羊作为一种重要的经济动物，为人们提供了大量的皮毛以及肉产品。作为羊肉消耗和生产大国，我国的羊肉需求量越来越大，但现有的生产水平与日益增长的需求严重不符，供需差异越来越明显[1-2]。再者，由于人们生活水平的提高，对羊肉的肉质、营养含量等的要求也更高[3]，因此，在保证羊肉质量的同时，提高羊繁殖能力、增加羊肉及毛制品产量能较好的缓解当下供需不足的紧张情况，也有较好的发展前景。
miRNA是一类存在于多种真核生物中调控基因表达的内源性小非编码RNA，长度大约为22个核苷酸，广泛存在于动植物细胞中[4]，具有保守性、时序性和组织特异性。研究表明，miRNA可以靶向不同的mRNA，且每个mRNA也可以被几个miRNA共同调节[5]。miRNA通过与靶mRNA不完全互补抑制其翻译，或者通过完全互补配对使其降解，导致基因沉默[4]，达到调控基因表达的作用。从1993年第一个miRNA lin-4被发现[6]，到2004年let-7被发现[7]，越来越多的miRNA被挖掘并鉴定出来。研究表明，miRNA与乳腺癌[8]、消化系统疾病[9]、胰腺癌[10]等多种疾病相关，更有研究发现其参与脂肪形成[11]、卵巢发育[12]以及神经系统发育[13]等重要过程。miRNA主要参与基因转录后调节，但具体的调节方式和其影响的生物学过程目前尚不明确。卵巢是雌性动物重要的生殖器官，对动物繁殖具有关键性作用。卵母细胞发育到成熟卵泡排卵等一系列复杂的生理活动都受到各个方面的精密调节，因此，本试验利用转录组测序技术和生物信息分析方法对1和8月龄湖羊卵巢组织中的miRNA进行测序鉴定，筛选其中与卵巢发育相关的miRNA及其靶基因参与的生物学过程，为探索miRNA在卵巢发育方面的作用及提高繁殖力提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物和样品制备试验以具有较高繁殖能力的饲养于山东临清润林牧业有限公司的湖羊为研究对象，以湖羊卵巢组织为试验材料，生长条件和饲养条件符合标准，选择健康状况良好，体重相近的1月龄(约17 kg，对照组)和8月龄(约40 kg，试验组)湖羊各3只。将每只羊屠宰后采集两侧卵巢放在冻存管内，迅速放入液氮，然后放入干冰中运回。该过程使用消毒好的器械，使RNA不降解或减少其降解。
1.2 方法 1.2.1 卵巢组织RNA提取和质控进行试验前将样本一直放于液氮或－80 ℃冰箱中低温保存，用于提取RNA。取等量卵巢组织样本，按照厂商使用说明书，利用mirVanaTM RNA提取试剂盒分别提取每个卵巢组织的RNA，在1%琼脂糖凝胶上检测RNA降解和污染情况。使用NanoPhotometer®分光光度计(IMPLEN，CA，USA)检查RNA纯度。用Qubit® RNA Assay Kit测量RNA浓度以及A260 nm/A280 nm，限定范围为1.9~2.1之间。使用Bioanalyzer 2100系统((Agilent Technologies, CA, USA))评估RNA完整性(RNA integrity number)，即RIN≥7，并且28S/18S≥0.7。
1.2.2 卵巢组织cDNA文库构建和RNA测序RNA样本检测合格后，从中分离长度在18~30 nt的小片段RNA。用RNA连接酶将小片段RNA进行3′和5′接头连接，再将连接接头后的小RNA反转录和PCR扩增，反转录产物进行PAGE凝胶电泳纯化，纯化产物即为最终的cDNA文库。本试验共建立6个文库，分别为1月龄湖羊卵巢组织3个文库(H-1-O-1、H-1-O-2、H-1-O-3)和8月龄湖羊卵巢组织3个文库(H-8-O-1、H-8-O-2、H-8-O-3)。文库构建成功后还需进行质量控制，以保证质量，合格后使用Illumina Hiseq 2500上机测序。
1.2.3 卵巢组织small RNA测序数据分析将测序得到的原始数据(raw data)进行质量控制和过滤，先使用软件FASTX_toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)将raw reads进行筛选，具体包括：去除低质量、带有接头污染、无法确定的碱基比例大于10%的reads。将筛选后的数据(clean reads)用软件bowtie[14]定位到参考基因组，分析small RNA在基因组上的表达和分布情况。再用blastn将small RNA与Rfam (version 10.0)数据库[15]比对，筛选和去除同rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA等相关的序列。将筛选后的结果与miRBase[16-17]数据库进行比对，鉴定出已知的miRNA，使用Mirdeep2[18]软件对未知miRNA进行预测。
