2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
3. 河南科技大学动物科技学院, 洛阳 471023;
4. 新乡医学院生命科学技术学院, 新乡 453003
2. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3. College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;
4. School of Life Sciences and Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China
毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)具有较强的自我更新和多重分化潜能，可分化为毛囊、表皮、皮脂腺等器官，在哺乳动物的毛发生长和皮肤修复过程中发挥着重要作用[1-2]，同时，HFSCs也成为软骨组织工程中重要的种子细胞，构建具有毛囊等皮肤的组织工程是未来组织工程发展的方向[3]。毛囊控制毛发的生长，毛发自我更新和修复依赖于HFSCs的增殖、分化和迁移，且皮肤组织结构状态和毛囊的性状对羊毛的品质、产量有较大影响[4]。阐明影响HFSCs生物学特性的相关因素及其生长机制，有助于了解羊毛周期性的调控，促进羊毛的生产，在优化畜牧生产上也有较大的应用价值。
白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一种多效性的细胞炎症因子，参与急性炎症反应，也参与包括癌症等多种慢性炎症性疾病的发病机制[5]，在许多肿瘤细胞如前列腺癌、乳腺癌中高表达，并参与肿瘤的增殖、凋亡及迁移等生物学性状的调节[6]，可激活血管内皮细胞诱导产生IL-8、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等[7]。同时，IL-6也是一种主要的免疫调节剂，通过在体液免疫和细胞免疫中调节激活辅助性T细胞、抑制调节性T细胞(Treg)和分化B细胞中发挥积极的作用[8-9]。Huang等[10]利用体外培养方法发现了部分炎性因子，如IL-6可抑制克隆性角质细胞的生长，阻止毛发从生长终期向具有生长活性的生长初期的转变，促进毛乳头早发性衰老并导致毛囊的老化，IL-6对毛发的生长周期有抑制作用，此外，增加IL-6的量可延长静止期，进而抑制HFSCs的活化。Wu等[11]研究证实，毛囊热损伤后，TNF-α、IL-1b和IL-6在内的细胞因子直接参与损伤过程，与其他因子相比，IL-6对修复过程有着重要作用。
关于炎症因子对HFSCs增殖、迁移过程的影响和分子机制尚未明了，这也是目前科研工作的重要课题之一。研究报道，细胞内有多条信号通路可介导IL-6刺激信号，其中与细胞增殖、迁移关系密切的信号通路主要有MAPK/ERK以及P38等相关信号通路[12-13]。本试验着重研究了过表达IL-6对HFSCs增殖和迁移能力的影响，同时也对IL-6调控HFSCs增殖、迁移的分子机制进行初步探究，以期为干细胞组织工程的研究，毛发的移植和受损皮肤修复的临床应用提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料山羊HFSCs由本实验室分离培养；DMEM低糖培养基、优质胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自Gibco公司；1%青链霉素、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂(PMSF)、SDS蛋白上样缓冲液、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H + L)抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体p-ERK1/2、ERK2、p-p38、p38、myc-Tag均购自Cell Signaling Technology；DNA Marker购自上海欣百诺生物科技有限公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；预染蛋白marker购自Bio-Rad公司；MTT购自于Sigma公司；PVDF膜和显色底物液均购自Millipore公司。
1.2 方法 1.2.1 山羊HFSCs分离和培养试验过程主要参照本实验室已发表改进的干细胞分离、培养方法：山羊毛囊干细胞分离培养方法研究[14]。简要过程为：取关中奶山羊耳部皮肤标本0.5 cm×0.5 cm，在净化工作台中用柳叶刀刮去皮肤表面脏物，75%酒精消毒2次，然后用D-Hank′s液冲洗3~5次，每次5 min。消毒的皮肤标本用眼科剪剪成小条，加入2.4 U·mL-1的Dispase酶，4 ℃消化15 h后，用眼科镊拔出毛囊, 在体视显微镜下切取毛囊隆突部，置于5 mL胰酶(0.5 mg·mL-1胰酶+0.2 mg·mL-1 EDTA)中37 ℃消化1.5 h，终止反应, 1 200 r·min-1离心收集细胞接种于100 μg·mL-1的Ⅳ型胶原包被的培养皿中。48 h后首次换液，去除未贴壁的细胞，此后，每2 d换1次培养液，当细胞接近90%融合，0.25%胰蛋白酶(pH 7.4)消化细胞，用新鲜生长培养基重悬细胞。显微镜下观察细胞形态及生长变化，记录细胞增殖和迁移情况。
