2. 福建农林大学动物科学学院, 福州 350002
, WANG Sa2, MENG Chunchun1, QIU Xusheng1, LIAO Ying1, TAN Lei1, SONG Cuiping1, LIU Weiwei1, SUN Yingjie1
, DING Chan1
2. College of Animal Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
解旋酶(helicases)是一类对所有生物都至关重要的酶，在哺乳动物、细菌、噬菌体和病毒中均存在，主要功能是基因解旋。解旋酶是一种马达蛋白，能够沿着核酸的磷酸二酯酶骨架移动，利用ATP将退火的核酸双链(DNA、RNA、RNA:DNA)分开。大约1%的真核基因编码解旋酶，说明其对真核生物至关重要[1]。人类基因组编码64种RNA解旋酶和31种DNA解旋酶。许多细胞过程(如DNA复制、转录、翻译、重组、DNA修复和核糖体生物合成)均依赖解旋酶[2]。解旋酶可分为七个超家族(super family，SF)，分别命名为超家族1~7。DEAD/H box解旋酶属于SF2家族的成员，是最大的参与各种细胞活动的解旋酶家族[3]。DEAD/H box RNA解旋酶在解旋RNA过程中发挥重要作用，包含DEAD(DDX)和DEAH(DHX)家族，已被鉴定出的DDX有36个成员，DHX有14个成员[4]。
DNA和RNA病毒是两种最重要的细胞外源的核酸刺激物。迄今为止，已有许多DDX/DHX被证实在病毒复制各个阶段发挥调控作用。其中DDX58又被称之为维甲酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid inducible gene 1, RIG-Ⅰ)，是最重要的识别RNA病毒的细胞质受体[5]。DHX58又被称之为人遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)[6]，与RIG-Ⅰ有相同的抑制结构域，能够抑制RIG-Ⅰ介导的先天性免疫[7]。除此之外，DDX3、DDX5、DDX21等也被证明参与病毒复制的各个阶段[8-10]。
DDX21是1993年被发现的一种重要的解旋RNA的DDX，能够解旋细胞内的双链RNA和DNA:RNA[11]。近年来的报道证实DDX21在抗病毒先天性免疫中发挥重要的作用。DDX21被证实通过与DDX1、DHX36结合参与识别双链RNA，与Toll样受体3下游接头分子TRIF结合诱导先天性免疫[12]。DDX21能够抑制流感病毒复制，并且能被流感病毒的非结构蛋白1(NS1)拮抗[13]。在登革热病毒感染细胞后，细胞中的DDX21由细胞核转位至细胞质，发挥调控先天性免疫和病毒复制的作用[10]。
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)对养禽业危害重大，同时能够特异性感染多种肿瘤细胞[14-15]。NDV能够通过多种途径调控宿主先天性免疫，使其能够在禽细胞和肿瘤细胞中高效复制。NDV在复制过程中能产生双链RNA，其双链RNA的解旋对于形成子代病毒至关重要。近年来成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)被证明能够作为一种新型高效的基因编辑工具，对内源基因组DNA序列进行靶向删除、插入或修饰[16]。为了研究DDX21是否能够参与NDV病毒复制，本研究应用CRISPR/Cas9系统对NDV易感的HeLa细胞株进行DDX21敲除，验证其在NDV感染细胞中的作用，为探索NDV如何调控先天性免疫，以促进自身复制以及制备高效疫苗及溶瘤病毒奠定可靠的试验基础。
1 材料与方法 1.1 质粒、菌株、病毒和细胞CRISPR/Cas9质粒pGK1.1为南京吉锐生物有限公司产品。Top10感受态细胞为天根生化科技有限公司产品。Herts/33标准强毒株购自中国兽医药品监察所，由笔者所在实验室保存。HeLa、DF-1细胞购自美国ATCC生物标准品资源中心，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，于5% CO2、37 ℃培养。