1.2.4 1和8月龄湖羊卵巢差异miRNA分析及靶基因预测将鉴定的所有miRNA进行表达量计算，再用DESeq[19]软件包筛选两个比较组之间差异表达的miRNA，以|fold change|≥2，P≤0.05为条件进行筛选。利用miRanda[20]和Targetscan两个软件对筛选出的差异表达miRNA进行靶基因预测，取两者结果的交集，使数据更可靠。
1.2.5 1和8月龄湖羊卵巢差异表达miRNA靶基因功能富集分析利用cytoscape中的Clue-GO[21]软件将两比较组差异表达miRNA的靶基因进行GO和KEGG功能注释，GO即基因本体论(gene ontology，http://www.geneontology.org/)，分为生物学过程、细胞组分和分子功能3部分，对基因进行GO分析，统计差异表达miRNA靶基因主要参与的条目信息。KEGG[22](Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一个生物系统数据库，收集了基因组学，化学和系统功能信息，是进行代谢分析和调控网络研究的工具，利用KEGG PATHWAY数据库计算靶基因主要参与的代谢通路和途径，Benjamini-Hochberg法多重检验校正P值得到P-value，以P-value≤0.05进行筛选，综合GO注释和KEGG信息，得到靶基因显著富集的条目。
1.2.6 构建1和8月龄湖羊卵巢差异miRNA-靶基因互作网络图将GO和KEGG注释得到的信息，结合文献报道，选择与卵巢发育相关的条目和通路信息，筛选出与这些条目中涉及到的靶基因具有靶向关系的差异表达miRNA，将miRNA与靶基因利用cytoscape软件[23]做互作网络图，找出网络图中处于节点位置的比较重要的miRNA，在文献中查找这些miRNA具体的功能以及在卵巢发育中的作用。
1.2.7 qRT-PCR验证qRT-PCR可用来验证基因的相对表达水平，随机选择差异表达的miRNA进行验证，采用2-△△Ct法计算miRNA的相对表达量，P < 0.05表示差异显著。与测序结果对比，检验测序结果的可靠性。
2 结果 2.1 1和8月龄湖羊卵巢组织测序数据分析将测序所得数据中质检不合格的reads筛除之后得到total reads，1月龄湖羊卵巢组织total reads数分别为20 220 516、19 032 622、20 867 617，8月龄湖羊卵巢组织total reads数分别为18 851 239、19 788 713、23 467 656。将这些reads在数据库中比对后进行分类注释，得到各种类型sRNA，包含有miRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA、unann(未注释的RNA)和其他RNA。各样品中未注释的sRNA比重最大，除此之外miRNA reads数最多(表 1)。
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表 1 各样本sRNA分类注释结果 Table 1 sRNA classification annotation results for each sample |
将miRNA筛选之后进行已知和未知miRNA检测，结果显示，6个样品中已知miRNA个数分别为2 186、2 091、2 217、2 136、2 176、2 088，新miRNA的个数分别为613、567、668、640、662、450。每组3个生物学重复计算每个miRNA的表达量，以|fold change|≥2，P≤0.05为阈值筛选出两组差异表达miRNA共739个，其中已知miRNA(known)38个，未知miRNA(novel)701个(表 2)。差异表达的未知miRNA也可能参与绵羊两个阶段间卵巢发育的一些调控，为后续发掘与卵巢发育相关的miRNA提供重要线索。
