褪黑激素(melatonin，MT)是一种吲哚类激素，主要由松果体分泌。对一些动物的毛发生长、颜色、周期有一定的调控作用，可以促进水貂、安哥拉兔、绒山羊等的被毛生长，被广泛应用于动物试验和羊绒生产^[1-2]。有研究证明，皮肤也是MT合成、分泌的又一重要场所^[3-5]。付绍印等^[6]研究表明，在绒山羊皮肤持续埋植MT可改变相关miRNAs的表达模式，进而促进羊绒的生长。

let-7是最早被发现的miRNAs之一，具有高度保守性、时序性和组织细胞特异性，通过在转录后水平调节基因的表达来影响细胞的增殖与分化^[7-8]。let-7家族广泛存在于哺乳动物的各种组织中，2007年Zhang等^[9]研究发现，绒山羊皮肤中有高频表达的let-7家族成员；2012年付绍印等^[6]研究发现，let-7家族成员在绒山羊皮肤中不仅具有相对较高的表达水平，在与其它miRNAs比较时，还表现出独特的周期性变化规律。随着对let-7家族的深入研究，越来越多的靶基因逐渐被发现与证实。靶基因与let-7之间的相互作用复杂有趣，其中一个成员可以调控多个靶基因的表达，而一个靶基因的表达也可以受到几个成员的共同调节^[10]。大多数研究趋向于分析let-7家族单个或少数几个成员及其靶基因的调控作用，极少涉及整个let-7家族成员及其靶基因共表达模式的研究。

本试验以6只罕山型白绒山羊为研究对象，随机平均分成2组，一组持续埋植MT，另一组作为对照。在一个皮肤毛囊周期内连续12个月采集皮肤样品，选取11个let-7家族成员(let-7a-3p、let-7a-5p、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-98和miR-3596)。通过qRT-PCR技术检测分析埋植MT对let-7家族成员的表达模式及周期性变化规律的影响。选择绒山羊皮肤毛囊周期的重要节点，即休止末期(4月)与生长早期(6月)的皮肤样品进行转录组测序，预测let-7家族成员的靶基因，分析靶基因与let-7家族成员的表达关系，以期从let-7家族成员及其靶基因在皮肤中的表达来探讨MT介导miRNAs影响羊绒生长的分子机理。

1 材料与方法 1.1 试验材料与样品采集

根据体重、产绒量、绒长、绒细度选择饲养条件相同、生长状态相近的6只内蒙古罕山型白绒山羊周岁母羊，随机平均分为2组，即MT埋植组(n=3)与对照组(n=3)。试验期间，按照2 mg·(kg·BW^-1)^-1的剂量在埋植组绒山羊个体耳后皮下埋植MT，对照组不埋植MT，埋植后次月于肩胛部采集1 cm²大小的皮肤样品，1年内连续12个月采集皮肤样品，液氮快速冷冻带回实验室，于－80 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验引物设计

参照miRBase官网(http://www.mirbase.org/)中山羊、绵羊、牛的成熟let-7家族序列，根据各成员自身序列较短、序列相似度高的特点，利用Primer 5.0设计let-7家族成员的茎环反转录引物、定量引物以及内参5S rRNA的定量引物，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表 1)。

1.3 绒山羊皮肤组织总RNA的提取及反转录

按照天根(北京)生化科技有限责任公司提供的动物组织总RNA提取试剂盒(DP501)说明书提取绒山羊皮肤组织总RNA，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整程度，紫外分光光度计检测其纯度及浓度，合格的总RNA溶液于－80 ℃保存备用；按照TaKaRa反转录试剂盒说明书合成cDNA的第一条链，－20 ℃保存备用。

1.4 绒山羊let-7家族表达量的荧光定量分析

以反转录得到的cDNA为模板，利用ABI MP3005 Real-time PCR系统(ABI，USA)，参考SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(TaKaRa)试剂盒说明进行扩增。所有反应均设置3个重复，采用2^-△△CT方法进行相对定量的统计分析。将一个完整的皮肤毛囊周期按照光照长短平均分为2个时期，即长光照期(3~8月)与短光照期(9~2月)，使用SAS 9.2软件采用CORR过程对2个时期内let-7家族各成员的表达模式进行相关性分析。反应体系：cDNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ10 μL，ddH₂O 7 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，退火温度℃ 30 s，40个循环；65~90 ℃ 30 s连续扫描(0.5 ℃为一个梯度，扫描0.06 s)。