1.2 抗体与试剂Anti-DDX21抗体为美国Abcam公司产品，anti-β-actin抗体为美国Sigma公司产品。新城疫病毒抗核蛋白(NP)单克隆抗体由本课题组制备。山羊抗兔/山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP为Jackson公司的产品。DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清FBS、Lipofectamin 2000为美国Thermo公司产品。嘌呤霉素为美国Merck Millipore公司产品。T4 DNA连接酶为美国Promega公司产品。Genloci TNA抽提试剂盒为南京吉锐生物有限公司产品。Western及IP细胞裂解液为碧云天生物公司产品。ECL化学发光试剂为Thermo公司产品。
1.3 sgRNA oligo序列设计及合成参考GenBank中人DDX21基因序列(Gene ID：9188)，通过麻省理工学院的CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu/)在DDX21基因区域中前后共设计6对20 bp左右的oligo DNA。
第一轮靶位点设计：选取DDX21基因转录本的CDS区，找出CDS区所处的第三个外显子进行靶位点设计(第一个外显子靶位点评分太低，第二个外显子太短)，设计3条靶点序列，分别命名为1~3号sgRNA(single guide RNA)。
第二轮靶位点设计：选取DDX21基因转录本的CDS区，找出CDS区所处的第五个外显子进行靶位点设计，再设计3条靶点序列，分别命名为4~6号sgRNA。
靶点设计完后，正向引物添加CACC(G)(若靶序列第一个碱基不是G，则在靶序列前加一个G)，反向引物添加AAAC。靶序列引物设计见表 1，序列均由上海生工生物有限公司合成。
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表 1 DDX21 sgRNA oligo序列 Table 1 The sequences of DDX21 sgRNA oligo |
将合成后的2条单链oligo DNA(10 μmol·L-1)退火形成dsDNA，再利用T4连接酶与线性化后的pGK1.1载体连接，转化Top10感受态细胞。使用上游引物VSP primer(CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG)与下游负链oligo引物进行菌落PCR筛选，阳性克隆PCR产物大小应为100 bp，对筛选到的阳性克隆抽提质粒进一步测序验证。
1.5 电转染靶细胞及单克隆的制备和生长取状态良好的对数生长期HeLa细胞悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95%)。取5×106细胞于15 mL离心管中，1 000 r·min-1离心4 min，弃上清。将细胞沉淀悬浮于210 μL DPBS中，转移至1.5 mL EP管中，加入所需量构建好的敲除质粒5~8 μg(质粒浓度要求1 μg·μL-1以上)，轻轻混匀后电转，电转条件为550 V，脉冲数1。电转24 h后，加入嘌呤霉素(1 μg·mL-1)筛选24 h，得到的pool(混合克隆)细胞进行初步测序验证，对靶点位置及之后序列中出现套峰的细胞进行亚克隆。梯度稀释法稀释细胞至96孔板中，培养一周后观察单克隆生长情况，约两周后将生长良好的单克隆转移至48孔中扩大培养；当细胞长满48孔1/2时，即可取出一部分(102~104)，提取细胞基因组。
1.6 单克隆细胞系genotyping PCR测序鉴定在敲除靶位点附近设计高特异性的引物进行genotyping PCR鉴定，鉴定引物序列见表 2。
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表 2 DDX21 genotyping RCR引物序列 Table 2 The sequences of DDX21 genotyping PCR primer |
收集野生型HeLa细胞和测序正确的单克隆细胞，裂解细胞后进行SDS-PAGE电泳，转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂乳封闭，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加入二抗37 ℃孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显影。
1.8 RNA干扰和病毒感染为了敲减内源性DDX21，将150 pmol DDX21干扰RNA转染至HeLa细胞，干扰RNA序列如下：(5′-AGGCCAGAAGCGGAGUUUCAGUAAA-3′)，48 h后以1个多重感染复数(MOI) NDV感染，病毒吸附1 h后用无血清培养基洗3遍，换1% FBS维持液，24 h后收细胞样品和上清，Western blot检测细胞样品中病毒NP蛋白表达，在DF-1细胞上测定上清液中病毒TCID50。