1.2.2 目的片段的扩增及重组质粒的构建提取山羊HFSCs的总RNA，反转录成为cDNA文库，设计扩增IL-6的引物，上游引物：5′-ATGAACTCCCTCTTCACAAG-3′, 下游引物：5′-CTACTTCATCCGAATAGCT -3′, 克隆获得CDS全长序列并测序验证，扩增条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。将测序正确的IL-6序列和pXJ40-myc空载体均使用BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ进行双酶切，37 ℃连接2 h，将连接产物转化到受体菌DH5α，挑取单克隆抽提质粒酶切鉴定。
1.2.3 IL-6重组载体转染山羊HFSCs用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养的HFSCs接种于6孔板中，24 h后转染。按照空载体组和IL-6载体组2组进行分别转染。转染时将1 μg质粒与0.5 μL转染试剂相混合，用生理盐水稀释至50 μL，静置20 min后加入到单孔中，4 h后换液。
1.2.4 Western blot检测山羊HFSCs中IL-6蛋白表达水平和信号通路关键激酶的磷酸化水平收集转染24 h后的细胞进行Western blot分析，收集转染细胞用预冷PBS各洗3次，加入裂解缓冲液，静置30 min，超声破碎细胞30 s，12 000 r·min-1离心20 min后取上清液。采用BCA法进行蛋白定量，经SDS-PAGE分离将蛋白转移到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗，室温孵育2 h，PBST漂洗5 min，重复3次，加入二抗，室温孵育1 h。再次利用PBST漂洗5 min，并重复3次。将PVDF膜用发光剂ECL显色后曝光，并进行灰度值分析。
1.2.5 MTT检测山羊HFSCs细胞增殖水平将转染的细胞株接种于96孔板中，待细胞贴壁后加入各组培养基，每组7个复孔，分别培养至第1、2、3、4、5、6、7天时加入5 g·L-1 MTT 20 μL，置于恒温箱中孵育4 h，取上清液，加入200 μL二甲基亚砜以溶解细胞形成的结晶，酶标仪检测570 nm波长处吸光度值，并分析各组细胞株增殖情况。
1.2.6 划痕试验检测山羊HFSCs细胞迁移能力HFSCs传代后重悬，用细胞计数仪测量细胞浓度，得到细胞总数，并在2个相同大小的培养皿中分别加入数量相同的细胞。于每个培养皿中各加入2 mL培养液，4 ℃培养。当细胞密度达到100%时，用10 μL枪头进行均匀划线。划线后倒掉培养液，用PBS洗2次，再重新加入DMEM培养基，每隔6 h观察划痕部位愈合情况，并置于显微镜下拍照，24 h后结束观察，整理数据并制图，使用Image J软件分析划痕后0、6、18、24 h划痕处的愈合面积。
1.2.7 统计学分析采用SPSS 17. 0统计软件包(SPSS，美国)进行统计学处理。数据以“均数±标准差”表示，各组间观察指标的比较采用单因素方差分析和最小显著差法，检验水准α值取双侧P＜0.05。
2 结果 2.1 山羊IL-6过表达重组载体的构建使用PCR技术扩增山羊HFSCs中的IL-6基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示，其与预期627 bp大小一致，进行产物回收。将胶回收得到的IL-6片段和pXJ40-myc空载体均使用BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ进行双酶切，22 ℃水浴3 h，产物胶回收后用T4DNA连接酶于16 ℃金属浴过夜连接，连接产物转化到受体菌DH5α，挑取单克隆，抽提质粒，酶切鉴定，通过DNA测序来确定阳性克隆。从图 1可以看出，泳道1空载体组片段大小约为5 000 bp，泳道2载体组出现5 000和627 bp两个条带，泳道3显示IL-6扩增片段约为627 bp，鉴定结果显示重组载体pXJ40-myc-IL-6构建成功。
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M.DNA相对分子质量标准；1. pXJ40-myc空载体；2.重组载体pXJ40-myc-IL-6双酶切；3. IL-6基因PCR扩增产物 M.DNA marker; 1. pXJ40-myc empty vector; 2. Double digestion of recombinant vector pXJ40-myc-IL-6; 3. The PCR product of IL-6 gene 图 1 构建重组表达载体pXJ40-myc-IL-6 Fig. 1 Construction of the pXJ40-myc-IL-6 recombinant vector |
山羊HFSCs转染重组载体24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，转染效率约80%，结果见图 2A。同时收获转染细胞进行Western blot分析，用myc-Tag抗体检测IL-6融合蛋白的表达，以β-actin的表达水平作参照，结果发现，在转染空载体的对照组中，没有检测到融合蛋白IL-6的表达，在转染重组载体的试验组中成功检测到IL-6融合蛋白的高表达(图 2B)。