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表 2 差异表达的部分miRNAs Table 2 The partial differentially expressed miRNAs |
对差异表达miRNA进行靶基因预测，已知miRNA相应靶基因的个数共4 706个，对靶基因进行GO和KEGG功能分析来探究这些靶基因的功能作用，结果发现，与卵巢发育相关基因主要为上调miRNA。GO注释结果表明，在生物学过程方面，差异表达靶基因显著富集在ERK1和ERK2级联调节、受精、中心体复制调节、血管内皮生长因子通路过程、p38 MAPK级联调控、促性腺激素释放激素神经元向下丘脑迁移等与卵巢发育相关过程；在分子功能方面，显著富集在NADPH(硫氧化还原酶活性)、钠离子结合、血管内皮生长因子激活受体活性等条目；在细胞组分方面，显著富集在顶端质膜、有丝分裂纺锤体等条目(图 1)。KEGG注释结果表明，差异表达miRNA靶基因显著富集在扩张型心肌病、α-亚麻酸代谢、脂肪消化吸收等通路，还显著富集在PI3K-Akt信号通路、Hippo信号通路、卵巢类固醇生成、AMPK信号通路等与卵巢发育相关的通路中(图 2)。
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图 1 差异表达miRNA靶基因GO富集分析 Fig. 1 GO enrichment analysis of the target genes of differentially expressed miRNAs |
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图 2 差异表达miRNA靶基因KEGG通路富集 Fig. 2 KEGG pathway enrichment analysis of the target genes of differentially expressed miRNAs |
构建与卵巢发育和繁殖相关的差异miRNA和靶基因互作网络，更直观的表现它们的调控关系(图 3)。可以看出，一个miRNA可靶向多个mRNA，一个mRNA也可能受多个miRNA调节[24-25]，处于节点位置的miRNA靶向多个mRNA，可能对卵巢发育具有重要的调控作用。
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箭头表示miRNAs，圆形表示靶基因 The arrows represent miRNAs, the rounds represent target genes 图 3 差异表达上调miRNA-mRNA互作网络图 Fig. 3 The differentially up-regulated expressed miRNA-mRNA network |
随机选择3个差异表达的miRNAs进行qRT-PCR验证，结果如图 4所示，oar-miR-148a、oar-miR-136、oar-miR-10a在8月龄湖羊卵巢中显著下调表达，与测序结果一致，表明测序结果可靠。
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**.P < 0.01;***.P < 0.001 图 4 3个差异miRNAs表达的qRT-PCR验证 Fig. 4 qRT-PCR validation for 3 differentially expressed miRNAs |
研究表明，miRNA参与调控卵巢发育的各个方面，其中挖掘哺乳动物卵巢发育过程中miRNA的作用机制和主要调控机理对于调控性成熟、提高繁殖性能和繁殖能力至关重要。动物基因组中20%~30%的基因受到miRNA的调控[26]，且miRNA参与生物过程的多个方面，影响动物繁殖能力[27-28]，在个体生长发育过程以及疾病诊断及治疗[29-31]中均发挥重要的作用。Tao等[32]通过对小鼠卵巢颗粒细胞进行荧光素酶报告基因测定、过表达、定点突变和染色质免疫沉淀(ChIP)测定，发现p53/miR-27a/NFAT5新途径，并且NFAT5通过激活Wnt信号传导途径调节小鼠颗粒细胞功能。在没有促性腺激素诱导的情况下采集卵母细胞，每个细胞在体外成熟48 h，并评估卵母细胞的成熟度和最佳成熟条件，检测每个卵母细胞中miRNA和mRNA的表达情况，结果表明，某些上调的miRNA影响卵母细胞的成熟[33]。