1.5 绒山羊皮肤组织文库构建及转录组数据分析

选取4和6月份共12个皮肤的总RNA样品，参考Truseq RNA Sample Prep Kit v2试剂盒说明书，进行cDNA文库构建。利用Illumina Hiseq 2500测序系统对12个转录组文库完成高通量测序，为确保高质量的生物信息学分析，使用perl脚本对原始reads过滤掉接头序列、低质量(整条reads 50%以上的碱基数的Q值≤10)以及含有N(未知碱基信息)的reads，然后将过滤后的clean reads通过Fast QC做进一步的质量控制。利用tophat软件将clean data比对到山羊参考基因组上，利用cufflinks软件对样本每一个基因的表达量进行归一化处理，计算FPKM值。

1.6 let-7家族成员的靶基因预测与分析

利用RNAhybrid 2.0软件，结合RNA-Seq结果序列，对let-7家族各成员进行靶基因预测，使用在线软件DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)对预测的靶基因进行KEGG富集分析，使用CytoScape 5.0软件绘制网络图。

2 结果 2.1 绒山羊皮肤中let-7家族成员的表达

对照组绒山羊皮肤中let-7家族成员全年平均表达水平依次为let-7b＞let-7i＞miR-3596＞let-7e＞let-7a-3p＞let-7c＞let-7a-5p＞let-7f＞let-7g＞let-7d＞miR-98(表 2)，let-7b、let-7i、miR-3596的全年平均表达水平远高于其他成员；埋植组则为let-7b＞let-7i＞miR-3596＞let-7e＞let-7a-3p＞let-7c＞let-7g＞let-7a-5p＞let-7f＞miR-98＞let-7d，let-7b、let-7i、miR-3596全年平均表达水平远高于其他成员。在一个皮肤毛囊周期内，将2组let-7家族成员的表达模式进行比较与分类：第一类是let-7b、let-7e和let-7a-3p，埋植组表达水平高于对照组；第二类是let-7f、let-7g、let-7c、let-7a-5p、let-7d和miR-98，埋植组表达水平低于对照组；第三类是let-7i和miR-3596，在2组中表达水平的高低区别不明显，但表达趋势发生变化(图 1)。

2.2 绒山羊let-7家族成员的相关性分析

利用SAS软件计算let-7家族各成员表达量在不同光照期的相关系数(表 3、表 4)，使用CytoScape软件筛选相关系数r＞0.8(P < 0.05)的成员关系绘制网络关系图(图 2)。无论光照期长短、埋植MT与否，图 2A~2D中的let-7a-3p和miR-3596两个成员与其他成员相对独立，let-7g、let-7i和miR-98呈“静三角”关系，即任意两成员之间呈正相关(r＞0.87，P < 0.05)，let-7a-5p、let-7b和let-7c呈“动三角”关系，即任意两成员之间呈正相关(r＞0.99，P < 0.05)。在埋植组短光照期内(图 2D)，“动三角”成员与let-7d、let-7e、let-7f共同形成“五角星”关系。

2.3 绒山羊转录组测序与let-7家族成员靶基因预测及富集分析

测序数据经过多重质控后，12个样品共得到64.27 GB的有效数据(样品编号MT-4/MT-6分别为埋植组4、6月份样品，CK-4/CK-6分别为对照组4、6月份样品)。每个样品的平均测序数据量达到了5.36 GB，测序质量及GC含量见表 5，与山羊参考基因组比对结果见表 6，比对成功率为(78.86±1.59)%。基于转录组测序结果，使用RNAhybrid软件预测let-7家族的靶基因，共得到84个靶基因。将所有靶基因使用在线软件DAVID进行KEGG_Pathway功能富集分析，结果显示，靶基因主要富集到转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、催产素(Oxytocin)和核转录因子kappa B(NF-κB)等信号通路(图 3)。

2.4 绒山羊MT对let-7家族及其靶基因表达的影响

使用CytoScape软件绘制let-7家族成员与靶基因的网络关系图(图 4、图 5)，主要对“动三角”和“静三角”分别与富集在重要通路中靶基因的调控关系进行分析。在4月份，MT上调“静三角”(let-7g、let-7i和miR-98)的表达量，下调其富集到VEGF信号通路中的靶基因PTGS2、PLCG1的表达量；下调“动三角”(let-7a-5p、let-7b和let-7c)的表达量，上调其富集到TGF-β信号通路中的靶基因TGIF2、RBL的表达量。在6月份，MT下调“静三角”的表达量，上调其富集到VEGF信号通路中的靶基因PTGS2、PLCG1、SRC的表达量；上调“动三角”的表达量，下调其富集到TGF-β信号通路中的靶基因GDF5、TGIF2、RBL的表达量。以上提示，MT可能通过改变let-7家族重要成员的表达量，进而调节相关靶基因的表达水平，在羊绒生长的关键节点发挥重要作用。

