP90可减少病毒的复制[12-13]。
目前，对于PRV体外感染宿主细胞后，对细胞的增殖及HSPs在细胞中表达规律的研究甚少。本研究用PRV-YY病毒株[14]感染猪肾细胞(PK-15)，通过实时监测细胞增殖系统、荧光定量PCR及蛋白免疫印迹等方法，分别监测了病毒感染细胞不同时间点后，细胞的增殖情况及HSP27、70和90的表达变化，以探讨PRV感染后细胞应激反应的变化规律并初步分析其意义。
1 材料与方法 1.1 主要材料和设备猪肾细胞PK-15购自中国科学院上海细胞库；猪伪狂犬病病毒PRV-YY株由湖南农业大学余兴龙教授馈赠，该毒株与国内外主要PRV毒株序列同源性较高，与国内的Ea株、BJ-YT株和TJ株在系统进化树上处于同一分支[14]；胎牛血清和DMEM高糖培养基分别购自Gibco和Hyclone公司；BCA蛋白定量试剂盒和HSP27(ser82)抗体购自碧云天生物技术有限公司；TRIzolTM购自Invitrogen公司；HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒和ChamQTM SYBR®qPCR Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液购自Solarbio公司；小鼠抗HSP27和HSP70单克隆抗体购自Abcam公司；小鼠抗HSP90单克隆抗体购自Proteintech公司；GAPDH抗体购自康成生物公司；HRP标记的驴抗小鼠IgG抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；PVDF膜购自Merck Millipore公司；StepOne荧光定量PCR仪(ABI公司)；NanoDrop2000核酸分析仪(Thermo公司)；ChemiDocTM XRS+化学发光成像仪(Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将生长状态良好的PK-15细胞以适当密度接种于培养皿，所用培养液为DMEM高糖培养基，添加10%的胎牛血清(FBS)和1%青-链霉素，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 病毒的培养及TCID50的测定用PK-15繁殖PRV-YY毒株，将病毒接种至80%以上的细胞出现病变时，收集病毒悬液反复冻融次3次，离心后收集上清，分装置于-80 ℃保存备用。采用Reed-Muench法测定病毒的滴度，将10倍梯度稀释的病毒液(10-1~10-9)接种细胞，用含2% FBS的培养基培养3~5 d，每12 h观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)的形成，至不再有新的细胞培养孔出现CPE时结束，记录出现CPE的细胞培养孔数，根据Reed-Muench法计算TCID50。
1.2.3 细胞增殖检测采用iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪(Roche，德国)监测细胞增殖，具体操作参照文献[15]进行，稍作修改：将消化离心后的细胞(1×105个·mL-1)接种至预先自动调零的E-Plate板(200 μL·孔-1)，静置待细胞沉降后将E-Plate板重新置于分析仪内进行实时监测；当细胞进入对数生长期后，取出E-Plate L8，轻轻吸出100 μL培养基，再加入100 μL含不同滴度的PRV-YY病毒液，轻轻混匀后将E-Plate板置于分析仪中(最终病毒滴度分别为0、10、20、40、80和100 TCID50)，培养箱孵育1.5 h后弃病毒液(此时记为感染后0 h)，每孔加200 μL细胞维持液继续培养并实时监测细胞的增殖情况，细胞的增殖能力用细胞指数(cell index，CI)表示。
1.2.4 反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)用含10 TCID50的PRV病毒液吸附细胞1.5 h(吸附结束后定义为感染后0 h)，去掉病毒液加细胞维持液继续培养，分别在感染后0、3、6、12、24、48和72 h收集细胞，用于提取DNA和RNA。其中提取的DNA用作模板检测PRV gE基因的转录；细胞总RNA采用Trizol法提取，NanoDrop 2000测定其浓度和纯度，总RNA产物用HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录，得到的cDNA作为模板用于荧光定量PCR检测，用Vazyme ChamQTM SYBR®qPCR Master Mix试剂盒进行qPCR反应，根据Ct值按相对表达量2-△△Ct法分析试验数据，以GAPDH作为内参，内参基因的表达水平设定为1，计算目的基因的相对定量。所用引物参照GenBank中公布的序列进行设计，由华大基因股份有限公司合成，序列见表 1。