2 结果 2.1 用于DDX21基因敲除打靶载体的构建为了筛选获得对DDX21打靶效率高的sgRNA，将合成的6个sgRNA寡核苷酸序列退火后与线性质粒pGK1.1载体连接，转化后挑取单菌落，利用上游VSP primer和下游负链Oligo引物进行菌落PCR筛选，阳性克隆PCR正确产物大小为100 bp(图 1A)，与预期大小一致，筛选到的阳性克隆抽提质粒进一步测序验证(图 1B)，证明DDX21基因敲除载体构建成功。
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A. DDX21基因打靶载体PCR鉴定(M. 100 bp DNA ladder H3 RTU)；B. DDX21基因打靶载体测序结果 A. The PCR identification of DDX21 gene targeting vector (M. 100 bp DNA ladder H3 RTU); B. The sequencing results of DDX21 gene targeting vector 图 1 DDX21基因敲除打靶载体鉴定 Fig. 1 Identification of DDX21 gene targeting vector |
将以上鉴定阳性的sgRNA电转HeLa细胞24 h后，嘌呤霉素筛选，得到的pool细胞进行初步测序验证，对靶点位置及之后序列中出现套峰的细胞进行亚克隆，提取细胞基因组进行PCR鉴定。本研究中共进行了3轮电转试验，包括sgRNA-1和sgRNA-2，sgRNA-2和sgRNA-3，sgRNA-4、sgRNA-5和sgRNA-6载体混合电转。根据扩增引物(DDX21-genotyping-1F/R)及理论敲除位点位置，扩增产物约341 bp，扩增产物条带偏小的克隆为疑似阳性克隆，图中72#克隆初步定为疑似阳性克隆(图 2A)。Western blot结果显示，疑似阳性克隆中DDX21表达量显著下降(图 2B)。对72#克隆提取细胞基因组进行genotyping PCR测序鉴定，结果显示：72#克隆的一个亲本缺失157 bp，另一个亲本为野生型(图 2C)。以上结果说明获得一株DDX21杂合子敲除细胞。尽管未完全敲除，但杂合子中DDX21蛋白表达量显著下降，能够进行后续试验。
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A. DDX21敲除细胞克隆株PCR鉴定(M. 100 bp DNA ladder H3 RTU)；B. DDX21敲除细胞克隆株Western blot鉴定; C. DDX21敲除细胞克隆株测序鉴定 A. PCR identification of DDX21 knockout cell clones (M. 100 bp DNA ladder H3 RTU); B. Western blot identification of DDX21 knockout cell clones; C. The sequencing results of DDX21 knockout cell clones 图 2 DDX21敲除细胞克隆株鉴定 Fig. 2 Identification of DDX21 knockout cell clones |
将野生型(WT)HeLa细胞与ddx21+/-细胞计数，以相同MOI数感染NDV，分别在12和24 h后收集细胞样品和上清，Western blot结果显示，感染后24 h，ddx21+/-细胞样品中病毒NP蛋白明显低于WT HeLa细胞(图 3A)，病毒TCID50滴定结果显示：DDX21敲除明显抑制NDV复制(图 3B)。
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A. Western blot检测DDX21敲除对NDV NP表达的影响；B. DDX21敲除对上清中NDV滴度的影响, ***.P < 0.05 A. The effect of DDX21 knockout on NDV NP expression by Western blot analysis; B. The effect of DDX21 knockout on NDV titer in supernatant, ***.P < 0.05 图 3 DDX21基因敲除对NDV复制的影响 Fig. 3 The effect of DDX21 knockout on NDV replication |