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A.荧光显微镜观察GFP绿色荧光蛋白的表达：A1.山羊HFSCs转染重组载体后白场照片；A2.毛囊干细胞转染重组载体后395 nm激发照片。B. myc-Tag抗体检测融合蛋白myc-IL-6的表达：Veh.转染空载体；myc-IL-6.转染重组载体pXJ40-myc-IL-6，下同 A. Fluorescence microscopy was used to observe the expression of GFP green fluorescent protein: A1. Photograph of white field after transfection of goat HFSCs into recombinant vector; A2. Photograph of 395 nm excitation after transfection of goat HFSCs into recombinant vector. B. myc-Tag antibody was used to detect the expression of fusion protein myc-IL-6: Veh. Transfected with empty vector; myc-IL-6. Transfected with recombinant vector pXJ40-myc-IL-6, the same as below 图 2 重组IL-6载体转染山羊HFSCs后融合蛋白表达鉴定 Fig. 2 Identification of fusion protein expression after transfection of recombinant IL-6 vector into goat HFSCs |
MTT法检测连续培养7 d HFSCs的增殖活力，发现与空载体组相比，过表达IL-6组山羊HFSCs的增殖活力在第3天时出现抑制效果，增殖活力下降了约23% (P < 0.01)，并持续抑制，在第6和7天时增殖活力下降速度基本趋于稳定，为约13%(P < 0.01)，结果见图 3A，且具有显著统计学意义。Western blot检测转染pXJ40-myc空载体和IL-6重组载体中myc-IL-6的表达，结果显示，第1~3天IL-6蛋白的表达量逐渐增加，第4~7天IL-6蛋白的表达量处于稳定的表达水平，如图 3B所示。结果提示IL-6过表达对山羊HFSCs的增殖活力具有抑制作用。
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A. MTT法检测羊HFSCs转染IL-6重组载体后细胞增殖活力; B. Western blot检测转染IL-6重组载体后IL-6蛋白连续7 d的表达水平；0. myc-Tag抗体检测转染pXJ40-myc空载体后融合蛋白myc-IL-6的表达；1~7. myc-Tag抗体检测转染pXJ40-myc-IL-6重组载体后连续7 d融合蛋白myc-IL-6的表达。**. P < 0.01，下同 A. MTT assay was used to detect the proliferation of goat HFSCs transfected with IL-6 recombinant vector; B. Western blot was used to detect the expression level of IL-6 protein for 7 days after transfecting with IL-6 recombinant vector; 0. myc-Tag antibody was used to detect the expression of myc-IL-6 fusion protein after transfecting with pXJ40-myc empty vector; 1-7. myc-Tag antibody was used to detect the expression of fusion protein myc-IL-6 for 7 days after transfecting with pXJ40-myc-IL-6 recombinant vector. **. P < 0.01, the same as below 图 3 MTT法检测羊HFSCs转染IL-6重组载体后细胞增殖活力 Fig. 3 Detection of the cell proliferation activity of goat HFSCs by MTT assay |
划痕试验后分别统计6、18、24 h山羊HFSCs的划痕部位愈合程度，空载体组划痕部位的愈合率均明显高于过表达IL-6组，结果见图 4A；使用Image J软件对划痕试验后伤口的愈合程度进行统计，24 h时空载体组划痕部位与0 h相比未愈合率为1.5%，愈合率达到约98.5%，已基本愈合；过表达IL-6组划痕部位伤口未愈合率为15.8%，愈合率为84.2%，结果显示，山羊HFSCs过表达IL-6后愈合率显著降低且具有统计学意义(P < 0.01)，如图 4B所示，提示过表达IL-6后对伤口的愈合具有显著的抑制作用。