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表 1 qPCR所用引物序列 Table 1 Primer sequences used for qPCR |
蛋白的提取、浓度测定、SDS-PAGE凝胶电泳分离以及转印等按文献[15]方法进行，蛋白转印至PVDF膜上用0.2%明胶室温封闭1 h，随后分别加入相应的小鼠源抗HSP27、HSP70和HSP90单克隆抗体(稀释比例均为1:2 000)4 ℃孵育过夜；TBST洗涤后加入HRP标记的驴抗小鼠IgG抗体(1:5 000)室温孵育1 h，TBST洗涤；最后用ECL化学发光液进行显色，于ChemiDocTM XRS+成像系统中检测蛋白质条带并用Quantity One软件分析条带的密度值和表达量，以GAPDH为总蛋白内参。
1.2.6 数据分析试验数据以x±s表示，所得试验数据利用SPSS Statistics 17统计分析软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD检验，P < 0.05时差异显著，P < 0.01时为差异极显著，P>0.05时差异不显著，并用GraphPad Prism 5软件作图表示。
2 结果 2.1 PRV感染对PK-15细胞增殖的影响经Reed-Muench法计算，本研究中培养获得的PRV-YY病毒株滴度为106TCID50·0.1 mL-1。分别用不同的病毒滴度感染PK-15细胞，通过iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪实时检测发现，如图 1A所示，当滴度小于或等于40 TCID50的病毒量感染时，从感染开始至24 h时，细胞指数逐渐升高，说明细胞处于快速增殖过程；而较高病毒滴度(80和100 TCID50)感染时，细胞指数无显著升高，说明细胞的增殖受到显著影响；随着处理时间延长，细胞的指数均呈时间依赖性下降。如图 1B显示，当感染至60 h时，20、40、80和100 TCID50病毒感染组细胞指数均显著低于空白组，且差异极显著(P < 0.01)；而病毒浓度为10 TCID50感染时与对照组无显著差异(P>0.05)。因此，在后续试验中选用10 TCID50病毒量处理细胞。
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A. iCELLigence细胞功能分析仪实时监测PRV-YY感染后PK-15细胞的增殖曲线；B. PRV-YY感染后60 h的细胞指数。与对照组相比，*. P < 0.05，**. P < 0.01。下图同 A. Real-time monitor the proliferation of PK-15 cells infected with PRV-YY; B. Cell index after 60 h of PRV infection. Compared with the control group, *. P < 0.05, **. P < 0.01. The same as below 图 1 不同PRV-YY病毒量感染对PK-15细胞增殖的影响 Fig. 1 Effect of different titers of PRV-YY infections on proliferation of PK-15 cells |
PRV感染PK-15细胞后，检测了病毒gE基因在细胞中的表达变化，结果如图 2所示，用10 TCID50病毒量感染3 h时，在细胞中检测到微量的病毒核酸，随后缓慢升高，在感染后24~60 h病毒核酸含量极显著升高，在60 h时达到较高水平，随后下降；在对照细胞中(以基础培养基替代病毒处理72 h的细胞)未检测到病毒核酸。
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对照：以基础培养基代替病毒处理72 h的细胞 Control:Cells treated with basic medium (replacting virus) for 72 h served as controls 图 2 各时间点PRV在细胞内的复制水平 Fig. 2 PRV nucleic acid replication level in cells at different time |