3 讨论

大量研究结果表明，外源埋植MT可以促进绒山羊绒的生长，可以介导相关miRNA的表达参与皮肤毛囊的周期性生长发育过程，let-7家族作为山羊皮肤中高频表达的miRNA，与皮肤毛囊周期性生长发育密切相关^[11-12]，然而关于MT对let-7家族在山羊皮肤中表达的影响尚无详细报道。本研究通过在山羊皮肤外源埋植MT，分析let-7家族成员及其靶基因的表达规律。结果表明，MT可以改变let-7家族成员的表达模式，并进一步影响其靶基因的表达，进而在皮肤毛囊的生长发育过程中发挥重要作用。let-7家族是最早被发现的miRNA之一，广泛参与调控动植物组织的时序性发育。有报道显示，let-7a可以参与毛囊周期性生长^[13]，let-7b可在皮肤伤口愈合的过程中发挥一定作用^[14]，let-7f、let-7g的表达与骨溶解、糖尿病等疾病密切相关^[15-16], let-7c、let-7d和let-7e在卵巢、胰腺和直肠等相关疾病中有报道，可能在肿瘤的发生过程中发挥重要作用^[17-19], let-7i与黄体酮的代谢密切相关, miR-98和miR-3596在胆固醇代谢、奶牛肝功能等重要机体功能中扮演重要角色^[20-22]。刘思齐^[23]发现，在绒山羊初级毛囊中miR-3596的相对表达量最高(miR-3596＞let-7i＞let-7b)，在次级毛囊中miR-3596的相对表达量依然最高(miR-3596＞let-7b＞let-7i)。本试验中，let-7b在绒山羊皮肤中的相对表达量最高，在对照组和埋植组均为let-7b＞let-7i＞miR-3596，这表明miR-3596可能在绒山羊的毛囊中富集表达。

由于MT的分泌有着明显的周期性变化，与绒山羊皮肤毛囊的周期性生长密切相关，而季节性的光照变化可以引起体内MT的周期变化^[24-25]。因此本研究将一个完整的皮肤毛囊周期按照光照长短平均分为两个时期，即长光照期(3~8月)与短光照期(9~2月)。无论光照期长短，无论埋植MT与否，let-7家族中稳定存在“静三角”(let-7g、let-7i、miR-98)关系，和“动三角”(let-7a-5p、let-7b、let-7c)关系，这表明let-7家族的部分成员之间具有相似的表达模式。有研究表明miRNA之间也存在调控作用^[26-27]，提示以上let-7家族成员可能存在协同作用。在埋植组的短光照期，“动三角”与let-7d、let-7e和let-7f之间又构成“五角星”关系，表明该时期可能有更多的成员参与协同网络关系。

本研究结合RNA-Seq结果预测出84个靶基因，对其进行KEGG_Pathway功能富集分析。结果表明，PTGS2、PLCG1、SRC、GDF5、TGIF2和RBL1等靶基因富集在TGF-β和VEGF等与皮肤毛囊周期性生长发育相关的通路中。在经典的皮肤毛囊周期中，4月属于休止期末尾，羊绒停滞生长，开始退化脱落，皮肤毛囊活性降低^[28-29]，此时MT上调了“静三角”的整体表达，下调了VEGF信号通路中“静三角”的靶基因PTGS2和PLCG1的表达，表明MT可能增加了“静三角”对PTGS2和PLCG1的抑制作用；埋植MT下调了“动三角”整体的表达，上调了TGF-β信号通路中“动三角”的靶基因TGIF2和RBL的表达，表明MT可能减小了“动三角”对TGIF2和RBL1的抑制作用。6月属于兴盛前期，皮肤毛囊活性刚刚启动^[28-29]，埋植MT下调了“静三角”整体的表达，上调了VEGF信号通路中“静三角”的靶基因PTGS2、PLCG1和SRC的表达，表明MT可能减小了“静三角”对PTGS2、PLCG1和SRC的抑制作用；埋植MT上调了“动三角”整体的表达，下调了TGF-β信号通路中“动三角”的靶基因GDF5、TGIF2和RBL的表达，表明MT可能增大“动三角”对GDF5、TGIF2和RBL的抑制作用。

4 结论

在埋植MT条件下，罕山型白绒山羊皮肤中let-7家族成员的表达模式发生了变化，但成员之间的网络关系相对稳定。靶基因主要参与TGF-β、VEGF、Oxytocin和NF-κB等羊绒生长相关的重要信号通路，TGIF2、RBL、GDF5、PTGS2、PLCG1和SRC等靶基因的表达随着“动三角”和“静三角”成员表达水平的变化而发生改变。研究结果表明，MT可能通过改变let-7家族重要成员的表达水平，影响相应靶基因的表达，进而在皮肤毛囊的周期性生长过程中发挥重要作用，但具体的分子机理仍需要更加深入的研究。本研究结果为进一步揭示MT介导miRNAs影响羊绒生长的分子机理提供了理论依据。