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A.划痕试验检测HFSCs迁移能力；B. Image J软件计算伤口愈合程度。Veh.转染空载体；myc-IL-6.转染重组载体pXJ40-myc-IL-6 A. The wound healing assay was used to detect the migration ability of HFSCs; B. Image J software was used to calculate wound healing degree 图 4 划痕试验检测HFSCs的迁移能力 Fig. 4 Detection of HFSCs migration by wound healing assay |
为进一步探究过表达IL-6抑制HFSCs迁移的内在可能分子机制，本研究尝试探究介导此现象的相关信号通路。山羊HFSCs成功转染IL-6重组表达载体24 h后，收获细胞，Western blot检测相关信号通路关键激酶的磷酸化水平，结果发现，在IL-6过表达后，MAPK/ERK信号通路中的关键激酶ERK1/2的磷酸化水平(p-ERK1/2)显著下降了76%(P < 0.01)，P38信号通路中的关键激酶p38的磷酸化水平(p-p38)表达量上调了17%(P=0.15)，但差异无统计学意义，结果如图 5所示。结果提示，MAPK/ERK信号通路可能在IL-6抑制山羊HFSCs增殖和迁移过程中发挥了一定的调控作用。
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A.在空载体组和IL-6重组载体组中检测p-ERK1/2和p-p38的磷酸化水平；B. Image J软件计算p-ERK1/2 & p-p38和β-actin的灰度比值 A. The phosphorylation level of p-ERK1/2 & p-p38 in transfected empty vector and recombinant vector pXJ40-myc-IL-6; B. Image J software was used to calculate p-ERK1/2 & p-p38/β-actin ratio 图 5 Western blot检测HFSCs中MAPK/REK和P38信号通路相关蛋白表达水平 Fig. 5 Detection of the expression level of MAPK/REK and P38 signaling pathway-related proteins in HFSCs by Western blot |
HFSCs具有干细胞的一般特性，即具有多向分化潜能等广泛的生物学功能，易获得、易培养，与胚胎干细胞相比，拥有使用时不受伦理学问题限制的优点[15-16]。同时研究显示，毛囊干细胞与神经元细胞具有较好的亲和性，因此，探究细胞增殖、迁移和分化的微环境，使用细胞-支架组合植入，对毛发的移植和受损皮肤修复有临床应用价值，也是再生医学体外技术发展的一个潜在方向[17-18]。而毛囊对于产毛动物(如羊)具有非常重要的作用，因此近年来对HFSCs生物学应用的探索成为了科研热点。
有研究显示，秃顶人群的真皮乳头(dermal papilla)细胞与未秃顶的真皮乳头细胞相比，炎症因子IL-6的表达量上调。分离培养人的毛囊细胞，加入外源性重组IL-6能够增加细胞基质中IL-6受体和gp130的表达量，并对毛囊细胞的增殖有明显的抑制作用[19]。毛囊能够保持周期性的休息(休眠期)、再生(生长期)和退化(退化期)取决于毛囊干细胞的更新能力。在毛发生长初期，凸起的毛囊干细胞被接收到的信号激活真皮乳头，干细胞退出隆起并向下扩散，形成一条小径成为外根鞘[20-21]。HFSC的休眠期受许多内在和外在机制的调节，能够在新的毛发周期中很快被激活分裂[22]。
HFSCs的增殖、迁移对毛发的周期性增长和调控以及更新有重要作用，尽管关于成体干细胞已经有不少报道，但较多集中于对其培养、分离方法等的研究[23-24]，关于调控HFSCs增殖、迁移的作用机制尚不清楚。有研究显示，IL-6可与CD5低亲和力结合，激活STAT3(transcription 3)、MAPKs、丝裂原活化蛋白激酶来调控细胞的行为[25]。Osorio等[26]研究显示，人类胚胎皮肤前体细胞Runx1通过Wnt信号通路调控成人HFSCs的活化和增殖。在本研究中，从羊背部皮肤成功提取、分离并培养了羊HFSCs，通过体外试验发现，过表达IL-6对HFSCs的增殖和迁移具有显著的抑制作用。此外，还尝试探索了HFSCs中MAPK/REK和P38信号通路[27]中关键激酶的活化水平，发现MAPK/REK信号通路中的关键激酶ERK1/2的磷酸化水平显著下调，P38信号通路中的关键激酶p38的磷酸化水平上调，但在统计学上无显著性差异，因此，推测过表达IL-6可能是通过影响MAPK/REK信号通路进而影响HFSCs的增殖和迁移过程。
本试验是通过构建重组IL-6载体，着重研究过表达IL-6对HFSCs增殖和迁移过程的影响，而IL-6是否确实通过MAPK/REK信号通路负调控HFSCs增殖和迁移的，具体分子机制仍有待深入研究，这也将成为本实验室后续研究的重点和方向，对揭示山羊HFSCs的迁移及组织修复机制的研究具有重要意义。
4 结论本研究构建的IL-6重组载体成功转染到羊的HFSCs中，并检测到IL-6蛋白的过表达，发现过表达IL-6对HFSCs的增殖和迁移具有抑制效果，并可能是通过MAPK/REK信号通路发挥负性调控作用。
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