PRV感染后0 h时，细胞中HSP27 mRNA水平显著升高(P < 0.05)；感染后3 h，其表达水平极显著上升(P < 0.01)，随后快速下降；在感染后6~24 h时，与对照组相比无显著变化(P>0.05)；而在感染后48、72 h相对于对照组其表达下降(P < 0.05、P < 0.01)，图 3A所示。PRV感染PK-15细胞后，总HSP27蛋白表达无明显变化(P>0.05)，但其ser82位磷酸化变化趋势与其基因水平变化相似，在感染后0、3和6 h时其磷酸化水平上升，且3 h时上升较明显(P < 0.01)，随后下降，其中72 h下降最为显著(P < 0.01)，如图 3B和C所示。
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A. RT-qPCR检测HSP27 mRNA；B. Western blot检测HSP27蛋白；C. Western blot结果量化分析；PRV-YY感染滴度为10 TCID50 A. Detection of HSP27 mRNA expression using RT-qPCR assay; B. Detection of HSP27 protein using Western blot; C. Quantitative analysis of the results from Western blot assay; PRV-YY titer was 10 TCID50 图 3 PRV-YY感染对PK-15细胞中HSP27 mRNA和蛋白表达的影响 Fig. 3 Effects of PRV-YY infection on expressions of HSP27 mRNA and protein in PK-15 cells |
RT-qPCR结果显示，与对照组相比，PRV感染后HSP70的mRNA水平在0 h极显著上升(P < 0.01)，3 h上升不显著，在后续检测时间点均极显著下降(P < 0.01)(图 4A)。PRV感染后，PK-15细胞中HSP70蛋白水平变化趋势与其mRNA水平相似，但其变化幅度不如mRNA水平那么大(图 4B和C)。
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A. RT-qPCR检测HSP70 mRNA；B. Western blot检测HSP70蛋白；C. Western blot结果量化分析；PRV-YY感染滴度为10 TCID50 A. Detection of HSP70 mRNA expression using RT-qPCR assay; B. Detection of HSP70 protein using Western blot; C. Quantitative analysis of the results from Western blot assay; PRV-YY titer was 10 TCID50 图 4 PRV-YY感染对PK-15细胞中HSP70 mRNA和蛋白表达的影响 Fig. 4 Effects of PRV-YY infection on expressions of HSP70 mRNA and protein in PK-15 cells |
如图 5A显示，PRV感染后PK-15细胞中HSP90基因表达趋势与HSP70的类似，0 h时极显著升高(P < 0.01)，随后下降；在感染后至12 h以后各时间点的表达量均极显著低于对照组(P < 0.01)；HSP90蛋白表达“先升高，后下降”的变化趋势与其mRNA水平变化类似，0 h时极显著升高(P < 0.01), 随后下降，3 h时显著低于对照组(P < 0.05)，6~24 h与对照组差异不显著，48、72 h显著或极显著低于对照组(P < 0.05或P < 0.01)(图 5B和C)。
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A. RT-qPCR检测HSP90 mRNA；B. Western blot检测HSP90蛋白；C. Western blot结果量化分析；PRV-YY感染滴度为10 TCID50 A. Detection of HSP90 mRNA expression using RT-qPCR assay; B. Detection of HSP90 protein using Western blot; C. Quantitative analysis of the results from Western blot assay; PRV-YY titer was 10 TCID50 图 5 PRV-YY感染对PK-15细胞中HSP90 mRNA和蛋白表达的影响 Fig. 5 Effects of PRV-YY infection on expressions of HSP90 mRNA and protein in PK-15 cells |