为了进一步验证DDX21在NDV复制中的作用，HeLa细胞分别转染对照无序RNA(scramble RNA)和siDDX21，48 h后感染病毒，24 h后收集细胞样品和上清，结果显示：与DDX21敲除结果类似，DDX21干扰明显抑制病毒NP蛋白的表达(图 4A)，上清液中病毒滴度降低(图 4B)。
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A. Western blot检测DDX21干扰对NDV NP表达的影响；B. DDX21干扰对上清中NDV滴度的影响, ***.P < 0.05 A. The effect of DDX21 knockdown on NDV NP expression by Western blot analysis; B. The effect of DDX21 knockdown on NDV titer in supernatant, ***.P < 0.05 图 4 DDX21基因干扰对NDV复制的影响 Fig. 4 The effect of DDX21 knockdown on NDV replication |
CRISPR/Cas9目前已经成为一种最高效的基因编辑手段，比经典的锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)介导的基因编辑技术更简单、高效[17]。本研究用到的pGK1.1包含Cas9核酸酶表达框和gRNA克隆框，并有嘌呤霉素筛选标记，单个载体电转完成基因组DNA精准、低脱靶的基因编辑。
DDX和DHX解旋酶在解旋DNA和RNA过程中发挥重要作用，因此许多DDX在维持细胞基因组稳定过程中发挥重要作用。例如DDX19能够解旋DNA:RNA(R环)，在DNA损伤条件下，能够抑制基因组的不稳定性[18]。SIRT7和DDX21能够协作解旋基因组R环，从而保证基因组的稳定性[19]。另外，DDX21能够作为RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ的转录传感器，促进核糖体RNA的加工和转录[20]。这些结果表明，作为一种重要的RNA解旋酶，DDX21在维持基因组稳定过程中发挥重要作用。本研究中，经过3轮亚克隆，均未获得阳性纯合子，尤其在第三轮筛选中，在测序340 bp目的带时发现测序结果出现明显的套峰现象，说明sgRNA-2和sgRNA-3的敲除效率较高。但后续筛选并未得到一个纯合子克隆，推测原因可能是DDX21与细胞生长和分裂密切相关，敲除的DDX21纯合子在扩培到足够数量前已死亡。迄今为止的DDX21研究中还未有DDX21敲除细胞或小鼠的报道，针对其他DDX的相关研究也证明某些DDX对细胞或小鼠的生长至关重要，无法获得敲除纯合子。DDX24是一种干扰素诱导解旋酶，研究者能够获得正常ddx24+/-杂合子小鼠，但是所有ddx24-/-纯合子小鼠均在胚胎期死亡[21]。另有研究结果表明：ddx5-/-小鼠在胚胎期11.5 d前死亡，ddx17-/-小鼠能够正常出生，但仅能存活2 d[22]。尽管如此，本研究中获得的DDX21敲除杂合子中DDX21的表达量较野生型细胞相比有显著下降，能够作为研究DDX21功能的工具。
DDX21被认为是发挥正调控先天性免疫和抗病毒的分子[10, 12-13]，但是，流感病毒的NS1能够拮抗DDX21的抗病毒作用[13]。本研究中，DDX21的敲除和干扰均显著抑制NDV的复制，说明DDX21发挥促进NDV复制的作用。NDV能够通过多种手段抑制宿主抗病毒先天性免疫和应激反应，本实验室前期研究结果表明：NDV的V蛋白能够降解磷酸化的STAT1，抑制干扰素信号通路[23]。另外，NDV还能够通过调控宿主细胞的应激颗粒，细胞自噬等促进病毒复制[24-25]。因此，为了保证NDV在细胞中的高效复制，其能通过多种策略拮抗甚至是利用宿主的抗病毒反应，为自身复制服务。本研究中，作为一种先天性免疫伴侣分子，DDX21促进NDV复制，说明NDV能够利用DDX21促进病毒复制。由于NDV感染过程中能够产生双链RNA，而DDX21是一种RNA解旋酶，因此推测DDX21可能在NDV双链RNA解旋形成病毒基因组RNA过程中发挥关键作用，具体机制还有待进一步阐明，本研究丰富了NDV拮抗宿主先天性免疫策略，为研究其在细胞中高效复制的机制研究奠定了基础。
4 结论利用CRISPR/Cas9技术构建了DDX21敲除细胞杂合子，鉴定得到的杂合子中DDX21表达量显著降低，并通过基因敲除结合基因干扰试验证实DDX21能够促进NDV复制。
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