本研究对1和8月龄湖羊卵巢组织进行差异表达miRNA筛选分析，6个样品中分别鉴定到2 186、2 091、2 217、2 136、2 176、2 088个已知miRNAs，两比较组差异表达未知miRNA(novel)701个，已知(known)miRNA38个，在8月龄湖羊卵巢组织中已知miRNA中32个上调，6个下调，通过qRT-PCR试验对oar-miR-148a、oar-miR-136、oar-miR-10a进行验证，与测序结果一致。
本研究鉴定到的oar-let-7b、oar-miR-29a、oar-miR-134-3p、oar-miR-21[34]等miRNA上调表达。let-7家族是较早发现的参与调控卵巢卵泡发育的miRNA，本研究中，oar-let-7a、oar-let-7b、oar-let-7d均被检测出显著差异表达，其中oar-let-7b预测到多个靶基因。oar-let-7b与维持雌性哺乳动物正常发育有关，通过调节血管生成因子组织抑制剂的表达参与黄体细胞血管生成[35]。本研究中，预测的靶基因显著富集在MAPK信号通路、卵母细胞成熟、PI3K-Akt通路和调节细胞活动周期等通路中(CCNJL、EPHA1、ROS1)。oar-miR-29a参与调节成年动物周期性卵巢的卵泡发育[36]，其靶基因富集在卵母细胞减数分裂、卵泡生长、雌激素受体信号通路、乳腺细胞生长等过程中(CAPSL、CCDC88C、FKBP4)。研究表明，miR-134-3p过表达可以有效抑制人卵巢癌干细胞增殖和侵袭[37]。本研究中，oar-miR-134-3p显著差异表达，靶向调控基因(INHBA、BCAS1)富集在卵巢类固醇生物合成、卵母细胞成熟、代谢过程、雌激素和TGF-β通路中，推断其参与调控卵巢发育过程。此外，鉴定到oar-miR-541-3p、oar-miR-654-3p、oar-miR-1193-5p的靶基因富集在MAPK信号通路、催产素信号通路、卵母细胞成熟、类固醇生成过程，由此推断，差异表达miRNA主要通过以上生物学过程和通路参与调控卵巢细胞周期、分化和增殖。
下调表达miRNA与卵巢发育相关较少，其中下调表达miRNA oar-miR-148a预测到3个潜在的靶基因包括ADAMTS7、IHH、PCSK1，ADAMTS7基因参与调控卵泡发生和排卵的重塑事件以及黄体的形成、维持和消退[38]，IHH(indian hedgehog)蛋白是各种发育过程的重要调节因子，包括生长模式和形态发生，参与Hedgehog信号通路，在刺激卵泡膜细胞增殖和类固醇生成中具有重要作用[39]，IHH缺乏导致卵泡膜层缺失，类固醇生成减弱，卵泡发生停滞[40]。PCSK1参与大量细胞蛋白质前体的翻译后加工，参与妊娠期间卵巢中的前蛋白加工[41]。oar-miR-136潜在靶基因为NRP1，NRP1是一种VEGF受体，可调节VEGF诱导的血管生成，在颗粒细胞中表达，参与卵泡发育[42-43]。研究表明，oar-miR-10a能够抑制卵泡发生过程中的颗粒细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有负调控作用[44]。VWF在2个比较组中差异表达，是oar-miR-10a的预测靶基因，且与卵泡闭锁有关，参与卵巢发育[45]，因此推断，oar-miR-148a、oar-miR-136、oar-miR-10a可能分别靶向以上几个基因达到调控卵巢发育进程的作用。
4 结论本研究分析了1和8月龄湖羊卵巢组织中的miRNA表达情况，鉴定到差异表达的已知miRNA 38个，6个下调，32个上调；并发现了miRNA的靶基因以及可能富集的生物过程，如细胞活动周期、GnRH信号通路、卵母细胞成熟等。oar-miR-148a、oar-miR-136等靶基因富集在与卵巢发育相关的信号通路中，可能参与调控绵羊卵巢发育，为后续研究miRNA对卵巢生长及动物生殖的作用提供理论基础。
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