机体细胞在受到某些病毒感染后可以诱导HSPs家族不同成员的表达发生变化，而不同病毒或病毒株感染不同类型的细胞所诱导HSPs家族成员的表达不同，因此，机体对不同类型病毒感染的反应有一定的特异性。叶苓等[16]研究发现，汉坦病毒A9株体外感染非洲绿猴肾上皮细胞Vero-E6后，4 h时HSP70 mRNA增高，且持续至感染后3 d，随后逐渐恢复至正常水平，而HSP27和HSP65的表达未见明显变化；而余璐等[17]用汉坦病毒HV76-118株感染同种细胞后发现，HSP27、HSP70和葡萄糖调节蛋白(Grp94)三种HSP的表达水平在感染后24 h均显著升高。在本研究中，PRV-YY感染后，HSP27、HSP70和HSP90的表达均很快升高，特别是HSP70和HSP90，在病毒黏附结束时表达就极显著上升，HSPs作为一类应激蛋白，在PRV感染初期，这种早期应答反应可能是细胞的一种自我保护机制。
HSPs作为重要的分子伴侣，在帮助其他蛋白质进行正确的折叠、组装及转运时发挥着重要作用，同时也协助异己的或错误折叠蛋白质的清除[18]。在病毒感染过程中，HSPs作为病毒蛋白的伴侣分子参与病毒的复制和装配。Liu等[5]研究PCV2在PK-15细胞的生产需要HSP27的参与，上调HSP27可增加病毒的复制和病毒粒子的产生。当抑制、下调或敲除HSP27时，可显著减少一些病毒的复制，用siRNA沉默HSP27的表达可增强PK-15细胞中猪瘟病毒的复制，而上调HSP27则抑制病毒增殖[19]。PCV2感染后细胞中，用特异性化学抑制剂抑制HSP27的磷酸化或通过RNA干扰下调总HSP27时，均可显著减少病毒的复制[5]；在野生型HSV-1感染过程中，在敲除HSP27细胞中，病毒的复制显著减少[20]。本研究中，在PRV感染细胞的过程中，HSP27感染3 h后达较高水平，随后恢复至正常水平，至48 h后开始下降；感染后至48 h时病毒核酸复制速度非常迅速，这种正常水平的HSP27可能在病毒增殖过程中扮演着分子伴侣的作用利于其快速增殖；在感染后60 h时，病毒核酸含量处于一个较高水平，随后显著下降，而HSP27的表达量在这个阶段也显著下降，HSP27的减少可能是导致PRV复制受到抑制从而使病毒核酸含量下降的原因之一；另外，这可能与宿主细胞的状态也有一定关系。
HSP70在病毒复制中的作用相当广泛，它可抑制某些病毒的复制，而又有助于一些病毒的复制[21-23]，抑制HSP70可严重影响PRRSV的体外复制[21]。在流感病毒复制过程中，HSP70通过阻止RNP复合物的核输出[24]或破坏病毒聚合酶与病毒RNA[25]的结合而抑制流感病毒复制，而Manzoor等[26]发现HSP70对甲型流感病毒聚合酶活性有重要调节作用，在正常水平，HSP70在HEK293T和HeLa细胞中是病毒聚合酶的伴侣。HSP90是多种病毒复制的重要宿主因子，抑制HSP90具有显著的抗病毒作用，目前认为是一种潜在的广谱抗病毒途径。HSP90抑制剂可通过抑制PRRSV RNA的合成而减少病毒产生，这种抑制作用与先天干扰素应答的激活无关，当联合敲除HSP90α[27]和HSP90β两种异构体才会表现出显著的抑制作用。最新研究表明HSP90是口蹄疫病毒衣壳前体加工和衣壳五聚体装配所必需的[28]，参与肺病毒蛋白组装和出核过程等[29]。在本研究中，PRV感染后HSP70和HSP90的表达变化模式类似，在抗病毒感染过程中产生的细胞免疫应答起着主要的防御作用，病毒蛋白可能与多种HSPs之间存在相互作用，在PRV感染初期，选择性地上调细胞中某些HSPs的表达，对细胞具有潜在的保护作用；同时HSPs作为重要宿主因子，在部分病毒的复制过程中有稳定病毒蛋白、协助病毒入核、激活病毒复制活性等作用。本研究已初步明确PRV感染后，HSP27、HSP70和HSP90这三种热休克蛋白的表达模式，现有研究虽已表明抑制这三种HSP对多种病毒的感染均具有重要的调节作用，但在PRV感染中的作用还鲜见报道，其具体作用机制还需进一步研究。
4 结论PRV对PK-15细胞增殖的影响呈时间和浓度相关性，低病毒滴度在感染细胞后72 h内对PK-15细胞的增殖无显著影响，而高滴度感染则极显著抑制其增殖。以10 TCID50处理PK-15细胞不同时间发现，PRV感染早期可显著诱导细胞中HSP27、HSP70和HSP90的表达，这三种HSPs的早期应答可能是机体的一种抗病毒感染机制，同时对病毒的复制也可能起着重要作用。
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